番茄褪綠病毒在湖南省首次發(fā)生.pdf
<p>番茄褪綠病毒在湖南省首次發(fā)生 王雪忠 1，2張戰(zhàn)泓 3鄭立敏 2唐 鑫 2史曉斌 2劉 勇 1，2* （ 1 湖南大學(xué)研究生院隆平分院，湖南長沙 410125； 2 湖南省植物保護(hù)研究所，湖南長沙 410125； 3 湖南省蔬菜研究所，湖南長沙 410125 ） 摘 要：2016年7月在湖南省蔬菜病害調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，4種茄科蔬菜表現(xiàn)出葉脈間褪綠、葉片黃化等癥狀，疑似被番茄褪綠 病毒（Tomato chlorosis virus，ToCV）感染，同時葉片背面聚集了大量煙粉虱。采用ToCV熱激蛋白（heat shock protein 70， HSP70）序列的特異性引物對采集的番茄、茄子、辣椒、馬鈴薯樣品和煙粉虱樣品進(jìn)行RT-PCR檢測，均擴(kuò)增出目標(biāo)條帶， 且擴(kuò)增序列與北京番茄ToCV分離物（KC887999.1）部分序列相似度為99.0%，確認(rèn)采集樣品被ToCV感染。4種茄科蔬菜 ToCV的感染率達(dá)70%100%；發(fā)病葉片上煙粉虱的帶毒率為66.7%87.5%；鑒定出煙粉虱的生物類型為MED煙粉虱。這 是湖南省首次確認(rèn)該病毒，需要引起關(guān)注和加強(qiáng)防范。 關(guān)鍵詞：番茄褪綠病毒；茄科蔬菜；煙粉虱 等6個 科 植 物（Wintermantel & Wisler，2006； Landeo-Ríos et al.，2015），其中對番茄造成的產(chǎn) 量損失最為顯著。ToCV只能通過韌皮部侵染的方 式侵染植物，由媒介昆蟲以半持久的方式傳播， 其媒介昆蟲包括煙粉虱（Bemisia tabaci） 、溫室白 粉虱（Trialeurodes vaporariorum） 、銀葉粉虱（ B. argentifolii）和紋翅粉虱（T. abutilonea），其中以煙 粉虱的傳播能力最為高效（Wintermantel & Wisler， 2006） 。目前國內(nèi)外暫未獲得ToCV的抗性番茄品 種（Orfanidou et al.，2016），又因媒介昆蟲反復(fù)發(fā)生， 雜草清理具有難度，導(dǎo)致ToCV防治存在困難。 2016年7月對湖南省蔬菜研究所基地進(jìn)行病 害調(diào)查發(fā)現(xiàn)，番茄、茄子、辣椒和馬鈴薯的葉片出 現(xiàn)褪綠黃化、葉脈仍然保持綠色等疑似ToCV感染 的癥狀，同時在病葉上發(fā)現(xiàn)了大量的煙粉虱。故分 別采集癥狀明顯的番茄、茄子、辣椒和馬鈴薯葉片 樣品，利用ToCV特異性引物進(jìn)行分子鑒定，并檢 測發(fā)病植株上煙粉虱攜帶ToCV的帶毒率以及煙粉 虱的生物類型。 1 材料與方法 1.1 樣本采集 在湖南省蔬菜研究所基地采集疑似感染ToCV 的番茄、茄子、辣椒和馬鈴薯植株葉片各20份， 王雪忠，女，碩士研究生，專業(yè)方向：植物病毒與昆蟲互作，E-mail： 1401163317qq.com *通訊作者（Corresponding author）：劉勇，研究員，博士生導(dǎo)師，專業(yè)方 向：蔬菜病毒病防治，E-mail：haoasliu163.com 收稿日期：2018-05-09；接受日期：2018-07-11 基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31571981，31571982， 31672003），湖南省科技計劃項(xiàng)目（2016RS2019） 番茄褪綠病毒 （ Tomato chlorosis virus， ToCV）屬于長線形病毒科（Closteroviridae）毛形病 毒屬（Crinivirus） ，于1998年在美國佛羅里達(dá)州首 次發(fā)現(xiàn)（Wisler et al.，1998）。截至目前，ToCV已 在我國臺灣、北京、山東、天津、河北和河南等地 發(fā)生流行，對各地番茄生產(chǎn)造成了嚴(yán)重影響（Tsai et al.，2004；Zhao et al.，2013；劉永光 等，2014； 周濤 等，2014；胡京昂 等，2015；孫國珍 等， 2015） 。ToCV侵染的典型癥狀是植株下部葉片先觀 察到葉脈間黃化褪綠。