南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 學(xué) 報 2020 43 6 1097 1106 JournalofNanjingAgriculturalUniversity DOI 10 7685 jnau 202001038 收 稿 日 期 2020 01 17 基 金 項(xiàng) 目 國 家 公 益 性 行 業(yè) 農(nóng) 業(yè) 科 研 專 項(xiàng) 201503110 國 家 自 然 科 學(xué) 基 金 項(xiàng) 目 31972506 江 蘇 省 重 點(diǎn) 研 發(fā) 計 劃 現(xiàn) 代 農(nóng) 業(yè) 項(xiàng) 目 BE2018338 江 蘇 省 農(nóng) 業(yè) 科 技 自 主 創(chuàng) 新 資 金 CX 18 3095 作 者 簡 介 任 勝 林 碩 士 研 究 生 通 信 作 者 黃 啟 為 教 授 研 究 方 向 為 農(nóng) 業(yè) 廢 棄 物 資 源 化 與 生 物 有 機(jī) 肥 E mail qwhuang 任勝林 梅慧 玲 李 映萱 等 百 合 枯 萎 病 病 原 菌 的 分 離 鑒 定 及 其 接 種 濃 度 對 發(fā) 病 程 度 的 影 響 J 南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 學(xué) 報 2020 43 6 1097 1106 RENShenglin MEIHuiling LIYingxuan etal IsolationandidentificationofLilyFusariumwiltpathogenandtheeffectofsporesuspensionconcentra tionontheextentofdisease J JournalofNanjingAgriculturalUniversity 2020 43 6 1097 1106 百 合 枯 萎 病 病 原 菌 的 分 離 鑒 定 及 其 接 種 濃 度 對 發(fā) 病 程 度 的 影 響 任 勝 林 梅 慧 玲 李 映 萱 杜 彭 濤 文 濤 喬 亦 鑄 張 赫 麥 遠(yuǎn) 愉 董 銀 霜 李 靜 黃 啟 為 南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 資 源 與 環(huán) 境 科 學(xué) 學(xué) 院 江 蘇 省 固 體 有 機(jī) 廢 棄 物 資 源 化 高 技 術(shù) 研 究 重 點(diǎn) 實(shí) 驗(yàn) 室 江 蘇 省 有 機(jī) 固 體 廢 棄 物 資 源 化 協(xié) 同 創(chuàng) 新 中 心 國 家 有 機(jī) 類 肥 料 工 程 技 術(shù) 研 究 中 心 江 蘇 南 京210095 摘 要 目 的 江 蘇 宜 興 是 我 國 百 合 生 產(chǎn) 的 傳 統(tǒng) 優(yōu) 勢 產(chǎn) 區(qū) 百 合 枯 萎 病 是 嚴(yán) 重 阻 礙 百 合 產(chǎn) 業(yè) 化 健 康 發(fā) 展 的 一 個 關(guān) 鍵 因 子 通 過 分 離 鑒 定 百 合 枯 萎 病 的 致 病 菌 株 接 種 不 同 濃 度 的 病 原 菌 孢 子 懸 液 研 究 百 合 的 發(fā) 病 程 度 為 江 蘇 宜 興 百 合 枯 萎 病 的 生 物 防 治 提 供 科 學(xué) 基 礎(chǔ) 方 法 采 集 宜 興 百 合 種 植 區(qū) 典 型 枯 萎 病 發(fā) 病 嚴(yán) 重 的 植 株 及 鱗 莖 分 離 致 病 菌 株 通 過 柯 赫 氏 法 則 回 接 試 驗(yàn) 初 步 確 定 致 病 性 對 致 病 性 強(qiáng) 的 菌 株 進(jìn) 行DNA 提 取 PCR 擴(kuò) 增 和 測 序 基 于 病 原 菌rDNA ITS 基 因 序 列 和GenBank 中 已 有 相 關(guān) 尖 孢 鐮 刀 菌 序 列 應(yīng) 用MEGA7 0 軟 件 構(gòu) 建 系 統(tǒng) 發(fā) 育 樹 采 用 刺 傷 百 合 鱗 片 接 種 不 同 濃 度 的 病 原 菌 孢 子 懸 液 與 在 土 壤 中 接 種 不 同 濃 度 病 原 菌 孢 子 懸 液 的 方 法 評 估 不 同 濃 度 孢 子 懸 液 對 百 合 枯 萎 病 發(fā) 病 程 度 的 影 響 結(jié) 果 從 典 型 枯 萎 病 嚴(yán) 重 發(fā) 病 的 植 株 上 共 分 離 得 到4 株 病 原 菌 株 P OF P PF P RF 和P BF 分 離 率 分 別 為25 20 10 和5 柯 赫 氏 法 則 回 接 試 驗(yàn) 表 明 接 種 菌 株P(guān) OF