南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報 2021 44 1 68 77 http Journal of Nanjing Agricultural University DOI 10 7685 jnau 202004012 收稿日期 2020 04 07 基金項目 國家重點研發(fā)計劃項目 2019YFD1001500 中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金 KJQN201812 江蘇省自然科學(xué)基金項目 BK20170722 江蘇省農(nóng)業(yè)自主創(chuàng)新項目 CX 18 2020 作者簡介 柳麗娜 碩士研究生 通信作者 管志勇 教授 主要從事花卉種質(zhì)資源與育種研究 E mail guanzhy 柳麗娜 劉曄 李媛媛 等 38個茶用菊品種苗期對黑斑病的抗性鑒定 J 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報 2021 44 1 68 77 LIU Lina LIU Ye LI Yuanyuan et al Resistance identification to black spot disease of 38 cultivars of chrysanthemum for tea at seedling stage J Journal of Nanjing Agricultural University 2021 44 1 68 77 38個茶用菊品種苗期對黑斑病的抗性鑒定 柳麗娜 劉曄 李媛媛 陳發(fā)棣 陳素梅 房偉民 管志勇 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部景觀設(shè)計重點實驗室 園藝學(xué)院 江蘇南京210095 摘要 目的 本研究旨在篩選茶用菊黑斑病抗性品種 用于抗病育種 方法 采用組織塊分離法進(jìn)行黑斑病病原菌分離 純化 通過顯微鏡觀察進(jìn)行病原菌分生孢子形態(tài)學(xué)鑒定 并采用真菌18S rDNA ITS序列進(jìn)行分子水平鑒定 基于黑斑病菌 致病力檢測結(jié)果開展38個茶用菊品種苗期黑斑病人工接種鑒定 通過掃描電鏡觀察葉片表皮毛和氣孔結(jié)構(gòu)特征 結(jié)果 從黑斑病病株 福白菊 葉片上分離到F16和F20共2個菌株 經(jīng)鑒定均為交鏈格孢菌 Alternaria alternata 對茶用 菊葉片的致病力檢測顯示F16與F20均具有較強(qiáng)致病力且致病力沒有顯著差異 38個品種的黑斑病抗性鑒定結(jié)果顯示 有11個抗病品種 占28 95 22個中感品種 占57 89 以及5個感病品種 占13 16 進(jìn)一步比較典型抗病和感病 品種的葉片結(jié)構(gòu)特征差異發(fā)現(xiàn) 抗病品種表皮毛密度普遍大于感病品種 且氣孔密度小于感病品種 結(jié)論 本研究篩選出 部分茶用菊抗黑斑病品種 發(fā)現(xiàn)表皮毛及氣孔密度與其抗性相關(guān) 首次發(fā)現(xiàn)交鏈格孢菌能夠引起菊花黑斑病 關(guān)鍵詞 茶用菊 黑斑病 抗性鑒定 表皮毛 氣孔 中圖分類號 S682 1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1000 2030 2021 01 0068 10 Resistance identification to black spot disease of 38 cultivars of chrysanthemum for tea at seedling stage LIU Lina LIU Ye LI Yuanyuan CHEN Fadi CHEN Sumei FANG Weimin GUAN Zhiyong State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement Key Laboratory of Landscaping Ministry of Agriculture and Rural Affairs College of Horticulture Nanjing Agricultural University Nanjing 210095 China Abstract Objectives The purpose of this study was to screen resistant cultivars for black spot disease resistance breeding Methods The tissue block separation method was used to separate and purify the pathogens of black spot disease The morphological identification