基金項(xiàng)目 國家自然科學(xué)基金 31960286 云南省教育廳科學(xué)研究基金 2019J0050 收稿日期 2020 03 12 接受日期 2020 04 22 溫室白粉虱觸角轉(zhuǎn)錄組分析及嗅覺相關(guān)基因的鑒 定 蔡賽波 1 2 尹朝坤 3 張蔓 1 2 林連兵 1 2 張棋麟 1 2 1 昆 明 理 工 大 學(xué) 生 命 科 學(xué) 與 技 術(shù) 學(xué) 院 昆 明650500 2 云 南 省 高 校 飼 用 抗 生 素 替 代 技 術(shù) 工 程 研 究 中 心 昆 明650500 3 常 州 工 學(xué) 院 電 氣 信 息工程學(xué)院 常州213032 通訊作者 zhangql 摘 要 溫 室 白 粉 虱 Trialeurodes vaporariorum 具 有 多 食 性 寄 主 范 圍 廣 泛 等 特 點(diǎn) 是 一 種 世 界 性 的 溫 室 害 蟲 防 治 難 度 極 大 觸 角 是 昆 蟲 信 息 交 流 的 重 要 器 官 其 中 的 嗅 覺 相 關(guān) 基 因 是 調(diào) 控 昆 蟲 取 食 行 為 的 重 要 分 子 基 礎(chǔ) 然 而 迄 今 為 止 對(duì) 溫 室 白 粉 虱 觸 角 基 因 數(shù) 據(jù) 還 鮮 有 報(bào) 道 對(duì) 主 要 嗅 覺 相 關(guān) 基 因 的 數(shù) 量 和 類 型 還 知 之 甚 少 本 研 究 旨 在 建 立 溫 室 白 粉 虱 觸 角 轉(zhuǎn) 錄 組 數(shù) 據(jù) 庫 并 調(diào) 查 觸 角 中 嗅 覺 相 關(guān) 蛋 白 編 碼 基 因 數(shù) 量 以 溫 室 白 粉 虱 成 蟲 觸 角 為 材 料 利 用 高 通 量 測(cè) 序 平 臺(tái)IlluminaHiSeq4000 對(duì) 其 進(jìn) 行 轉(zhuǎn) 錄 組 測(cè) 序 并 進(jìn) 行 生 物 信 息 學(xué) 分 析 通 過 測(cè) 序 組 裝 得 到32 890 個(gè)unigenes 平 均 長 度1 616 bp N50 為3 059 bp 其 中14 206 個(gè)unigenes 長 度 大 于1000bp 通 過 與 基 因 功 能 數(shù) 據(jù) 庫 注 釋 其 中17846 個(gè)unigenes 獲 得 功 能 注 釋 信 息 其 中 與 非 冗 余 蛋 白 數(shù) 據(jù) 庫 non redundantproteinsequencedatabase NR 數(shù) 據(jù) 庫 比 對(duì) 到 最 多 的 序 列 占 所 有 注 釋unigenes 的88 77 與 煙 粉 虱 Bemisia tabaci 基 因 注 釋 到 的 序 列 最 多 占NR 注 釋 unigenes 的87 12 GO 數(shù) 據(jù) 庫 比 對(duì) 發(fā) 現(xiàn) 溫 室 白 粉 虱 觸 角 轉(zhuǎn) 錄 組unigenes 功 能 可 分 為3 大 類54 個(gè) 亞 類 其 中 參 與 代 謝 進(jìn) 程 以 及 催 化 活 性 的unigenes 比 例 較 大 KEGG 數(shù) 據(jù) 庫 注 釋 結(jié) 果 顯 示 5964 條unigenes 中 注 釋 到228 個(gè) 代 謝 通 路 其 中 包 含unigenes 最 多 的 代 謝 通 路 為 核 糖 體 為189 條 進(jìn) 一 步 基 于 基 因 注 釋 信 息 鑒 定 到33 個(gè) 溫 室 白 粉 虱 嗅 覺 相 關(guān) 蛋 白 編 碼 基 因 包 括 氣 味 結(jié) 合 蛋 白 odorant binding proteins OBPs 編 碼 基 因21 個(gè) 化 學(xué) 感 受 蛋 白 chemosensory proteins CSPs 編 碼 基 因5 個(gè) 嗅 覺 受 體 olfactory receptors OLRs 編 碼 基 因2 個(gè) 氣 味 受 體 odorant receptors ORs 編 碼 基 因3 個(gè) 離 子 型 受 體 ionotropic receptors IRs 編 碼 基 因1 個(gè) 感 覺 神 經(jīng) 元 膜 蛋 白 sensoryneuronmembraneproteins SNMPs 編 碼 基 因1 個(gè) 本 研 究 獲 得 了 溫 室 白 粉 虱 成 蟲 觸 角 轉(zhuǎn) 錄 組 數(shù) 據(jù) 初 步 闡 明 了 溫 室 白 粉 虱 觸 角 轉(zhuǎn) 錄 組 的 特 征 并 挖 掘 了 嗅 覺 相 關(guān) 蛋 白 編 碼 基 因 為 進(jìn) 一 步 從 分 子 水 平 開 展 溫 室 白 粉 虱 行 為 調(diào) 控 及 防 治 新 策 略 的 研 究 提 供 參 考 同 時(shí) 