P PF 百 合 發(fā) 病 率 為100 鱗 片 病 情 指 數(shù) 分 別 為92 50 48 25 15 00 30 00 盆 栽 試 驗(yàn) 表 明 接 種 菌 株P(guān) OF 的 百 合 植 株 最 先 發(fā) 病 初 步 確 定 菌 株P(guān) OF 的 致 病 性 最 強(qiáng) 通 過 形 態(tài) 學(xué) 和 分 子 生 物 學(xué) 對 菌 株P(guān) OF 的 鑒 定 結(jié) 果 表 明 從 典 型 枯 萎 病 嚴(yán) 重 發(fā) 病 百 合 植 株 中 所 分 離 的 病 原 菌 為 尖 孢 鐮 刀 菌 Fusariumoxysporum 百 合 枯 萎 病 的 病 情 指 數(shù) 與 接 種 病 原 菌 孢 子 懸 液 濃 度 相 關(guān) 百 合 鱗 片 接 種 試 驗(yàn) 和 盆 栽 試 驗(yàn) 結(jié) 果 表 明 土 壤 病 原 菌 濃 度 為10 3 CFU g 1 是 導(dǎo) 致 百 合 植 株 發(fā) 病 的 臨 界 濃 度 當(dāng) 土 壤 病 原 菌 濃 度 低 于10 5 CFU g 1 時 病 情 指 數(shù) 隨 接 種 濃 度 增 加 而 增 加 當(dāng) 土 壤 病 原 菌 濃 度 高 于 10 5 CFU g 1 時 病 情 指 數(shù) 不 再 顯 著 增 加 結(jié) 論 從 江 蘇 宜 興 百 合 枯 萎 病 的 典 型 發(fā) 病 植 株 中 分 離 到4 株 病 原 菌 株 其 中 菌 株 P OF 的 致 病 性 最 強(qiáng) 經(jīng) 鑒 定 為 尖 孢 鐮 刀 菌 百 合 專 化 型 Fusariumoxysporumsp f lilii 導(dǎo) 致 百 合 植 株 發(fā) 病 的 臨 界 土 壤 病 原 菌 濃 度 為10 3 CFU g 1 關(guān) 鍵 詞 百 合 枯 萎 病 病 原 菌 分 離 孢 子 懸 液 濃 度 病 情 指 數(shù) 發(fā) 病 率 中 圖 分 類 號 S432 4 文 獻(xiàn) 標(biāo) 志 碼 A 文 章 編 號 1000 2030 2020 06 1097 10 Isolationandidentificationoflily F u s a r i u mwiltpathogenandthe effectofsporesuspensionconcentrationontheextentofdisease RENShenglin MEIHuiling LIYingxuan DUPengtao WENTao QIAOYizhu ZHANGHe MAIYuanyu DONGYinshuang LIJing HUANGQiwei CollegeofResourcesandEnvironmentalSciences JiangsuProvincialKeyLaboratoryforOrganicSolidWasteUtilization JiangsuCollaborativeInnovationCenterforSolidOrganicWasteResourceUtilization NationalEngineeringResearch CenterforOrganic BasedFertilizers NanjingAgriculturalUniversity Nanjing210095 China Abstract Objectives Lily Liliumspp isoneofthedominanttraditionalproductionareasinYixingCity JiangsuProvince China Fusariumwiltisakeystuntingfactorforthehealthydevelopmentoflilyproduction Theisolationandidentificationofthepathogenic strainsoflilyFusariumwiltinYixingCity inoculationofsporesuspensionsofpathogensofdifferentconcentrationsandtherelationship betweenoccurrencedegreeandtheconcentrationofsporesuspensionsofpathogenswerecarriedoutforprovidingscientificbasisin biologicalcontroltechnologyoflilyFusariumwiltinYixing Methods Thepathogenicstrainswereisolatedfromtheplantswithsevere blightdiseaseandbulbsinthelilyfieldofYixing