of pathogenic conidia was observed by microscope and then molecular level identification was used to fungal 18S rDNA ITS sequence Based on the identification results of pathogens of black spot disease 38 cultivars chrysanthemum for tea were inoculated and identified The characteristics of leaf epidermal trichomes and stomata structure were observed by scanning electron microscope Results The strains of F16 and F20 were isolated from black spot disease leaves of Fubaiju and both two strains were Alternaria alternata The pathogenicity test showed that both F16 and F20 could cause black spot disease of chrysanthemum for tea and both of them had strong pathogenicity and no significant difference in pathogenicity The identification results of 38 cultivars showed that there were 11 resistant cultivars accounting for 28 95 22 moderately susceptible cultivars accounting for 57 89 and 5 susceptible cultivars accounting for 13 16 By further comparing the differences in leaf structure characteristics of typical resistant and suscep tible cultivars the results showed that the epidermal trichomes density of resistant cultivars was generally greater than susceptible culti vars and the stomatal density was less than that of susceptible cultivars Conclusions This study screened out some resistant cultivars to black spot disease and found that the epidermal trichomes and stomatal density were related to their resistance It was also the first time to find that Altermaria alternata could cause chrysanthemum leaf spot disease Keywords chrysanthemum for tea black spot disease resistance identification epidermal trichomes stomata 菊花 Chrysanthemum morifolium Ramat 起源于中國 栽培歷史長達(dá)2 500多年 品種多達(dá)3 000以 上 1 是我國種植最廣泛的一種傳統(tǒng)名花 除了觀賞栽培外 茶用菊和藥用菊的產(chǎn)業(yè)規(guī)模更大 久飲菊花 茶 能夠利血氣 使身體輕盈 能耐老而延壽 2 在茶用菊產(chǎn)業(yè)化栽培中 各類真菌病害是各產(chǎn)區(qū)的普遍 性問題 由鏈格孢屬 Alternaria sp 真菌引起的茶用菊黑斑病嚴(yán)重制約其規(guī)?