發(fā)病初期葉片除葉脈仍保持 綠色外，脈間變黃，葉片變厚；發(fā)病中期，整個葉 片由邊緣向內(nèi)開始出現(xiàn)壞死斑；發(fā)病后期，整個植 株死亡，果實(shí)受到嚴(yán)重影響（趙黎明，2015） 。早 期感染ToCV的番茄產(chǎn)量損失可達(dá)到75%，甚至絕 產(chǎn)；中后期感染ToCV仍會對番茄造成10%40% 的產(chǎn)量損失（劉永光 等，2014） 。該病毒的寄主主 要有茄科（Solanaceae）和夾竹桃科（Apocynaceae） 27 新優(yōu)品種 栽培管理 本期視點(diǎn) 產(chǎn)業(yè)市場 病蟲防控 27 研究論文 中 國 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 2018（8）：27 - 31 以健康番茄、茄子、辣椒和馬鈴薯葉片作為陰性對 照；以實(shí)驗(yàn)室ToCV侵染性克隆接種的感病葉片作 為陽性對照。采集基地內(nèi)發(fā)病番茄、茄子、辣椒和 馬鈴薯植株上的煙粉虱，每種植株采集約100頭煙 粉虱成蟲。將樣品置于液氮中速凍，-80 保存?zhèn)溆谩?1.2 試驗(yàn)試劑 TRIzol、氯仿、無水乙醇、ddH 2 O、RNase-free H 2 O、限制性核酸內(nèi)切酶（Ase I 酶）、樹脂溶液（10 mg·mL -1 ）。 1.3 植物總 RNA的提取 樣品總RNA的提取采用北京華越洋生物公司 多酚多糖植物RNA提取試劑盒，步驟依照試劑盒 說明書操作。 1.4 煙粉虱總 RNA的提取 煙粉虱RNA的提取采用TRIzol 法并稍作修 改。研磨棒充分研磨蟲體后加入1 mL TRIzol振 蕩15 s，室溫放置4 min；加入200 L氯仿， 漩渦振蕩30 s，室溫放置3 min；4 下12 000 r·min -1 離心15 min；移取上清液500 L至新 的RNase free離心管中，加入等體積異丙醇，輕 輕顛倒混勻，-20 放置30 min；4 下12 000 r·min -1 離心10 min；棄上清液，用現(xiàn)配的75% 乙醇洗滌沉淀，8 000 r·min -1 離心3 min；重復(fù) 洗滌1次；棄上清液，8 000 r·min -1 離心30 s， 小心吸出上清液；室溫晾干3 min，取30 L RNase-free H 2 O溶解，測定OD 260 /OD 280 值，檢 測RNA的含量和純度，-80 保存?zhèn)溆?。試?yàn)重 復(fù)3次。 1.5 cDNA的合成 以提取的總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的體 系步驟參照Vazyme生物公司Hiscript 1st Strand cDNA Synthesis Kit產(chǎn)品說明書進(jìn)行：在RNase free 離心管中分別加入1 L RNase-free H 2 O，4 L Radom hexamers，3 L 總RNA；65 加熱5 min， 迅速置于冰上驟冷，并在冰上靜置2 min；向上一 步混合液中加入10 L 2×RT Mix，2 L Hiscript Enzyme Mix；混勻后按照25 5 min，50 15 min，85 5 min合成cDNA，-20 保存?zhèn)溆谩?1.6 RT-PCR和電泳檢測 ToCV的檢測采用ToCV特異性引物ToCV-3 （表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為：ddH 2 O 7 L，2×Taq Master Mix（Dye Plus）10 L， ToCV-3R 1 L（10 mol·L -1 ），ToCV-3F 1 L（10 mol·L -1 ），cDNA模板1 L。PCR程序?yàn)椋?5 5 min；95 30 s，56 30 s，72 1 min，35 個循環(huán)；72 延伸10 min，4 保存。PCR產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)上 觀察并記錄結(jié)果，產(chǎn)物純化回收后送生工生物工程 （上海）股份有限公司測序分析。 表 1 引物信息 引物名稱 引物序列（5 -3 ） ToCV-3 F：AAACTGCCTGCATGAAAAGTCTC R：GGTTTGGATTTTGGTACTACATTCAGT WT F：CTTGGTAACTCTTCTGTAGATGTGTGTT R：CCTTCCCGCAGAAGAAATTTTGTTC 1.7 煙粉虱帶毒率的檢測 從每種植株上采集的煙粉虱中隨機(jī)選取8頭， 采用ToCV特異性引物ToCV-3（表1）進(jìn)行ToCV 檢測，每種植株3次重復(fù)，統(tǒng)計煙粉虱的帶毒率。 