ThepathogenicitywaspreliminarilydeterminedbytheKoch srulebackhaulexperi ment ThehighlypathogenicstrainsweresubjectedtoDNAextraction PCRamplificationandsequencing Thephylogeneticdendrogram南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 學(xué) 報 第43 卷 wasconstructedbasedontherDNA ITSgenesequenceofthepathogensandtherelatedFusariumoxysporumsequenceinGenBankby usingMEGA7 0software TheincidenceoflilyFusariumwiltwasevaluatedbyinoculatingexperimentsbothininoculatingpathogen sporesuspensiontothesoilandinwoundedinoculatingpathogensporesuspensionontheplants Results Atotalof4pathogenic strainsofP OF P PF P RFandP BFwereisolatedfromseverelyblightedplants withisolationratesof25 20 10 and5 respectively Theback to backexperimentsofthelawshowedthattheincidenceofP OFandP PFwas100 andthescaleindexwas 92 50 48 25 15 00and30 00 respectively TheresultsofpotexperimentshowedthatthetreatmentoflilyplantsinoculatedwithP OF wasthefirsttodevelopthedisease ThishintedthatthepathogenicityofP OFmightbethestrongest TheidentificationofP OFby morphologyandmolecularbiologyshowedthatthepathogenisolatedfromlilyplantswithseverewiltwasFusariumoxysporum The resultsoflilyscaleinoculationandpotexperimentshowedthattheconcentrationofsoilpathogenat10 3 CFU g 1 wasthecritical concentrationoflilyFusariumwilt Thediseaseindexincreasedwithincreasinginoculationconcentrationwithin10 5 CFU g 1 andno longerincreasedsignificantlyifthepathogenconcentrationinsoilwashigherthan10 5 CFU g 1 ThediseaseindexoflilyFusariumwilt wasrelatedto the concentration of spore suspension of inoculated pathogens Conclusions Four pathogenic strains identified as FusariumoxysporumwereisolatedfromFusariumwiltplantsinYixinglilyfield TheP OFwasthemostpathogenicstrain identifiedas Fusariumoxysporumsp f lilii Thecriticalconcentrationofsoilpathogenwas10 3 CFU g 1 Keywords lily Fusariumwilt pathogenisolation sporesuspensionconcentration diseaseindex incidenceofadisease 百 合 lily 是 單 子 葉 植 物 亞 綱 百 合 科 Liliaceae 百 合 屬 Liliumspp 多 年 生 草 本 植 物 1 全 國 各 地 均 有 種 植 主 產(chǎn) 于 湖 南 四 川 河 南 江 蘇 浙 江 江 蘇 宜 興 就 是 我 國 百 合 生 產(chǎn) 的 傳 統(tǒng) 優(yōu) 勢 產(chǎn) 區(qū) 2 百 合 是 具 有 藥 用 食 用 觀 賞 價 值 的 植 物 3 目 