；a(chǎn) 且在高溫高濕環(huán) 第1期柳麗娜 等 38個茶用菊品種苗期對黑斑病的抗性鑒定 境條件下破壞性更強(qiáng) 被感染的菊花在發(fā)病初期葉片上會零星分散著面積較小 呈褐色的壞死斑點 發(fā)展 后病斑逐漸擴(kuò)大 形成圓形 橢圓形和不規(guī)則形的黑褐色病斑 在高溫 高濕條件下 病斑上會著生稀疏的 灰白色霉層 通常數(shù)個病斑連片匯合 葉肉組織完全壞死 進(jìn)而導(dǎo)致花形扭曲 花朵衰敗甚至整株枯萎和死 亡 嚴(yán)重影響茶用菊的食品安全與商業(yè)價值 3 噴施農(nóng)藥進(jìn)行防治 農(nóng)藥殘留會對人的身體健康造成威 脅 也會造成病原抗藥性問題 還會污染生態(tài)環(huán)境并阻礙綠色與環(huán)境友好型農(nóng)業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展 4 采用抗病品種進(jìn)行生產(chǎn)是防治植物病害最經(jīng)濟(jì)的方法 而抗病性鑒定和抗病種質(zhì)資源的篩選是抗病 育種工作的基礎(chǔ) 也是抗性生理和遺傳研究的前提 目前已有多種蔬菜 果樹針對鏈格孢屬真菌引起的葉 斑病的抗病性鑒定報道 5 6 許高娟 7 對33種菊花近緣種屬植物苗期黑斑病抗性進(jìn)行了鑒定 目前 還 未見針對批量茶用菊種質(zhì)資源抗病性鑒定方面的報道 抗病茶用菊種質(zhì)資源的發(fā)掘?qū)ν苿硬栌镁湛共∑?種選育具有重要意義 不同茶用菊品種的抗性鑒定是獲得典型抗病材料的基礎(chǔ) 在苗期進(jìn)行人工接種鑒 定是篩選茶用菊抗病品種經(jīng)濟(jì)有效的方法 且具有操作簡單 結(jié)果可靠 周期短等優(yōu)點 為抗性品種篩選的 常用方法 8 植物的防御抵抗機(jī)制主要包括物理結(jié)構(gòu)抗性和化學(xué)物質(zhì)抗性 其中 物理結(jié)構(gòu)抗性是植物利用自身的 結(jié)構(gòu)屏障 例如表皮毛 氣孔 角質(zhì)層和細(xì)胞壁等阻擋病原物入侵及擴(kuò)散 9 對于植物而言 表皮毛是植 物與病原菌最初接觸的地方 也是植物識別外來威脅并進(jìn)行防御的起點 10 氣孔是病原菌入侵最直接的 通道 其密度 大小 開閉程度等也會影響病原菌能否成功入侵 11 本研究基于38個茶用菊品種的抗性 鑒定結(jié)果對不同抗 感茶用菊品種葉片的表皮毛與氣孔密度進(jìn)行分析 探討其對黑斑病的防御機(jī)制 為茶 用菊抗黑斑病機(jī)制解析提供一定的理論依據(jù) 1 材料與方法 1 1 試驗材料 病原菌分離自茶用菊品種 福白菊 采自湖北省麻城市福田河鎮(zhèn)純陽山 福白菊 生產(chǎn)基地 供試的 38個茶用菊品種來自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)中國菊花種質(zhì)資源保存中心 詳見表1 表1 供試的38個茶用菊品種 Table 1 38 cultivars of chrysanthemum for tea of test 編號Code品種Cultivar編號Code品種Cultivar編號Code品種Cultivar 1杭白菊Hangbaiju 14金絲黃菊J(rèn)insihuangju 27蘇菊6號Suju 6 2福白菊Fubaiju 15皇菊Huangju 28蘇菊7號Suju 7 3射陽紅心菊Sheyanghongxinju 16大洋菊Dayangju 29蘇菊8號Suju 8 4射陽大白菊Sheyangdabaiju 17金菊1號Jinju 1 30蘇菊9號Suju 9 5滁菊Chuju 18金菊3號Jinju 3 31蘇菊10號Suju 10 6七月白Qiyuebai 19亳菊Boju 32蘇菊11號Suju 11 7九月菊J(rèn)iuyueju 20遲黃Chihuang 33蘇菊12號Suju 12 8黃香梨Huangxiangli 21晚貢菊Wangongju 34蘇菊13號Suju 13 9白小香菊Baixiaoxiangju 22黃山貢菊Huangshangongju 35蘇菊14號Suju 14 10黃小香菊Huangxiaoxiangju 23白金菊Baijinju 36蘇菊15號Suju 15 11小黃菊Xiaohuangju 24川百菊Chuanbaiju 37休寧貢菊Xiuninggongju 12河北香菊Hebeixiangju 25滿天星Mantianxing 38休寧藥菊Xiuningyaoju 13桐鄉(xiāng)小黃菊Tongxiangxiaohuangju 26黃山黃菊Huangshanhuangju 1 2 病原菌分離 鑒定與致病力檢測 1 2 1 病原菌分離 純化及保存 采用組織塊分離法分離病原菌 取 福白菊 病葉 經(jīng)自來水沖洗干凈 再用無菌蒸餾水沖洗5 min 此后的操作均在超凈工作臺中進(jìn)行 將病葉置于盛有70 體積分?jǐn)?shù) 乙醇 的容器中消毒30 s 再置于15 的H2O2中消毒15 min 重復(fù)消毒3次 最后用無菌蒸餾水沖洗干凈 滅菌 濾紙吸干葉片表面水分 12 用組培刀將病斑部位分解成面積約為0 25 cm2的組織塊 將葉片組織塊接 種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂 PDA 培養(yǎng)基上 25 條件下暗培養(yǎng)3 d 當(dāng)培養(yǎng)的組織塊周圍長出肉眼可見的菌 落時 用滅菌打孔器從單個菌落邊緣取出菌餅轉(zhuǎn)接到新的PDA培養(yǎng)基上 當(dāng)菌落長出黃褐色霉層時 說明 已經(jīng)產(chǎn)生孢子 