也 豐 富園藝害蟲基因數(shù)據(jù)庫 關(guān)鍵詞 溫室白粉虱 觸角轉(zhuǎn)錄組 基因注釋 嗅覺相關(guān)基因 氣味結(jié)合蛋白 中圖分類號(hào) S436 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A Analysis of the Antennal Transcriptome and Identification of Olfaction relatedGenesof Trialeurodes vaporarioru m CAISai Bo 1 2 YINChao Kun 3 ZHANGMan 1 2 LINLian Bing 1 2 ZHANGQi Lin 1 2 1 Faculty of Life Science and Technology Kunming University of Science and Technology Kunming 650500 China 2 Engineering Research Center for Replacement Technology of Feed Antibiotics of Yunnan College Kunming 650500 China 3 School of Electrical and Information Engineering ChangzhouInstituteofTechnology Changzhou213032 China Correspondingauthor zhangql Abstract Trialeurodes vap orariorum is a worldwide pest with the characteristics of multi feeding and wide Online system http www jabiotech org 農(nóng) 業(yè) 生 物 技 術(shù) 學(xué) 報(bào) J o u r n a l o f A g r i c u l t u r a l B i o t e c h n o l o g y 2020 28 11 2048 2060 DOI 10 3969 j issn 1674 7968 2020 11 014 溫 室 白 粉 虱 Trialeurodes vaporariorum 隸 屬 半 翅 目 Hemiptera 粉 虱 科 Aleyrodidae 是 主 要 的 園 藝 害 蟲 之 一 Brown 1994 Jones 2003 其 寄 主 廣 泛 主 要 從 韌 皮 部 吸 食 植 物 汁 液 使 得 葉 面 發(fā) 黃 影 響 光 合 作 用 阻 礙 植 物 生 長 與 此 同 時(shí) 大 量 分 泌 蜜 露 污 染 葉 片 表 面 傳 播 煤 污 病 等 真 菌 病 害 及 病 毒 病 嚴(yán) 重 影 響 蔬 菜 的 品 質(zhì) 與 產(chǎn) 量 Brown 1994 Jones 2003 迄 今 為 止 農(nóng) 業(yè) 生 產(chǎn) 中 主 要 使 用 化 學(xué) 農(nóng) 藥 對(duì) 溫 室 白 粉 虱 進(jìn) 行 殺 滅 但 因 其 耐 藥 性 強(qiáng) 且 隱 蔽 性 好 使 得 防 治 難 度 較 大 Gorman et al 2007 近 十 年 來 針 對(duì) 粉 虱 科 昆 蟲 主 要 是 煙 粉 虱 Bemisia tabaci 及 溫 室 白 粉 虱 的 轉(zhuǎn) 錄 組 學(xué) 研 究 集 中 于 對(duì) 其 耐 藥 性 發(fā) 育 和 天 敵 寄 生 相 關(guān) 基 因 的 挖 掘 和 分 子 調(diào) 控 機(jī) 制 形 成 的 解 析 王 書 平 等 2016 例 如 Kevin 等 2011 通 過 測(cè) 序 溫 室 白 粉 虱 成 蟲 轉(zhuǎn) 錄 組 從 中 共 鑒 定 到 57 個(gè) 細(xì) 胞 色 素 C450 cytochrome P450s CYP450s 基 因 17 個(gè) 抗 氧 化 劑 谷 胱 甘 肽S 轉(zhuǎn) 移 酶 glutathione S transferase GSTs 和27 個(gè) 羧 酸 酯 酶 carboxyl cholinesterases CCEs 基 因 這 些 基 因 均 與 昆 蟲 抗 藥 性 相 關(guān) 涉 及 昆 蟲 的 解 毒 功 能 進(jìn) 一 步 揭 示 了 溫 室 白 粉 虱 殺 蟲 劑 耐 藥 性 的 分 子 機(jī) 制 此 外 Wang 等 2016 通 過 轉(zhuǎn) 錄 組 深 度 測(cè) 序 鑒 定 了 煙 粉 虱 若 蟲 被 淺 黃 恩 蚜 小 蜂 Encarsia sophia 寄 生 過 程 中 的 高 表 達(dá) 及 特 異 表 達(dá) 基 因 并 進(jìn) 一 步 根 據(jù) 這 些 基 因 的 生 物 學(xué) 功 能 