前 正 在 向 規(guī) 模 化 產(chǎn) 業(yè) 化 和 多 用 高 效 化 的 方 向 發(fā) 展 在 百 合 產(chǎn) 業(yè) 的 發(fā) 展 過 程 中 土 傳 病 害 引 起 的 連 作 障 礙 是 影 響 百 合 產(chǎn) 量 和 品 質(zhì) 的 關(guān) 鍵 技 術(shù) 問 題 而 百 合 枯 萎 病 是 連 作 障 礙 引 起 的 最 重 要 病 害 可 造 成 不 同 程 度 的 產(chǎn) 量 和 質(zhì) 量 損 失 4 百 合 枯 萎 病 也 稱 為 百 合 莖 腐 病 根 腐 病 是 一 種 由 土 傳 真 菌 引 發(fā) 的 一 類 嚴(yán) 重 土 傳 病 害 百 合 枯 萎 病 的 病 原 菌 主 要 為 尖 孢 鐮 刀 菌 百 合 專 化 型 Fusariumoxysporumsp f lilii 還 有 茄 腐 皮 鐮 刀 菌 Fusarium solani 和 串 珠 鐮 刀 菌 Fusariummoniliform 5 其 中 由 尖 孢 鐮 刀 菌 引 起 的 百 合 枯 萎 病 是 最 嚴(yán) 重 的 病 害 病 原 菌 主 要 從 百 合 肉 質(zhì) 根 或 鱗 莖 盤 基 部 的 傷 口 侵 入 然 后 鱗 莖 從 基 盤 處 腐 爛 和 剝 落 被 病 原 菌 侵 染 的 植 株 生 長 緩 慢 不 能 向 上 運(yùn) 輸 養(yǎng) 分 同 時 葉 子 從 基 盤 處 逐 漸 變 黃 和 脫 落 造 成 肉 質(zhì) 根 和 鱗 莖 盤 基 變 褐 腐 爛 6 8 在 貯 存 和 運(yùn) 輸 過 程 中 鐮 刀 菌 還 會 持 續(xù) 影 響 百 合 植 株 致 使 大 量 鱗 莖 發(fā) 生 腐 爛 壞 死 9 枯 萎 病 是 百 合 病 害 中 最 嚴(yán) 重 造 成 經(jīng) 濟(jì) 損 失 最 大 的 病 害 之 一 準(zhǔn) 確 快 速 地 鑒 定 百 合 枯 萎 病 病 原 菌 對 于 進(jìn) 一 步 明 確 該 病 的 發(fā) 病 機(jī) 制 研 發(fā) 百 合 枯 萎 病 的 防 控 技 術(shù) 促 進(jìn) 百 合 產(chǎn) 業(yè) 的 健 康 發(fā) 展 都 具 有 重 要 意 義 百 合 枯 萎 病 的 發(fā) 生 與 諸 多 因 素 相 關(guān) 例 如 百 合 品 種 的 抗 性 百 合 生 長 時 期 環(huán) 境 條 件 濕 度 和 溫 度 等 以 及 土 壤 中 病 原 菌 的 狀 態(tài) 等 10 外 界 環(huán) 境 條 件 相 對 穩(wěn) 定 時 作 物 土 壤 病 害 的 發(fā) 病 率 以 及 發(fā) 病 程 度 與 土 壤 中 病 原 菌 數(shù) 量 呈 正 相 關(guān) 關(guān) 系 9 11 然 而 在 相 對 穩(wěn) 定 的 環(huán) 境 中 百 合 枯 萎 病 病 原 菌 接 種 濃 度 對 百 合 發(fā) 病 程 度 的 影 響 還 鮮 有 報 道 本 研 究 對 江 蘇 宜 興 百 合 枯 萎 病 病 原 菌 進(jìn) 行 分 離 及 鑒 定 研 究 百 合 枯 萎 病 病 原 菌 數(shù) 量 與 百 合 發(fā) 病 的 關(guān) 系 旨 在 為 江 蘇 宜 興 百 合 枯 萎 病 的 生 物 防 治 提 供 科 學(xué) 依 據(jù) 1 材 料 與 方 法 1 1 試 驗(yàn) 材 料 1 1 1 供 試 百 合 植 株 從 江 蘇 省 宜 興 市 柯 銘 生 態(tài) 園 百 合 種 植 基 地 采 集10 株 嚴(yán) 重 發(fā) 病 的 具 有 典 型 枯 萎 病 癥 狀 的 百 合 植 株 品 種 為 宜 興 百 合 分 類 學(xué) 定 名 為 卷 丹 LiliumlancifoliumThunb 1 1 2 培 養(yǎng) 基 配 方 PDA 培 養(yǎng) 基 20 馬 鈴 薯 浸 出 液1000mL 200g 馬 鈴 薯 煮 沸15min 定 容 至1000 mL 葡 萄 糖20g 瓊 脂18g 尖 孢 鐮 刀 菌 的 選 擇 性 培 養(yǎng) 基 KH 2 PO 4 1 0g KCl0 5g MgSO 4 7H 2 O0 5g Fe Na EDTA0 01g L 天 門 冬 酰 胺2 0g D 半 乳 糖20 0g 蒸 餾 水1000mL 抗 生 素 類 物 質(zhì) 二 硝 基 苯 75 可 濕 性 粉 劑 1 0g 牛 膽 汁0 5g Na 2 B 4 O 7 10H 2 O1 0g 硫 酸 鏈 霉 素0 3g 培 養(yǎng) 基 用10 體 積 分 數(shù) 磷 酸 調(diào) 節(jié)pH 值 至3 8 0 2 配 制 參 照 文 獻(xiàn) 12 13 