煙粉虱帶毒率 = 攜帶ToCV的煙粉虱數(shù)目/ 檢測煙粉 虱數(shù)目×100% 1.8 煙粉虱生物類型的鑒定 煙粉虱總DNA的提?。喝? L蛋白酶K于 封口膜上，將每只煙粉虱置于其中研磨成勻漿后移 至PCR管中，加入20 L 10 mg·mL -1 的樹脂溶液 混勻，然后置于37 孵育1 h，96 10 min。 PCR擴(kuò)增體系為20 L：2×Taq Master Mix 10 L，上、下游引物WT（表1）各1 L（10 mol·L -1 ），模板1 L，ddH 2 O 7 L。PCR程序： 95 預(yù)變性5 min；95 15 s，53 45 s，72 1 min，35個循環(huán)；72 10 min，PCR產(chǎn)物取5 L 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。 酶切體系：加入Ase I 0.5 L，3.1×buffer 2 L，ddH 2 O 7.5 L，與10 L擴(kuò)增產(chǎn)物混勻后置 于37 34 h，酶切后取5 L產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖 凝膠電泳檢測。 從每種植株上采集的煙粉虱中隨機(jī)選取20頭 進(jìn)行檢測，試驗(yàn)重復(fù)3次。 2 結(jié)果與分析 2.1 茄科蔬菜田間感染 ToCV的癥狀 與健康植株相比，田間番茄、茄子、辣椒、 28 新優(yōu)品種 栽培管理 本期視點(diǎn) 產(chǎn)業(yè)市場 病蟲防控 28 研究論文 中 國 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 馬鈴薯病株的葉片表現(xiàn)出底部葉片黃化，葉脈濃 綠而脈間褪綠黃化，葉片變脆且易折。感病嚴(yán)重 的植株整株褪綠黃化、果實(shí)不能正常膨大，顏色 偏白；葉片脈間褪綠黃化，變厚、變脆且易折 （圖1）。 2.2 茄科蔬菜 ToCV的發(fā)生率 對4種茄科蔬菜上疑似感染ToCV的樣品進(jìn) 行RT-PCR檢測，擴(kuò)增出條帶大小為449 bp的特 異性條帶，與目標(biāo)條帶一致（圖2） 。對目標(biāo)條帶 純化回收測序后在NCBI上進(jìn)行比對，結(jié)果顯示與 北京番茄ToCV分離物（KC887999.1）部分序列相 似度達(dá)到99.0，表明所擴(kuò)增到的基因片段屬于 ToCV的基因序列，確認(rèn)此次采集的樣品被ToCV 感染。檢出率結(jié)果顯示，番茄樣品的ToCV感染率 為100%，茄子、辣椒和馬鈴薯樣品的感染率分別 為80%、85% 和70%（圖2）。 2.3 煙粉虱體內(nèi) ToCV的帶毒率檢測 收集病葉上的煙粉虱，并進(jìn)行ToCV的RT- PCR檢測，PCR擴(kuò)增得到條帶大小為446 bp的特 異性條帶，與目標(biāo)片段大小一致（圖3） 。從采集 的煙粉虱中，每種植株隨機(jī)選取8頭進(jìn)行ToCV帶 毒率檢測（表2） ，番茄上煙粉虱ToCV的平均感染 率最高，為87.5%，其次為茄子和馬鈴薯，辣椒上 煙粉虱ToCV的平均感染率最低。 圖 1 4種茄科作物感染 ToCV的癥狀 A，感病番茄；B，感病辣椒；C，感病馬鈴薯；D，感病茄子；E，健康番茄；F，健康辣椒；G，健康馬鈴薯；H，健康茄子。彩色圖版見中 國蔬菜網(wǎng)站：www.cnveg.org。 圖 2 4種茄科蔬菜 ToCV PCR檢測結(jié)果 M，DNA marker；120，樣品；A，番茄；B，茄子；C，馬鈴薯； D，辣椒；CK，陰性對照；P，陽性對照。 2.4 煙粉虱生物類型鑒定 對4種茄科蔬菜上采集的煙粉虱進(jìn)行生物種群 鑒定，提取單頭煙粉虱總DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增， A B C D E F G H 圖 3 煙粉虱體內(nèi) ToCV PCR檢測結(jié)果 M，DNA marker；12，番茄上煙粉虱樣品；34，茄子上煙 粉虱樣品；56，辣椒上煙粉虱樣品；79，馬鈴薯上煙粉虱樣品； CK，陰性對照；P，陽性對照。 