可在超凈工作臺內(nèi)挑取少量孢子 制作切片 在光學(xué)顯微鏡下觀察并挑取單孢純化培養(yǎng) 采用冷凍保存法 用滅菌打孔器沿純化菌落邊緣切取直徑約為5 mm的菌塊3塊 置于裝有800 L馬鈴薯 葡萄糖水 PDB 液體培養(yǎng)基和800 L 30 甘油的2 mL滅菌離心管中 80 冰箱中存儲備用 96 南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 學(xué) 報第44卷 1 2 2 菌株形態(tài)與分子生物學(xué)鑒定 形態(tài)鑒定 將在PDA培養(yǎng)基上活化分離到的菌株置于25 培養(yǎng)箱 中黑暗培養(yǎng)7 d 觀察菌落形狀 顏色等外觀特征 再用無菌水沖洗菌落表面富集分生孢子 制作切片 并在 顯微鏡下觀察分生孢子的形態(tài)特征 根據(jù)張?zhí)煊?13 和Lawrence等 14 的方法對鏈格孢菌的特征進(jìn)行鑒定 分子生物學(xué)鑒定 采用真菌DNA提取試劑盒 OMEGA生物科技公司 提取所得菌株DNA 利用PCR技術(shù) 對病原菌核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)18S rDNA ITS序列進(jìn)行擴(kuò)增 擴(kuò)增采用的引物序列為 ITS1 F 5 CTTGGT CATTTAGAGGAAGTAA 3 ITS4 5 TCCTCCGCTTATTGATATGC 3 15 由上海捷瑞生物工程有限公司合 成 PCR反應(yīng)程序 94 5 min 94 30 s 56 30 s 72 30 s 35個循環(huán) 72 5 min 通過20 g L 1 瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物目的片段長度是否正確 最后將PCR產(chǎn)物送通用生物有限公司進(jìn)行測序 測序結(jié)果在NCBI官網(wǎng)進(jìn)行BLAST序列比對 并采用MEGA 5 10軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹 16 1 2 3 致病力檢測 采用離體菌塊貼接法 采集健康新鮮的 滁菊 葉片 先用自來水沖洗掉表面的灰 塵 再浸入70 的乙醇中消毒30 s 待乙醇揮發(fā)后在葉柄上包1層無菌脫脂棉以保證100 的相對濕度 然 后置入鋪有1層無菌脫脂棉和2層濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中 用直徑5 mm的滅菌打孔器在PDA平板上生長 7 d的菌落邊緣打孔 將制備好的菌餅接種在葉面固定位置 同時將等量的無菌PDA培養(yǎng)基圓餅貼放在健 康葉片相同部位作為對照 將培養(yǎng)皿密封并放入25 培養(yǎng)箱中進(jìn)行黑暗培養(yǎng)48 h 然后置于光照 黑暗 時間為16 h 8 h的條件下培養(yǎng) 分別于接種后3 6 9 12 d觀察葉片的發(fā)病情況 采用十字交叉法 17 統(tǒng) 計不同接種時期葉片病斑直徑 1 3 茶用菊黑斑病苗期抗性鑒定 1 3 1 植物材料培養(yǎng) 將生長狀態(tài)一致的38個茶用菊品種的扦插生根苗栽植到草炭和珍珠巖質(zhì)量比為 3 1的混合基質(zhì)中 緩苗后正常水肥管理 保證基質(zhì)不缺水 每周施用稀釋液體平衡肥 在光照 黑暗時間 為16 h 8 h的光周期下生長 晝 夜溫度分別設(shè)置為25 22 相對濕度保持在68 75 培養(yǎng)10 d 后 每個品種選取健壯且長勢一致的盆栽幼苗30株 將幼苗隨機(jī)分成2組 每組15株 1組用于接種 1組 用作對照 1 3 2 菌絲懸浮液制備與接種 取培養(yǎng)7 d的交鏈格孢菌株 用滅菌打孔器沿PDA培養(yǎng)基菌落邊緣打取 直徑約5 mm左右的菌餅10 15塊 放入裝有40 60 mL PDB液體培養(yǎng)基的100 mL三角瓶 在25 搖床 上200 r min 1培養(yǎng)24 h 取3個培養(yǎng)好的菌球 盡量保證菌球大小一致 于2 mL離心管中 加入滅菌小 鋼珠后上磨樣機(jī)研磨 將研磨好的菌絲勻漿加入裝有200 mL PDB液體培養(yǎng)基的三角瓶 在25 搖床上 200 r min 1培養(yǎng)48 h 吸取2 mL搖勻的菌絲懸浮液于直徑6 cm的一次性無菌培養(yǎng)皿中 用滅菌毛筆挑 出菌絲涂抹于供試菊花第2或第3片真葉背面 接種后給葉片套上自封袋 注意葉片背部不要與袋子接 觸 對照組用PDB液體培養(yǎng)基涂抹并套袋 將菊花置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 培養(yǎng)條件設(shè)置為 溫度25 濕 度80 黑暗條件培養(yǎng)48 h 1 3 3 病情調(diào)查與統(tǒng)計 在接種后48 