1 2 試 驗(yàn) 方 法 1 2 1 病 原 菌 的 分 離 和 純 化 選 擇 發(fā) 病 百 合 的 根 莖 鱗 莖 作 為 分 離 材 料 從 其 病 健 交 界 處 切 取1cm 1cm 的 小 塊 組 織 先 在75 乙 醇 中 浸3min 以 除 去 氣 泡 無 菌 水 沖 洗3 次 再 用5 次 氯 酸 鈉 浸 泡5min 進(jìn) 8 9 0 1 第6 期 任 勝 林 等 百 合 枯 萎 病 病 原 菌 的 分 離 鑒 定 及 其 接 種 濃 度 對 發(fā) 病 程 度 的 影 響 行 表 面 消 毒 用 無 菌 水 沖 洗7 次 用 滅 菌 濾 紙 吸 干 表 面 水 分 然 后 以 五 點(diǎn) 法 將 組 織 轉(zhuǎn) 移 在PDA 培 養(yǎng) 基 上 置 于28 培 養(yǎng) 箱 中 培 養(yǎng) 待 長 出 菌 絲 后 挑 取 部 分 菌 絲 接 種 在PDA 平 板 上 經(jīng)3 次 純 化 后 根 據(jù) 菌 落 顏 色 和 形 態(tài) 進(jìn) 行 分 類 編 號 采 用 稀 釋 法 進(jìn) 行 單 孢 分 離 和 培 養(yǎng) 1 2 2 回 接 試 驗(yàn) 根 據(jù) 柯 赫 法 則 Koch srule 為 驗(yàn) 證 分 離 純 化 得 到 的4 株 病 原 菌 菌 株 的 致 病 性 進(jìn) 行 回 接 試 驗(yàn) 回 接 試 驗(yàn) 采 用 鱗 片 接 種 法 14 和 盆 栽 試 驗(yàn) 鱗 片 接 種 法 試 驗(yàn) 于2018 年10 月10 日 25 日 在 實(shí) 驗(yàn) 室 進(jìn) 行 盆 栽 試 驗(yàn) 于2019 年4 月15 日 6 月15 日 在 溫 室 內(nèi) 進(jìn) 行 鱗 片 接 種 法 選 取 健 康 的 百 合 鱗 莖 片 用75 的 乙 醇 表 面 消 毒 無 菌 水 沖 洗5 次 用 滅 菌 牙 簽 在 健 康 百 合 鱗 片 上 刺 孔 將 帶 有 培 養(yǎng) 基 的 菌 餅 貼 在 孔 上 以 刺 孔 但 不 貼 菌 餅 的 鱗 片 作 為 對 照 將 百 合 鱗 片 放 置 于 28 培 養(yǎng) 箱 內(nèi) 培 養(yǎng) 菌 餅 制 備 將 分 離 的 菌 株 P RF P BF P PF P OF 在PDA 平 板 上 培 養(yǎng) 培 養(yǎng) 至 菌 落 鋪 滿 整 個 平 板 使 用 直 徑 為5mm 的 菌 餅 打 孔 器 將 長 滿 病 原 菌 的 平 板 制 備 成 多 個 直 徑 為5mm 的 菌 餅 備 用 設(shè) 置5 個 處 理 1 接 種 菌 株P(guān) RF 的 菌 餅 簡 稱P RF 2 接 種 菌 株P(guān) BF 的 菌 餅 簡 稱P BF 3 接 種 菌 株P(guān) PF 的 菌 餅 簡 稱P PF 4 接 種 菌 株P(guān) OF 的 菌 餅 簡 稱P OF 5 未 接 病 原 菌 的 菌 餅 CK 每 個 處 理 重 復(fù)4 次 5 片 健 康 百 合 鱗 片 組 成1 次 重 復(fù) 每 片 鱗 片 上 接2 個 菌 餅 即5 片 健 康 百 合 鱗 片 上 的10 個 菌 餅 組 成1 次 重 復(fù) 未 接 菌 餅 作 為 對 照 盆 栽 試 驗(yàn) 共 設(shè) 置5 個 處 理 1 對 照 CK T1 無 菌 水 2 菌 株P(guān) RF 的 孢 子 懸 液 T2 3 菌 株P(guān) BF 的 孢 子 懸 液 T3 4 菌 株P(guān) PF 的 孢 子 懸 液 T4 5 菌 株P(guān) OF 的 孢 子 懸 液 T5 每 處 理 重 復(fù)9 次 菌 株 孢 子 懸 液 制 備 用 直 徑5mm 的 無 菌 打 孔 器 分 別 取 分 離 純 化 后 不 同 菌 株 的 菌 絲 塊 分 別 接 種 至 液 體PDA 培 養(yǎng) 基 28 搖 床 振 蕩 培 養(yǎng)5 7d 后 將 培 養(yǎng) 液 用4 層 無 菌 紗 布 過 濾 8000r min 1 離 心10min 收 集 孢 子 加 無 菌 水 重 懸 制 成 每 毫 升 孢 子 數(shù) 量 為10 8 的 孢 子 懸 液 待 用 盆 栽 試 驗(yàn) 每 盆 裝1kg 水 稻 土 經(jīng) 檢 測 無 百 合 枯 萎 病 病 原 菌 每 盆 定 植1 株 健 康 百 合 苗 待 百 合 苗 成 活 后 采 用 針 刺 傷 根 法 接 種 除 對 照 接 無 菌 水 外 其 他 處 理 分 別 接 種 不 同 菌 株 的 孢 子 懸 液 接 種 量 1mL 常 規(guī) 管 理 1 2 3 病 原 菌 的 形 態(tài) 學(xué) 鑒 定 將 分 離 純 化 的 枯 萎 病 病 原 菌 菌 株 接 種 