探 討 了 煙 粉 虱 若 蟲 在 基 因 表 達(dá) 水 平 對(duì) 天 敵 寄 生 的 響 應(yīng) 和 防 御 過 程 中 的 分 子 調(diào) 控 機(jī)制 昆 蟲 個(gè) 體 間 的 相 互 協(xié) 作 主 要 依 靠 信 息 交 流 來 完 成 信 息 交 流 能 夠 提 高 昆 蟲 求 偶 交 配 及 產(chǎn) 卵 的 能 力 對(duì) 維 持 昆 蟲 種 群 大 小 具 有 重 要 作 用 Field et al 2001 Zhang et al 2015 Gadenne et al 2016 觸 角 對(duì) 昆 蟲 適 應(yīng) 環(huán) 境 與 種 族 發(fā) 展 具 有 重 要 的 作 用 是 信 息 交 流 的 重 要 組 成 部 分 Brownetal 2013 鄭 海 霞 等 2018 昆 蟲 觸 角 的 嗅 覺 系 統(tǒng) 擁 有 一 套 高 hostrange Antennaeisanimportantorganforinsectinformationexchange anditsolfaction relatedgenesare an important molecular basis for regulating insect feeding behavior However to date there are few reports about gene data of T vaporariorum antennae and little is known about the number and type of primary olfaction related genes The purpose of this study is to establish a transcriptomic database of T vaporariorum antennae and to investigate the number of genes encoding olfaction related proteins The antennal transcriptomes of adult T vaporariorum were sequenced using Illumina HiSeq 4000 platform and bioinformaticanalyses were conducted In this study 32 890 unigenes were obtainedthrough assemblingafter transcriptome sequencing with mean length of 1 616 bp and an N50 value of 3 059 bp and 14 206 unigenes over 1 000 bp in size After annotating for unigenes in gene function database 17 846 unigenes obtained functional annotation information Sequences searched into NR database non redundant protein sequence database accounted for 88 77 of all annotated unigenes most of which was optimally hit to genes of Bemisia tabaci 87 12 species AnnotatedresultsinGO databaseshowedthatunigenesweredividedinto54 subcategories included into 3 categories and a lot of unigenes were annotated to be associated with metabolic process and catalytic activity In KEGG database 5 964 unigenes were annotated in 228 metabolic pathways Among them most unigenes 189 were involved in metabolic pathways of ribosome Based on further annotated information of unigenes 33 genes encoding olfaction related proteins of T vaporariorum including 21genesencodingodorantbindingproteins OBPs 5genesencodingchemosensoryproteins CSPs 2genes encoding olfactory receptor proteins OLRs 3 genes encoding odorant