h進(jìn)行病情調(diào)查與統(tǒng)計 參照許高娟 7 的分級標(biāo)準(zhǔn)加以改進(jìn) 將 病情分為4級 0級 葉片健康 無病害 1級 病斑面積占葉片面積比例小于25 2級 病斑面積占葉片 面積比例為25 50 3級 病斑面積占葉片面積比例大于50 按照該標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查發(fā)病情況 統(tǒng)計每級 病株數(shù) 計算每個品種發(fā)病率與病情指數(shù) DSI 其計算公式如下 發(fā)病率 病株數(shù) 處理總株數(shù) 100 DSI 病害級別 該級病株數(shù) 最高病害級別 調(diào)查總株數(shù) 100 根據(jù)病情指數(shù)劃分抗病評價等級 免疫 I DSI 0 抗病 R 0 DSI 25 00 中感 MS 25 00 DSI 50 00 感病 S DSI 50 00 1 4 掃描電鏡觀察表皮毛與氣孔 取抗病和感病品種 抗病品種 蘇菊6號 蘇菊8號 滁菊 感病品種 蘇菊7號 七月白 大 洋菊 植株頂端以下第2或第3片完全展開的新鮮葉片 在葉脈主脈兩側(cè)距離相同部位剪取面積約0 5 cm2的小葉塊 下表皮朝上 用2 5 戊二醛溶液進(jìn)行抽真空固定 固定后立即轉(zhuǎn)移至4 冰箱保存 將 樣品送至武漢賽維爾生物科技有限公司進(jìn)行掃描電子顯微鏡 SU8100 HITACHI 觀察 拍照 每個小葉 塊觀察4 6個視野 每個品種觀察3個小葉塊 07 第1期柳麗娜 等 38個茶用菊品種苗期對黑斑病的抗性鑒定 2 結(jié)果與分析 2 1 茶用菊黑斑病菌的分離與鑒定 從 福白菊 病葉 圖1 a 上分離純化得到2個黑斑病致病菌株 編號為F16與F20 2個菌株在 PDA培養(yǎng)基上的菌落均為圓形 分別呈黃褐色及黃棕色 表面生長著厚厚的茸毛狀氣生菌絲 菌株F16 菌落邊緣沒有F20平滑 且F16正 背面顏色較均一 僅菌落邊緣顏色較淺 圖1 b F20正面顏色較F16 偏灰 背面顏色從外向內(nèi)由淺變深 且呈現(xiàn)輪紋狀 圖1 c 2個菌株分生孢子均為褐色或者淺褐色 大 多呈倒棍棒狀或倒梨形 少數(shù)呈卵形或者近似橢圓形 大小為 24 5 42 5 m 9 5 13 5 m 喙或假 喙呈短圓柱狀 長2 9 9 8 m 具有2 6個橫的隔膜 偶爾可見1 4個縱 或斜 的隔膜 分隔處有縊縮 圖1 d 根據(jù)F16和F20菌落形態(tài)與分生孢子特征并參照前人的研究結(jié)果 13 14 可初步判定其為交鏈 格孢菌 Alternaria alternata Fr Keissl 圖1 茶用菊黑斑病病葉與致病菌株 Fig 1 Disease leaves and pathogens of Alternaria alternata in chrysanthemum for tea a 福白菊 黑斑病病葉 b 菌株F16形態(tài) 上 正面 下 背面 c 菌株F20形態(tài) 上 正面 下 背面 d 20倍 上 與40倍 下 顯微鏡下分生孢子形態(tài) a Black spot disease leaves of Fubaiju b Morphology of strain F16 above front below back c Morphology of strain F20 above front below back d Conidiophores morphology under 20 times above and 40 times below microscope 圖2 茶用菊黑斑病病原菌分子鑒定 Fig 2 Molecular identification of the pathogen of black spot disease in chrysanthemum for tea a 18S rDNA ITS目的基因PCR檢測 b 基于18S rDNA ITS目的基因序列以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 a 18S rDNA ITS target gene PCR test results b Phylogenetic tree constructed based on 18S rDNA ITS target gene sequences by Neighbor joining method 為了進(jìn)一步確定F16與F20在鏈格孢屬中的分類地位 提取2個菌株的DNA 應(yīng)用真菌18S rDNA ITS 序列對其進(jìn)行分子水平鑒定 測序結(jié)果提交至NCBI http www ncbi nlm nih gov 官網(wǎng)進(jìn)行BLAST比對 結(jié)果顯示F16和F20與NCBI數(shù)據(jù)庫中記載的交鏈格孢菌 Alternaria alternata 登錄號 KT280010 1 相 似度達(dá)99 以上 且在系統(tǒng)發(fā)育樹上聚為一支 