到PDA 平 板 上 采 用 稀 釋 法 進(jìn) 行 單 孢 分 離 和 培 養(yǎng) 15 28 培 養(yǎng)5d 后 觀 察 菌 落 形 態(tài) 在 顯 微 鏡 下 觀 察 菌 絲 分 生 孢 子 的 形 態(tài) 以 及 生 長 情 況 根 據(jù) 菌 落 直 徑 大 型 分 生 孢 子 的 形 態(tài) 及 產(chǎn) 生 方 式 有 無 小 型 分 生 孢 子 及 產(chǎn) 生 方 式 有 無 厚 垣 孢 子 及 產(chǎn) 生 方 式 等 為 主 要 形 態(tài) 根 據(jù) 鐮 刀 菌 屬 真 菌 鑒 定 手 冊 尖 孢 鐮 刀 菌 生 物 學(xué) 及 其 生 物 防 治 等 的 方 法 進(jìn) 行 鑒 定 1 2 4 病 原 菌 的 分 子 生 物 學(xué) 鑒 定 18SrDNA 鑒 定 使 用 土 壤DNA 提 取 試 劑 盒 DNeasyPowerSoilKit 提 取 真 菌 總DNA 以 提 取 的 病 原 菌 基 因 組 總DNA 作 模 板 PCR 擴(kuò) 增ITS internaltranscribedspacer 核 酸 片 段 ITS 引 物 ITS1 5 TCCGTAGGTAACCTGGGG 3 ITS4 5 TCCTCCGCTTATTGATATGC 3 引 物 由 南 京 金 斯 瑞 生 物 技 術(shù) 有 限公 司 合 成 PCR 反 應(yīng) 體 系 25 L 引 物ITS1 ITS40 5 L dNTP 2 5mmol L 1 2 5 L 10 PCRBuffer 含MgCl 2 25mmol L 1 2 5 L DNA 模 板1 L TaqDNA 酶 5U L 1 0 5 L ddH 2 O 17 5 L 擴(kuò) 增 條 件 94 5min 94 30s 54 30s 72 30s 35 個 循 環(huán) 72 10min 4 10min PCR 產(chǎn) 物 經(jīng) 純 化 后 測 序 將18SrDNA 基 因 序 列 與GenBank 數(shù) 據(jù) 庫 中 的 已 有 序 列 進(jìn) 行 比 對 分 析 并 用 MEGA7 0 軟 件 進(jìn) 行 序 列 分 析 并 構(gòu) 建 系 統(tǒng) 發(fā) 育 樹 確 定 該 菌 株 的 分 類 地 位 1 2 5 不 同 濃 度 病 原 菌 孢 子 懸 液 對 百 合 枯 萎 病 的 影 響 采 用 鱗 片 接 種 法 和 盆 栽 試 驗(yàn) 進(jìn) 行 鱗 片 接 種 方 法 同1 2 2 節(jié) 2018 年11 月20 日 12 月5 日 在 實(shí) 驗(yàn) 室 進(jìn) 行 鱗 片 接 種 法 試 驗(yàn) 2019 年4 月15 日 6 月15 日 在 溫 室 內(nèi) 進(jìn) 行 盆 栽 試 驗(yàn) 孢 子 懸 液 制 備 用 直 徑5mm 的 無 菌 打 孔 器 取 分 離 菌 株P(guān) OF 的 菌 絲 塊 接 種 到 液 體PDA 培 養(yǎng) 基 中 28 搖 床 振 蕩 培 養(yǎng)5 7d 后 將 培 養(yǎng) 液 用4 層 無 菌 紗 布 過 濾 8000r min 1 離 心10min 收 集 孢 子 加 無 菌 水 重 懸 制 成 每 毫 升 孢 子 數(shù) 量 為10 8 的 孢 子 懸 液 鱗 片 接 種 法 試 驗(yàn) 設(shè)9 個 處 理 1 對 照 CK 鱗 片 接 種 無 菌 水 2 T1 處 理 鱗 片 接 種10 1 CFU mL 1 病 原 菌 孢 子 懸 液 3 T2 處 理 鱗 片 接 種10 2 CFU mL 1 病 原 菌 孢 子 懸 液 4 T3 處 理 鱗 片 接 種10 3 CFU mL 1 病 原 菌 孢 子 懸 液 5 T4 處 理 鱗 片 接 種10 4 CFU mL 1 病 原 菌 孢 子 懸 液 6 T5 處 理 鱗 片 接 種10 5 CFU mL 1 病 原 菌 孢 子 懸 液 7 T6 處 理 鱗 片 接 種10 6 CFU mL 1 病 原 菌 孢 子 懸 液 8 T7 處 理 鱗 片 接 種10 7 CFU mL 1 病 原 菌 孢 子 懸 液 9 T8 處 理 鱗 片 接 種10 8 CFU mL 1 病 原 菌 孢 子 懸 液 9 9 0 1南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 學(xué) 報 第43 卷 選 取 健 康 的 百 合 鱗 片 用 滅 菌 牙 簽 在 鱗 片 上 刺 孔 制 備 菌 株P(guān) OF 懸 液 濃 度 分 別 為10 1 10 2 10 3 10 4 10 5 10 6 10 7 和10 8 CFU mL 1 分 別 向 百 合 刺 傷 處 注 射100 L 不 同 濃 度 病 原 菌 