receptor proteins ORs 1 gene encoding ionotropic receptor protein IR and 1 gene encoding sensory neuron membrane protein SNMP This study obtained the antennal transcriptomic data of adult T vaporariorum its characteristics were preliminarily elucidated as well as genes encoding olfaction related proteins were identified This result provides a reference for further investigation on behavior regulation and new control strategies of T vaporariorumatmolecularlevels andalsoenrichesthegenedatabaseofhorticulturalpests Keywords Trialeurodes vaporariorum Antennal transcriptome Gene annotation Olfaction related genes Odorant bindingproteins 溫室白粉虱觸角轉(zhuǎn)錄組分析及嗅覺 相關(guān)基因的鑒定 AnalysisoftheAntennalTranscriptomeandIdentificationofOlfaction relatedGenesof Trialeurodes vaporariorum 2049 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào) JournalofAgriculturalBiotechnology 度 專 一 且 極 其 敏 感 的 化 學(xué) 感 受 器 可 以 通 過 識(shí) 別 環(huán) 境 中 的 化 學(xué) 氣 味 分 子 進(jìn) 而 調(diào) 控 昆 蟲 的 行 為 鞏 中 軍 等 2008 研 究 表 明 有 多 種 嗅 覺 相 關(guān) 蛋 白 參 與 了 嗅 覺 識(shí) 別 過 程 主 要 有 氣 味 結(jié) 合 蛋 白 odorant binding proteins OBPs 氣 味 降 解 酶 odor degrad ing enzymes ODEs 嗅 覺 受 體 olfactory receptors OLRs 氣 味 受 體 odorant receptor ORs 化 學(xué) 感 受 蛋 白 chemosensory proteins CSPs 以 及 感 覺 神 經(jīng) 元 膜 蛋 白 sensory neuron membrane proteins SNMPs 及 離 子 型 受 體 ionotropic receptors IRs 等 Benton et al 2009 Pelosi et al 2014 Zhang et al 2016 Wang et al 2017 由 于 嗅 覺 相 關(guān) 蛋 白 的 種 類 眾 多 功 能 多 樣 性 高 李 衛(wèi) 華 等 2006 故 首 先 需 要 調(diào) 查 其 類 型 和 數(shù) 量 以 此 為 基 礎(chǔ) 深 入 研 究 嗅 覺 相 關(guān) 蛋 白 如 何 調(diào) 控 昆 蟲 取 食 行 為 李 衛(wèi) 華 等 2006 近 十 年 來 高 通 量 測(cè) 序 技 術(shù) 有 力 地 推 動(dòng) 了 昆 蟲 轉(zhuǎn) 錄 組 學(xué) 的 研 究 張 棋 麟 袁 明 龍 2013 包 括 基 于 昆 蟲 觸 角 轉(zhuǎn) 錄 組 測(cè) 序 的 嗅 覺 相 關(guān) 基 因 鑒 定 例 如 Zhou 等 2014 對(duì) 褐 飛 虱 Nilaparvata lugens 觸 角 進(jìn) 行 轉(zhuǎn) 錄 組 測(cè) 序 分 析 注 釋 到21 個(gè) 嗅 覺 相 關(guān) 蛋 白 編 碼 基 因 Wu 等 2017 對(duì) 荔 枝 椿 象 Tessaratoma papillosa 觸 角 轉(zhuǎn) 錄 組 進(jìn) 行 測(cè) 序 并 從 中 鑒 定 出59 個(gè)ORs 編 碼 基 因 14 個(gè)IRs 編 碼 基 因 和33 個(gè)OBPs 編 碼 基 因 這 些 成 果 為 深 入 研 究 昆 蟲 嗅 覺 感 受 機(jī) 制 提 供 了 參 考 目 前 人 們 對(duì) 溫 室 白 粉 虱 觸 角 轉(zhuǎn) 錄 組 和 其 中 嗅 覺 相 關(guān) 基 因 的 類 型 和 數(shù) 目 還 知 之 甚 少 深 入 研 究 溫 室 白 粉 虱 的 