圖2 結(jié)合形態(tài)特征 確定F16與F20均為交鏈格孢菌 17 南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 學(xué) 報第44卷 2 2 病原菌致病力檢測 分別用F16和F20的菌餅接種 滁菊 離體葉片3 d時均出現(xiàn)明顯的發(fā)病癥狀 隨著接種時間推移病 斑面積逐漸擴(kuò)展 顏色為黑褐色 并在外圍出現(xiàn)淺黃色的暈圈 圖3 病斑直徑統(tǒng)計結(jié)果 圖4 顯示 隨 接種時間延長病斑直徑增加 表明菌株F16和F20均有較強(qiáng)致病力 除了接種后6 d 其他接種時間F16與 F20的病斑直徑均無顯著性差異 根據(jù)柯赫氏法則從發(fā)病的 滁菊 葉片上再次分離 純化病原菌F16與 F20 其菌落形態(tài) 分生孢子形態(tài)與首次分離出的病原菌一致 說明原接種菌株確為致病菌 圖3 茶用菊葉片接種后不同時間的發(fā)病癥狀 Fig 3 Symptoms at different time post inoculation on vitro leaves of chrysanthemum for tea 圖4 滁菊 葉片病斑直徑 Fig 4 The lesion diameter of Chuju leaves 不同字母表示同一接種時間不同菌株處理下差異顯著 P 0 05 Different letters indicate significant difference at 0 05 level at the same inoculation time under different strains treatment 2 3 茶用菊黑斑病的抗性鑒定 通過葉背涂抹菌絲接種法對38個茶用菊品種進(jìn)行 了2次苗期黑斑病抗性鑒定試驗 根據(jù)病情指數(shù)可將38 個品種劃分成抗病 R 中感 MS 和感病 S 3個類別 表2 圖5 其中 有11個品種 占28 95 表現(xiàn)為抗 病 病情指數(shù)從小到大排名前5位的是 蘇菊6號 蘇 菊10號 河北香菊 蘇菊15號 和 滿天星 22個品 種 占57 89 表現(xiàn)為中感 代表品種為 蘇菊9號 杭 白菊 射陽紅心菊 5個感病品種 占13 16 為 黃山 貢菊 蘇菊13號 大洋菊 川百菊 和 休寧藥菊 其病情指數(shù)分別為53 33 56 67 56 67 60 65和75 56 用SPSS 19 0軟件對2次抗性鑒定的病情指數(shù) DSI 進(jìn)行相關(guān)性分析 結(jié)果顯示2次試驗的DSI相關(guān)系 數(shù)為0 860 極顯著相關(guān) 27 第1期柳麗娜 等 38個茶用菊品種苗期對黑斑病的抗性鑒定 圖5 接種48 h后不同抗性品種的發(fā)病癥狀 標(biāo)尺 1 0 cm Fig 5 Disease symptoms of different resistance cultivars after inoculation for 48 h bar 1 0 cm 表2 38個茶用菊品種對黑斑病的抗性鑒定結(jié)果 Table 2 Resistance identification results of 38 cultivars of chrysanthemum for tea to black spot disease 編號 Code 第1次試驗The first experiment 發(fā)病率 Incidence病情指數(shù)Disease index 第2次試驗The second experiment 發(fā)病率 Incidence病情指數(shù)Disease index 平均病情指數(shù) Average disease index 抗病類型 Resistance type 27 33 33 11 11 26 67 8 89 10 00 R 31 60 00 13 33 40 00 15 56 14 45 R 12 46 67 15 56 66 67 13 33 14 45 R 36 46 67 13 33 53 33 17 78 15 56 R 25 40 00 15 56 60 00 15 56 15 56 R 7 46 67 15 56 66 67 22 22 18 89 R 5 66 67 22 22 80 00 17 78 20 00 R 19 73 33 17 78 53 33 22 22 20 00 R 29 66 67 24 44 46 67 20 00 22 22 R 10 46 67 20 00 53 33 24 44 22 22 R 23 60 00 20 00 66 67 26 67 23 34 R 30 93 33 24 44 73 33 28 89 26 67 MS 33 73 33 26 67 80 00 28 89 27 78 MS 17 60 00 26 67 80 00 28 89 27 78 MS 32 73 33 26 67 73 33 