孢 子 懸 液 對 照 注 射100 L 無 菌 水 每 個 處 理 重 復(fù)6 次 每 次 重 復(fù) 含6 片 健 康 百 合 鱗 片 百 合 鱗 片 置 于28 培 養(yǎng) 箱 內(nèi) 培 養(yǎng) 盆 栽 試 驗(yàn) 設(shè)6 個 處 理 1 對 照 CK 無 菌 水 2 T22 處 理 接 種10 2 CFU g 1 病 原 菌 的 土 壤 處 理 3 T33 處 理 接 種10 3 CFU g 1 病 原 菌 的 土 壤 處 理 4 T44 處 理 接 種10 4 CFU g 1 病 原 菌 的 土 壤 處 理 5 T55 處 理 接 種10 5 CFU g 1 病 原 菌 的 土 壤 處 理 6 T66 處 理 接 種10 6 CFU g 1 病 原 菌 的 土 壤 處 理 盆 栽 試 驗(yàn) 每 盆 裝1kg 水 稻 土 經(jīng) 檢 測 無 百 合 枯 萎 病 病 原 菌 除 對 照 外 其 他 處 理 分 別 接 種 菌 株 P OF 的 孢 子 懸 液 每 盆 總 液 體 量 相 同 不 夠 部 分 用 無 菌 水 補(bǔ) 充 采 用 稀 釋 涂 布 控 制 各 處 理 土 壤 病 原 菌 濃 度 分 別 為10 2 10 3 10 4 10 5 和10 6 CFU g 1 平 衡2 3d 再 選 擇8 10cm 高 的 健 康 百 合 苗 定 植 每 盆 定 植 1 株 每 處 理 重 復(fù)9 次 常 規(guī) 水 肥 管 理 1 3 測 定 項(xiàng) 目 1 3 1 鱗 片 及 盆 栽 試 驗(yàn) 病 情 指 數(shù) diseaseseverityindex DSI 的 統(tǒng) 計 接 種 不 同 濃 度 的 病 原 菌 孢 子 懸 液 后 10d 后 記 錄 發(fā) 病 癥 狀 測 量 每 個 發(fā) 病 百 合 鱗 片 的 病 斑 直 徑 d 計 算 病 斑 占 鱗 片 面 積 比 例 將 鱗 片 發(fā) 病 級 數(shù) 劃 分 為5 級 0 級 鱗 片 健 康 無 病 斑 現(xiàn) 象 1 級 病 斑 侵 染 面 積 約 占 百 合 鱗 片 面 積0 10 2 級 病 斑 侵 染 面 積 約 占 百 合 鱗 片 面 積10 20 3 級 病 斑 直 侵 染 面 積 約 占 百 合 鱗 片 面 積20 30 4 級 病 斑 侵 染 面 積 約 占 百 合 鱗 片 面 積30 以 上 接 種 不 同 濃 度 的 病 原 菌 孢 子 懸 液 后 當(dāng) 第1 株 病 株 出 現(xiàn) 后 每 隔5d 調(diào) 查 發(fā) 病 情 況 病 情 嚴(yán) 重 度 分 為 4 級 0 級 為 健 康 植 株 1 級 為1 至2 片 葉 片 變 黃 萎 蔫 2 級 為3 片 以 上 至 全 株1 3 葉 片 變 黃 萎 蔫 莖 輕 微 腐 爛 3 級 為 全 株 葉 片1 2 至3 4 變 黃 萎 蔫 莖 中 度 腐 爛 4 級 為3 4 以 上 或 全 株 葉 片 變 黃 萎 蔫 莖 嚴(yán) 重 腐 爛 病 情 指 數(shù) DSI 100 病 害 發(fā) 病 級 數(shù) 該 級 別 的 植 株 數(shù) 供 試 植 株 或 鱗 片 數(shù) 總 植 株 或 鱗 片 數(shù) 1 3 2 統(tǒng) 計 發(fā) 病 率 鱗 片 接 種 不 同 濃 度 的 病 原 菌 孢 子 懸 液 試 驗(yàn) 10d 后 統(tǒng) 計 發(fā) 病 率 觀 察 百 合 鱗 片 刺 傷 接 種 孢 子 懸 液 部 位 是 否 出 現(xiàn) 褐 色 病 斑 發(fā) 病 率 處 理 發(fā) 病 株 數(shù) 處 理 重 復(fù) 次 數(shù) 100 盆 栽 試 驗(yàn) 百 合 移 苗 后 每 天 觀 察 百 合 生 長 情 況 至 植 株 發(fā) 病 嚴(yán) 重 時 記 錄 發(fā) 病 植 株 數(shù) 1 4 數(shù) 據(jù) 分 析 采 用Excel2016 和SPSS24 軟 件 進(jìn) 行 數(shù) 據(jù) 統(tǒng) 計 和 顯 著 性 水 平 檢 驗(yàn) 2 結(jié) 果 與 分 析 2 1 百 合 枯 萎 病 病 原 菌 菌 株 的 分 離 從 嚴(yán) 重 發(fā) 病 的 典 型 枯 萎 病 癥 狀 的10 株 百 合 植 株 上 分 離 得 到4 株 病 原 菌 菌 株 分 別 編 號 為P OF P PF P RF P BF 其 他 病 原 菌 未 分 離 成 功 分 離 結(jié) 果 見 表1 表1 宜 興 百 合 枯 萎 病 病 原 菌 菌 株 分 離 Table1 Isolationof F u s a r i u mwiltpathogensinYixing 菌 株 Strain 分 離 部 位 