嗅 覺 系 統(tǒng) 有 助 于 闡 明 其 尋 找 寄 主 植 物 過 程 中 嗅 覺 是 如 何 發(fā) 揮 作 用 的 了 解 嗅 覺 相 關(guān) 蛋 白 調(diào) 控 溫 室 白 粉 虱 行 為 的 分 子 機(jī) 制 而 探 討 溫 室 白 粉 虱 嗅 覺 相 關(guān) 基 因 的 類 型 和 數(shù) 量 是 開 展 分 子 機(jī) 制 方 面 研 究 的 前 提 為 了 獲 得 溫 室 白 粉 虱 的 觸 角 轉(zhuǎn) 錄 組 資 源 發(fā) 掘 溫 室 白 粉 虱 嗅 覺 相 關(guān) 功 能 基 因 本 研 究 擬 采 用 高 通 量 測(cè) 序 技 術(shù) 對(duì) 溫 室 白 粉 虱 成 蟲 觸 角 進(jìn) 行 轉(zhuǎn) 錄 組 測(cè) 序 和 基 因 功 能 注 釋 挖 掘 溫 室 白 粉 虱 觸 角 中 嗅 覺 相 關(guān) 基 因 以 期 為 其 嗅 覺 分 子 機(jī) 制 的 探索提供信息 1 材料與方法 1 1 供試?yán)?蟲 溫 室 白 粉 虱 Trialeurodes vaporariorum 成 蟲 采 自 云 南 省 楚 雄 州 元 謀 縣 黃 瓜 園 鎮(zhèn) 小 丙 嶺 科 技 園 的 番 茄 Solanum lycopersicum 溫 室 大 棚 帶 回 實(shí) 驗(yàn) 室 后 采 用 形 態(tài) 學(xué) 結(jié) 合 細(xì) 胞 色 素C 氧 化 酶 亞 基1 cyto chrome c oxidase subunit 1 CO 分 子 標(biāo) 記 對(duì) 其 種 類 進(jìn) 行 確 認(rèn) 隨 機(jī) 選 取 活 力 充 沛 的 成 蟲400 頭 作 為 實(shí) 驗(yàn) 用 蟲 分 別 將 其 觸 角 剪 下 混 合 后 置 于 液 氮 速 凍 并 保 存 于 80 待 用 觸 角 樣 品 獨(dú) 立 收 集 了2 次 用 于 后 續(xù) 構(gòu) 建2 個(gè) 轉(zhuǎn) 錄 組 測(cè) 序 文 庫 擴(kuò) 大 轉(zhuǎn) 錄 組 測(cè) 序 數(shù) 據(jù) 量 和 測(cè) 序 覆 蓋 深 度 以 盡 可 能 檢 測(cè) 到 低 表 達(dá)豐度基因及去除高雜合度導(dǎo)致的堿基異質(zhì)性 1 2 總 RNA 的提取及檢測(cè) 采 用RNeasy Mini Kit Qiagen 德 國 試 劑 盒 對(duì) 供 試 溫 室 白 粉 虱 成 蟲 的 觸 角 進(jìn) 行 總RNA 提 取 并 于NanoDrop1000 微 量 紫 外 可 見 分 光 光 度 計(jì) Ther moScientific 美 國 檢 測(cè) 總RNA 的 純 度 及 濃 度 最 后 使 用Qubit 2 0 熒 光 光 度 計(jì) Thermo Scientific 美 國 精 確 定 量RNA 濃 度 并 用2100Bioanalyzer Ag ilent 美 國 精 檢 檢 測(cè)RNA 的 完 整 性 以 保 證 樣 品 合 格用于后續(xù)高通量測(cè)序 1 3 cDNA 文庫構(gòu)建與測(cè)序 樣 品 檢 測(cè) 合 格 后 使 用 帶 有Oligo dT 的 磁 珠 富 集 總RNA 中 的mRNA 然 后 用fragmentationbuf fer NEB 英 國 以 片 段 化 的mRNA 為 模 版 隨 機(jī) 六 堿 基 核 苷 酸 為 引 物 在 莫 洛 尼 氏 鼠 白 血 病 病 毒 Moloney m urine leukemia virus M MuLV 逆 轉(zhuǎn) 錄 酶 體 系 中 合 成cDNA 第1 條 鏈 隨 后 用RNaseH 降 解 RNA 鏈 并 在DNApolymerase 體 系 下 以dNTPs 為 原 料 合 成cDNA 第2 條 鏈 純 化 后 的 雙 鏈cDNA 經(jīng) 過 末 端 修 復(fù) 經(jīng) 過 末 端 修 復(fù) 加A 尾 并 連 接 測(cè) 序 接 頭 用AMPure XPbeads 選 擇 目 標(biāo) 大 小 的 片 段 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增最 終獲得 文庫 為確保 文庫質(zhì) 量 采 用Qubit2 0 熒 光 光 度 計(jì) ThermoScientific 美 國 檢 測(cè) PCR 產(chǎn) 物 濃 度 用 Agilent 2100 Bioanalyzer Agilent 美 國 和ABI StepOnePlus Real Time PCR System AppliedBiosystems 美 國 對(duì) 構(gòu) 建 好 的 文 庫 進(jìn) 行 質(zhì) 檢 文 庫 檢 測(cè) 合 格 后 將 其 提 交 至 HiSeq4000 Illumina 