28 89 27 78 MS 14 73 33 26 67 66 67 35 56 31 12 MS 11 53 33 28 89 53 33 33 33 31 11 MS 37 86 67 33 33 80 00 33 33 33 33 MS 1 73 33 35 56 66 67 28 89 32 23 MS 35 80 00 37 78 73 33 28 89 33 34 MS 13 66 67 31 11 73 33 37 78 34 45 MS 15 93 33 37 78 80 00 31 11 34 45 MS 8 86 67 40 00 100 00 37 78 38 89 MS 2 86 67 44 44 66 67 35 56 40 00 MS 26 93 33 48 89 80 00 33 33 41 11 MS 20 60 00 46 67 66 67 35 56 41 12 MS 9 100 00 44 44 80 00 44 44 44 44 MS 6 100 00 40 00 80 00 48 89 44 45 MS 4 86 67 42 22 93 33 51 11 46 67 MS 21 100 00 51 11 80 00 42 22 46 67 MS 3 86 67 55 56 80 00 37 78 46 67 MS 28 100 00 51 11 93 33 44 44 47 78 MS 18 73 33 57 78 73 33 40 00 48 89 MS 22 53 33 42 22 66 67 64 44 53 33 S 34 86 67 57 78 93 33 55 56 56 67 S 16 100 00 62 22 86 67 51 11 56 67 S 24 80 00 56 86 100 00 64 44 60 65 S 38 100 00 77 78 100 00 73 33 75 56 S 注 R 抗病Resistant MS 中感Moderately susceptible S 感病Susceptible 下同 The same as follows 37 南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 學(xué) 報第44卷 2 4 抗 感品種表皮毛與氣孔特征差異 2 4 1 葉片表皮毛差異 基于抗性鑒定結(jié)果 選取3個抗病品種 蘇菊6號 蘇菊8號 滁菊 及3個感 病品種 蘇菊7號 大洋菊 七月白 進(jìn)行掃描電鏡觀察 觀察與統(tǒng)計結(jié)果顯示 抗病品種和感病品種 的葉片下表皮表皮毛形態(tài)沒有明顯差異 但密度存在顯著差異 表3 圖6 圖7 且在3個抗病品種中 表 皮毛密度與病情指數(shù)呈負(fù)相關(guān) 即表皮毛密度越大 病情指數(shù)越小 感病品種中除了 大洋菊 蘇菊 7號 與 七月白 的表皮毛密度與病情指數(shù)也呈負(fù)相關(guān) 在6個品種中 抗病品種 蘇菊6號 的表皮毛 密度最大 為32 75 mm 2 感病品種 蘇菊7號 表皮毛密度最小 為12 96 mm 2 表3 6個茶用菊品種葉片下表皮表皮毛與氣孔密度統(tǒng)計 Table 3 Statistics of leaf lower epidermal trichome and stomatal density of 6 chrysanthemum for tea cultivars 品種Cultivar病情指數(shù)Disease index表皮毛密度 mm 2 Epidermal trichome density氣孔密度 mm 2 Stomata density 蘇菊6號Suju 6 10 00 32 75 4 59a 93 02 9 86d 蘇菊8號Suju 8 22 22 26 34 2 29b 96 35 8 66d 滁菊Chuju 20 00 31 08 5 38a 130 68 4 54bc 蘇菊7號Suju 7 47 78 12 96 1 89d 132 89 8 66b 大洋菊Dayangju 56 67 23 24 1 61b 238 73 7 53a 七月白Qiyuebai 44 45 18 39 1 56c 121 97 9 54c 注 不同字母表示不同品種間差異顯著 P 0 05 Note Different letters indicate significant differences at 0 05 level between different cultivars 圖6 3個抗病品種葉片下表皮表皮毛的整體與局部 Fig 6 The overall and partial of leaf lower epidermal trichomes of 3 resistant cultivars 圖7 3個感病品種葉片下表皮表皮毛整體與局部 Fig 7 The overall and partial of leaf lower epidermal trichomes of 3 susceptible cultivars 