100 bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 CK P 5 000 bp 3 000 bp 2 000 bp 1 000 bp 750 bp 500 bp 250 bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314151617181920CK P 500 bp 500 bp 500 bp 500 bp A B C D 29 新優(yōu)品種 栽培管理 本期視點(diǎn) 產(chǎn)業(yè)市場 病蟲防控 29 研究論文 中 國 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 產(chǎn)物經(jīng) Ase I消化酶切電泳（圖4） ，結(jié)果顯示該基 地?zé)煼凼鶠镸ED煙粉虱（Q煙粉虱）。 3 結(jié)論與討論 本試驗(yàn)采集了湖南省蔬菜研究所基地4種茄科 蔬菜植株葉片，利用RT-PCR方法檢測疑似發(fā)病植 株葉片感染ToCV的情況，經(jīng)序列分析比對，確認(rèn) 了ToCV已經(jīng)侵染湖南省的茄科作物，證實(shí)該病毒 已經(jīng)在湖南省發(fā)生。近年來，ToCV對我國以番茄 為主的蔬菜產(chǎn)量和品質(zhì)造成了重大損失，目前針對 ToCV的研究工作主要在其分布、田間診斷和優(yōu)化 檢測技術(shù)、致病機(jī)理、病蟲互作等方面展開。 2004年Tsai等（2004）在我國臺灣首次發(fā)現(xiàn) ToCV，隨后Zhao等（2013）報道了ToCV在北京 的發(fā)生，劉永光等（2014）發(fā)現(xiàn)ToCV在山東暴發(fā)， 目前ToCV已在天津（高利利 等，2015）、河北（孫 國珍 等，2015）、河南（胡京昂 等，2015）、山 西、陜西、浙江、內(nèi)蒙古（鄭慧新 等，2016） 、吉 林、遼寧（王翠琳 等，2017） 、廣東（湯亞飛 等， 2017）、海南（Tang et al.，2017）、云南（劉微 等， 2018）等地相繼被發(fā)現(xiàn)。近年來國際貿(mào)易的頻繁交 流，工廠化苗木調(diào)運(yùn)可能使感染ToCV的植株進(jìn)入 我國，加之煙粉虱在我國擴(kuò)散流行，這些原因使得 ToCV在我國自沿海向內(nèi)陸迅速蔓延。湖南省周邊 省市中目前只有廣東省已經(jīng)報道了ToCV的發(fā)生， 由于湖南省蔬菜種植種類眾多，苗木調(diào)運(yùn)繁雜，這 些原因都使得調(diào)查ToCV病毒最初來源的工作巨大 且復(fù)雜，因此需要進(jìn)一步分離純化和鑒定分離物的 病毒株系，對比確認(rèn)其株系來源，從而精準(zhǔn)地對 ToCV進(jìn)行防控，同時應(yīng)通過加強(qiáng)對煙粉虱的檢疫 檢驗(yàn)，減少人為因素造成煙粉虱的傳播。 在我國ToCV主要依靠煙粉虱進(jìn)行傳播。2003 年首次在云南省一品紅（Euphorbia pulcherrima） 上發(fā)現(xiàn)MED煙粉虱以來（Chu et al.，2006），MED 煙粉虱現(xiàn)已遍布全國。目前的研究顯示，與其他煙 粉虱相比，MED煙粉虱具有分布廣泛、擴(kuò)散能力 強(qiáng)、繁殖率高、抗藥性強(qiáng)且廣的特點(diǎn)。同時，在我 國的大多數(shù)農(nóng)業(yè)系統(tǒng)中，MED煙粉虱已經(jīng)快速取 代MEAM1煙粉虱（Chu et al.，2010；Xi，2010； Xin et al.，2016）。已有研究表明，MED煙粉虱比 MEAM1煙粉虱傳播ToCV的能力更強(qiáng)（Shi et al.， 2017） 。因此，應(yīng)正確識別煙粉虱的生物類型，從 而采取正確措施對煙粉虱進(jìn)行防治，以達(dá)到治蟲防 病的目的。本試驗(yàn)中煙粉虱ToCV的帶毒率較高， 但由于本試驗(yàn)采集的樣本數(shù)量較少，后期應(yīng)擴(kuò)大煙 粉虱采集數(shù)量，加強(qiáng)對煙粉虱攜帶ToCV的監(jiān)測。 目前ToCV的防治仍以預(yù)防為主，可以通過選 用無病蟲害的幼苗、培育ToCV抗性新品種、田間 設(shè)置防蟲網(wǎng)、懸掛粘蟲板、合理換茬，達(dá)到早預(yù)防、 早控制的效果。