美 國 測(cè) 序 平 臺(tái) 進(jìn) 行 每 端150 bp 長 度 的 雙 端 測(cè) 序 于 北 京 諾 禾 致 源 生 物 科 技 有 限公司構(gòu)建2 個(gè)獨(dú)立測(cè)序文庫且分別完成測(cè)序 1 4 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的組裝與完整性評(píng)估 采 用Trimmomaticv0 39 Bolgeretal 2014 軟 2050 件 分 別 對(duì)2 個(gè) 文 庫 測(cè) 序 得 到 的 原 始 數(shù) 據(jù) raw data 進(jìn) 行 過 濾 以 獲 得 高 質(zhì) 量 的 原 始 數(shù) 據(jù) cleandata 具 體 標(biāo) 準(zhǔn) 為 1 去 除 包 含 接 頭 的reads 2 去 除 未 知 堿 基N 含 量 大 于5 的reads 3 去 除 低 質(zhì) 量 的reads 將2 個(gè) 文 庫 測(cè) 序 獲 得 的 轉(zhuǎn) 錄 組 數(shù) 據(jù) 過 濾 后 進(jìn) 行 合 并 利 用Trinity 軟 件 Haas et al 2013 對(duì) 過 濾 后 的 數(shù) 據(jù) 進(jìn) 行 拼 接 與 組 裝 然 后 去 除 長 度 小 于150bp 的 序 列 并 通 過CD HIT 軟 件 包 Li Godzik 2006 中 的 CD HIT EST 子 程 序 對(duì) Unigenes 進(jìn) 行 聚 類 95 的 相 似 性 作 為 閾 值 并 于 聚 類 簇 中 選 取 最 長 的1 條 序 列 為 每 一 個(gè) 聚 類 簇 的 代 表 以 去 除 序 列 冗 余 獲 得 高 質(zhì) 量 的 溫 室 白 粉 虱 觸 角 轉(zhuǎn) 錄 組unigenes 集 為 了 評(píng) 估 轉(zhuǎn) 錄 組 組 裝 質(zhì) 量 采 用 BUSCO Benchmarking Universal Single Copy Orthologs v3 軟 件 Simaoetal 2015 于 默 認(rèn) 參 數(shù) 下 將 最 終 組 裝 獲 得 的unigenes 通 過 與insecta odb9 數(shù) 據(jù) 庫 https busco ezlab org 1658 個(gè) 昆 蟲 進(jìn) 化 保 守 的 直 系 同 源 基因進(jìn)行比較 檢測(cè)每條unigene 序列的完整性 1 5 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析及嗅覺相關(guān)基因鑒定 將 組 裝 得 到 的unigenes 使 用 本 地Blastx 軟 件 分 別 與NCBI 非 冗 余 蛋 白 數(shù) 據(jù) 庫 non redundant protein sequence database NR ftp ftp ncbi nih gov blast db 真 核 生 物 蛋 白 相 鄰 類 的 聚 簇 clusters of orthologous groups for eukaryotic complete ge nomes KOG https ftp ncbi nih gov pub COG KOG 瑞 士 蛋 白 數(shù) 據(jù) 庫 Swiss Prot https www uniprot org downloads 蛋 白 質(zhì) 家 族 數(shù) 據(jù) 庫 PFAM http pfam xfam org 和 京 都 基 因 與 基 因 組 百 科 全 書 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes KEGG https www kegg jp 等 數(shù) 據(jù) 庫 進(jìn) 行 比 對(duì) E 值 1 10 5 獲 得unigene 在 每 一 個(gè) 數(shù) 據(jù) 庫 中 的 注 釋 信 息 基 于NR 注 釋 信 息 提 取 每 個(gè)unigene 對(duì) 應(yīng) 應(yīng) 的 基 因 本 體 論 注 釋 信 息 Gene Ontology GO 功 能 注 釋 并 根 據(jù)GO 數(shù) 據(jù) 庫 中 功 能 注 釋 信 息 的 分 類 unigene 歸 類 到3 個(gè) 亞 類 生 物 學(xué) 過 程 細(xì) 胞 組 分 和 分 子 功 能 利 用COG 數(shù) 據(jù) 庫 注 釋 信 息 對(duì) 直 系 同 源 蛋 白 家 族 進(jìn) 行 功 能 分 類 KEGG 注 釋 以 呈 現(xiàn)unige ne 所 參 與 的 代 謝 通 路 最 后 根 據(jù) 前 述 獲 得 的NR 數(shù) 據(jù) 庫 中 最 佳 比 對(duì) 基 因 注 釋 