2 4 2 葉片氣孔差異 在6個試驗品種中 氣孔形態(tài)基本一致 氣孔密度最小的是抗病品種 蘇菊6號 密度為93 02 mm 2 而氣孔密度最大的是感病品種 大洋菊 密度為238 73 mm 2 蘇菊6號 病情指數(shù) 47 第1期柳麗娜 等 38個茶用菊品種苗期對黑斑病的抗性鑒定 最小 大洋菊 病情指數(shù)最大 表3 圖8 但抗病品種 滁菊 的氣孔密度與感病品種 蘇菊7號 和 七 月白 之間沒有顯著性差異 表明氣孔密度可能與 滁菊 的抗病性相關(guān)性不大 結(jié)合葉片表皮毛的分析 可知 抗病品種較感病品種具有更為密集的表皮毛和更為稀疏的氣孔 表明葉片表皮毛密度及氣孔密度 可能與茶用菊品種對黑斑病的抗性有一定的相關(guān)性 圖8 6個茶用菊品種氣孔整體形態(tài) Fig 8 Stomata overall morphology of 6 chrysanthemum for tea cultivars a c 抗病品種 蘇菊6號 蘇菊8號 滁菊 d f 感病品種 蘇菊7號 大洋菊 七月白 a c Disease resistant cultivars Suju 6 Suju 8 Chuju d f Disease susceptible cultivars Suju 7 Dayangju Qiyuebai 3 討論與結(jié)論 3 1 茶用菊黑斑病菌分離與鑒定 形態(tài)學(xué)鑒定是真菌分類鑒定中應(yīng)用最早且直觀的方法 在半知菌群體中 鏈格孢菌屬級特征明顯 形 態(tài)學(xué)分類主要依據(jù)分生孢子的形狀 大小 表面紋飾 著生方式 喙的特征 并輔助以菌絲 菌落 次生代謝 產(chǎn)物等特征 18 鏈格孢屬真菌的培養(yǎng)特性 孢子及菌落特征 易受環(huán)境條件 光 溫度和濕度等 和培養(yǎng) 條件 培養(yǎng)基質(zhì)等 的影響而發(fā)生變異 影響種級鑒定的準(zhǔn)確性 目前已經(jīng)在鴨梨 19 茶樹 20 萵筍 21 及 高粱 22 等物種上通過rDNA ITS序列進(jìn)行了鏈格孢葉斑病的病原鑒定 Loganathan等 23 從番茄早疫病病 株上分離純化了17種鏈格孢屬真菌 通過形態(tài)觀察結(jié)合rDNA ITS序列鑒定 確定有12個菌株與 A alternata JX993756 同源 5個菌株與A solani JF796068 同源 金程凡 24 對分離自油菜的黑斑病菌 FY73QF QI進(jìn)行了rDNA ITS序列鑒定 系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示其與Alternaria brassicae JN108907 1 聚為同一 支 本研究基于病原菌rDNA ITS段片長度適中 高等真菌小于1 000 bp 具保守性且在屬種水平上具有 特異性的特點 鑒定 福白菊 黑斑病病原菌為交鏈格孢菌 A alternata 這是首次發(fā)現(xiàn)交鏈格孢菌能夠引 起菊花黑斑病 與許高娟 7 分離鑒定的地被菊黑斑病病原菌極細(xì)鏈格孢菌 A tenuissima 不同 3 2 茶用菊對黑斑病的抗性鑒定 目前已報道的植物黑斑病抗性鑒定方法有 菌塊貼接法 菌絲液涂抹法 孢子懸浮液噴霧法 陳出 新 25 在梨品種資源黑斑病抗性鑒定和抗病種質(zhì)資源篩選時 將病菌餅接種于刺破的離體葉片和果皮上 最終從葉片與果皮2個角度篩選出不同比例的抗 感品種 劉東等 26 采用孢子懸浮液噴霧接種法 對50 份黃瓜種質(zhì)資源進(jìn)行了苗期黑斑病抗性鑒定 篩選出3份高抗材料 本研究采用人工涂抹菌絲接種法進(jìn) 行抗性鑒定 相比于孢子懸浮液噴霧接種法 縮小了接種范圍 固定了接種菌絲量 套袋控制了發(fā)病條件并 且對特定葉位葉片接種 避免噴霧不均勻 孢子萌發(fā)條件不好控制 易受外界環(huán)境影響 統(tǒng)計工作量大等 缺點 3 3 葉片表皮毛及氣孔與抗性相關(guān) 作為植物最外層的天然屏障 表皮毛對植物起著重要的保護(hù)作用 本研究結(jié)果表明 抗病茶用菊品種 表皮毛密度普遍大于感病品種 推測濃密的表皮毛是菌絲接觸浸染部位的物理阻隔 使其無法產(chǎn)生附著結(jié) 構(gòu) 從而延緩菌絲入侵 這與翟艷霞等 27 和李淼等 28 的研究結(jié)果一致 但也有研究指出 擬南芥表皮毛 57 南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 學(xué) 報第44卷 有利于真菌孢子和菌絲的吸附 在一定程度上增加了感病性 29 還有研究表明 大豆灰斑病抗 感品種葉 片的茸毛密度并沒有差異 30 綜上所述 表皮毛與植物抗病性相關(guān) 但在不同物種中存在差異 可能與物 種自身結(jié)構(gòu)特征 病原菌種類及主要入侵方式有關(guān) 氣孔也是病原菌入侵植物獲取營養(yǎng)的重要通道 本研究結(jié)果顯示 茶用菊典型抗病品種葉片下表皮 氣孔密度顯著小