Separationsite 組 織 塊 數(shù) Numberoforganizationblocks 感 染 菌 塊 數(shù) Numberofinfectedbacteria 分 離 率 Separationrate P OF 鱗 片Scales 20 5 25 P PF 鱗 片Scales 20 4 20 P RF 鱗 片Scales 20 2 10 P BF 鱗 片Scales 20 1 5 2 2 病 原 菌 回 接 試 驗(yàn) 刺 傷 接 菌 后 的 百 合 鱗 片 發(fā) 病 癥 狀 與 田 間 發(fā) 病 癥 狀 相 同 回 接 分 離 的4 株 病 原 菌 株 的 百 合 鱗 片 刺 傷 口 出 現(xiàn) 褐 色 病 斑 同 時 向 周 圍 蔓 延 圖1 接 種 不 同 病 原 菌 的 百 合 鱗 片 的 病 情 指 數(shù) 顯 著 高 于 未 回 接 病 原 菌 的 百 合 鱗 片 回 接P OF 病 原 菌 處 理 的 病 情 指 數(shù) 顯 著 高 于 菌 株P(guān) RF P BF P PF 同 時 回 接 菌 株P(guān) OF 和P PF 的 百 合 鱗 片 發(fā) 病 率 高 達(dá)100 表2 除 對 照 外 接 種 百 合 枯 萎 病4 個 菌 株13d 后 百 合 植 株 開 始 發(fā) 病 最 先 發(fā) 病 的 是 接 種 菌 株P(guān) OF 的 處 理 其 他 依 次 分 別 為 接 種 菌 株P(guān) PF P BF P RF 的 處 理 以 上 結(jié) 果 表 明 菌 株P(guān) OF P PF P BF 和P RF 均 是 導(dǎo) 致 宜 興 百 合 枯 萎 病 的 病 原 菌 其 中 菌 株P(guān) OF 的 致 病 性 最 強(qiáng) 后 續(xù) 相 關(guān) 研 究 均 以 此 菌 株 為 基 礎(chǔ) 展 開 0 0 1 1 第6 期 任 勝 林 等 百 合 枯 萎 病 病 原 菌 的 分 離 鑒 定 及 其 接 種 濃 度 對 發(fā) 病 程 度 的 影 響 圖1 病 原 菌 回 接 試 驗(yàn) Fig 1 Pathogenicbacteriabackgraftingtest 接 種 第8 天 照 片 溫 度28 濕 度 為 室 內(nèi) 濕 度 Onday8afterinoculation temperatureis28 humidityisindoorhumidity 表2 回 接 病 原 菌 對 百 合 枯 萎 病 發(fā) 病 病 情 指 數(shù) 和 發(fā) 病 率 的 影 響 Table2 Effectofpathogenonthediseaseindexandincidenceoflily F u s a r i u mwilt 處 理 Treatment 鱗 片 接 種 試 驗(yàn)Scaleinoculationexperiment 病 情 指 數(shù) Diseaseindex 發(fā) 病 率 Incidence 盆 栽 回 接 試 驗(yàn)Pottedbackconnectionexperiment 發(fā) 病 率 Incidence 最 初 發(fā) 病 出 現(xiàn) 時 間 Timeofinitialonset CK 0 P OF 92 50 2 89 a 100 100 接 種 后14d 14dafterinoculation P PF 48 25 6 29 b 100 100 接 種 后16d 16dafterinoculation P BF 30 00 14 14 c 85 100 接 種 后17d 17dafterinoculation P RF 15 00 4 08 d 60 100 接 種 后18d 18dafterinoculation 注 同 列 不 同 小 寫 字 母 表 示 同 列 間 差 異 顯 著 P 0 05 下 同 Note Thedifferentlowercaselettersindicatesignificantdifferenceinthesamecolumnat0 05level Thesameasfollows 2 3 百 合 枯 萎 病 病 原 菌 菌 株P(guān) OF 的 顯 微 鏡 觀 察 將 分 離 得 到 的 菌 株P(guān) OF 接 種 于PDA 平 板 上 28 培 養(yǎng)5d 后 觀 察 其 菌 落 形 態(tài) 由 圖2 可 見 菌 株 在PDA 培 養(yǎng) 基 上 菌 落 呈 圓 形 其 菌 絲 具 有 條 紋 氣 生 菌 絲 呈 白 色 絮 狀 或 絨 毛 狀 初 期 菌 落 呈 白 色 菌 落 中 央 呈 淡 紫 色 背 面 帶 有 淡 紫 色 的 色 素 圖2 A B 菌 株 菌 落 繁 茂 氣 生 菌 絲 豐 厚 采 用 插 片 法 顯 微 400 觀 察 病 原 菌 菌 絲