信 息 基 因 功 能 描 述 和 簡(jiǎn) 寫 提 取 鑒 定 注 釋 到 的 嗅 覺 相 關(guān) 基 因 并 根 據(jù) 得 到 的 注 釋 信 息 對(duì) 嗅 覺 相 關(guān) 基 因 進(jìn) 行 命 名 值 得 注 意 的 是 如 不 同unigenes 擁 有 完 全 一 致 的NR 注 釋 信 息 則 這 些unigenes 序 列 均 作 為 同 一 類 基 因 的 不同拷貝 以納入該基因的數(shù)目 1 6 溫 室 白 粉 虱 氣 味 結(jié) 合 蛋 白 基 因 系 統(tǒng) 發(fā) 育 樹 構(gòu)建 煙 粉 虱 Bemisia tabaci 褐 飛 虱 長 紅 錐 蝽 Rho dnius prolixus 柑 桔 木 虱 Diaphorina citri 和 豌 豆 蚜 Acyrthosiphon pisum 為5 個(gè) 隸 屬 半 翅 目 具 有 相 對(duì) 完 整 且 可 用 的 全 基 因 組 信 息 與 溫 室 白 粉 虱 親 緣 關(guān) 系 近 的 物 種 為 了 比 較 溫 室 白 粉 虱 觸 角 中 候 選 氣 味 結(jié) 合 蛋 白OBPs 編 碼 基 因 與 半 翅 目 其 他 昆 蟲OB Ps 編 碼 基 因 的 近 源 關(guān) 系 和 類 型 分 布 首 先 從NCBI 基 因 組 數(shù) 據(jù) 庫 中 下 載5 個(gè) 物 種 的 全 基 因 組 氨 基 酸 序 列 集 然 后 利 用 本 地Blastp 軟 件 將 基 因 組 氨 基 酸 序 列 集 同NR 數(shù) 據(jù) 庫 注 釋 獲 取 每 一 條 氨 基 酸 序 列 的 注 釋 信 息 并 提 取 氣 味 結(jié) 合 蛋 白OBPs 氨 基 酸 序 列 如 每 種 昆 蟲 多 條 氨 基 酸 序 列 注 釋 到 同 一 個(gè) 基 因 則 保 留 最 長 的 序 列 作 為 該 基 因 代 表 如 此 可 保 證 在 目 標(biāo) 昆 蟲 全 基 因 組 中 充 分 鑒 定OBPs 避 免 基 于OBPs 序 列BLAST 相 似 性 比 對(duì) 查 找 方 法 引 起 的 基 因 缺 失 鑒 定 出 的OBPs 結(jié) 合 其 特 有 的 結(jié) 構(gòu) 模 式 進(jìn) 一 步 確 認(rèn) 杜 迎 剛 等 2019 Zhouetal 2008 即 確 認(rèn) 其 對(duì) 應(yīng) 氨 基 酸 序 列 符 合 C ys X 20 66 C ys X 3 C ys X 21 43 C ys X 8 14 C ys X 8 C ys C ys X 15 39 C ys X 3 C ys X 21 44 C ys X 7 12 C ys X 8 C ys 或 X 22 68 C ys X 25 68 C ys X 3 C ys X 31 46 C ys X 8 29 C ys X 8 9 C ys X 5 71 OBPs 的 結(jié) 構(gòu) 特 點(diǎn) 最 后 利 用 MEGA 6 0 軟 件 Tamura et al 2013 采 用 鄰 接 法 在 默 認(rèn) 參 數(shù) 下 構(gòu) 建 溫 室 白 粉 虱 及5 個(gè) 近 源 物 種 間 的OBPs 編 碼 基 因 系 統(tǒng) 發(fā) 育 樹 Bootstrap 1000 2 結(jié)果與分析 2 1 溫室白粉虱觸角轉(zhuǎn)錄組序列分析與組 裝 測(cè) 序 兩 個(gè) 溫 室 白 粉 虱 觸 角 轉(zhuǎn) 錄 組 分 別 獲 得 了 41230744 和50791992 條rawreads 兩 個(gè) 測(cè) 序 文 庫的 原始 數(shù)據(jù) 集已 釋放 到NCBI 序列 讀長 存檔 數(shù)據(jù) 庫 sequence read archive SRA 登 錄 號(hào) 分 別 為 SRR11452002 和SRR11452003 共 計(jì) 約13 80 Gb 接 頭 序 列 以 及 低 質(zhì) 量 的reads 與ploy N 被 過 濾 后 最 終 得 到39617486 和49559418 條 的cleanreads 有 效 數(shù) 據(jù) 比 例 均 在96 以 上 兩 個(gè) 測(cè) 序 文 庫 獲 得 數(shù) 據(jù) 的GC 含 量 分 別 為41 51 和41 32 Q 20 比 例 溫室白粉虱觸角轉(zhuǎn)錄組分析及嗅覺 相關(guān)基因的鑒定 AnalysisoftheAntennalTranscriptomeandIdentificationofOlfaction relatedGenesof Trialeurodes vaporariorum 2051 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào) JournalofAgriculturalBiotechnology 