目前ToCV的發(fā)生和流行情況日趨 嚴(yán)重，本試驗(yàn)首次報道ToCV在湖南省的發(fā)生，表 明ToCV有從沿海向內(nèi)陸擴(kuò)散的趨勢，因此必須提 高警惕防止ToCV的進(jìn)一步蔓延，同時要加強(qiáng)對煙 粉虱-ToCV-植物互作的研究，為ToCV的防治和 治理奠定理論基礎(chǔ)。 參考文獻(xiàn) 高利利，孫國珍，王勇，高葦，張春祥，張安勝，竺曉平2015 天津地區(qū)番茄褪綠病毒的分子檢測和鑒定華北農(nóng)學(xué)報，30 （3）：211-215 胡京昂，萬秀娟，李自娟，黃文，李武高，應(yīng)芳卿2015河南番 茄褪綠病毒的分子鑒定中國蔬菜，（12）：25-28 劉微，史曉斌，唐鑫，張宇，張德詠，周序國，劉勇2018云南 番茄褪綠病毒和番茄黃化曲葉病毒復(fù)合侵染的分子鑒定 園 藝學(xué)報，45（3）：552-560 劉永光，魏家鵬，喬寧，李美芹，劉曉明，竺曉平2014番茄褪 綠病毒在山東暴發(fā)及其防治措施中國蔬菜，（5）：67-69 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The symptoms were suspected as Tomato chlorosis virus（ToCV）and a large number of Bemisia tabaci were found on the back of leaves. The infected leaves of tomato，pepper，eggplant and potato and Bemisia tabaci samples were detected by RT-PCR using gene specific primers of ToCV heat shock protein 70 （HSP70）sequence，and an expected fragment were obtained. The results of sequence analysis revealed that the fragment shared the highest nucleotide identity at 99.0% with the isolates from Beijing（KC887999.1）. The infection rate of ToCV of these 4 kinds of Solanaceae vegetables was 70%-100%. Viruliferous rate of Bemisia tabaci was 66.7%-87.5%. The whitefly biotype was MED. This is the first time that Hunan Province confirms the existing of ToCV，which needs special attention and stronger prevention. Key words：Tomato chlorosis virus；Solanaceae vegetable crops； Bemisia tabaci Pan H，Chu D，Ge D，Wang S，Wu Q，Xie W，Jiao X，Liu B，Yang X，Yang N，Su Q，Xu B，Zhang Y2011Further spread of and domination by Bemisia tabaci（Hemiptera：Aleyrodidae）biotype Q on field crops in ChinaJournal of Economic Entomology，104 （3）：978-985 Garcíacano E，Navascastillo J，Moriones E，F(xiàn)ernándezmuñoz R2010 Resistance to Tomato chlorosis virus in wild tomato species that impair virus accumulation and disease symptom expressionPlant Disease，100（6）：582-592 31 新優(yōu)品種 栽培管理 本期視點(diǎn) 產(chǎn)業(yè)市場 病蟲防控 31 研究論文 中 國 蔬 菜 CHINA VEGETABLES</p>
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