質(zhì) 量 值 20 的 堿 基 所 占 百 分 比 均 高 于96 Q 30 比 例 質(zhì) 量 值 30 的 堿 基 所 占 百 分 比 均 高 于91 將 兩 個(gè) 測(cè) 序 文 庫 獲 得 的 高 質(zhì) 量 數(shù) 據(jù) 混 合 后 共 計(jì) 得 到 13 37Gb 的數(shù)據(jù)集混池 直接用于轉(zhuǎn)錄組的組裝 對(duì)clean reads 序 列 進(jìn) 行 拼 接 組 裝 后 獲 得74 082 條 轉(zhuǎn) 錄 本 總 長 度 為125 498 245 bp 平 均 長 度 為1694bp N 50 長 度 為3040bp 對(duì) 轉(zhuǎn) 錄 本 進(jìn) 一 步 聚 類 和 去 冗 余 最 終 獲 得32 995 條unigenes 平 均 長 度 與 N 50 分 別 為1 616 與3 059 bp 所 有unige nes 序 列 集 已 提 交 至NCBI 的 轉(zhuǎn) 錄 組 組 裝 數(shù) 據(jù) 集 transcriptome shotgun assembly TSA 登 錄 號(hào) 為 GILL00000000 轉(zhuǎn) 錄 組 長 度 分 布 結(jié) 果 顯 示 300 500bp 序 列 所 占 比 例 最 高 占30 69 圖1 大 于1 kb 的unigenes 為14 306 條 占43 36 BUSCO 分 析 結(jié) 果 顯 示91 7 的unigenes 為 完 整 基 因 2 0 是 部 分 片 段 其 余unigenes 無 比 對(duì) 結(jié) 果 Unigenes 集 的NR 注 釋 信 息 已 釋 放 到 數(shù) 據(jù) 共 享 平 臺(tái)Figshare https doi org 10 6084 m9 figshare 12084 6 33 v1 供直接下載使 用 2 2 溫室白粉虱觸角轉(zhuǎn)錄組基因功能注釋 Unigenes 通 過 與 NR NT KEGG KOG PFAM Swiss prot 等 數(shù) 據(jù) 庫 進(jìn) 行 比 對(duì) 注 釋 共 有17 846 條 獲 得 注 釋 信 息 占unigenes 總 數(shù) 的54 09 NR 數(shù) 據(jù) 庫 中 注 釋 到 的unigene 數(shù) 量 最 多 為15842 占48 17 其 次 為GO 12 266 37 29 PFAM 11 923 36 25 Swiss Prot 10 560 32 11 KOG 6 631 20 16 和KEGG 5 964 18 13 與NR 數(shù) 據(jù) 庫 比 對(duì) 溫 室 白 粉 虱 觸 角 轉(zhuǎn) 錄 組 與 其 他 物 種 注 釋 成 功 的 相 似 的 基 因 序 列 共15 842 條 物 種 分 布 圖 所 示 溫 室 白 粉 虱unigene 序 列 與 煙 粉 虱 相 似 度 最 高 為 87 12 其 次 為 Cryptotermes secundus 1 26 褐 飛 虱 1 04 內(nèi) 華 達(dá) 古 白 蟻 Zootermop sis nevadensis 0 66 黑 蟻 Lasius niger 0 47 其 他 9 45 圖2 2 3 Unigene s 的功能分 析 基 于 G O 數(shù) 據(jù) 庫 對(duì) 溫 室 白 粉 虱 的 12 266 條 unigene 進(jìn) 行 功 能 分 類 統(tǒng) 計(jì) 圖 3 總 共 得 到 229 096 Cryptotermes secundus 煙粉虱 Bemisia tabaci 褐飛虱 Bemisia tabaci 內(nèi)華達(dá)古白蟻 Bemisia tabaci 黑蟻 Lasius niger 其他Others 0 66 1 04 1 26 0 47 9 45 87 12 圖 2 NR 數(shù)據(jù)庫中注釋的溫室白粉虱觸角轉(zhuǎn)錄組 unigenes Figure 2 Annotated unigenes in antennal transcriptome of Trialeurodes vaporariorumi n in NR database Unigene 數(shù)量 Numberofunigene 0 2500 5000 7500 400 1000 500 600 700 800 900 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000 長度 bpLength 圖 1 溫室白粉虱觸角轉(zhuǎn)錄組 unigenes 長度分布 Figure 1 Length distribution of unigenes in the antennal transcriptome of Trialeurodes vaporariorum 2052 條