收稿日期 2019 12 24 基金項(xiàng)目 上海市科技興農(nóng)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目技術(shù)創(chuàng)新類 2019 02 08 00 08 F01119 作者簡介 余昌霞 1985 女 碩士 助理研究員 主要研究方向?yàn)槭秤镁耘?理 E mail ycx41529 163 com 通信作者 E mail 149213508 qq com 上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào) 2020 36 5 41 45 http www nyxb sh cn Acta Agriculturae Shanghai DOI 10 15955 j issn1000 3924 2020 05 08 余昌霞 李正鵬 趙妍 等 草菇液體菌種培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件的優(yōu)化 J 上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào) 2020 36 5 41 45 草菇液體菌種培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件的優(yōu)化 余昌霞 李正鵬 趙 妍 查 磊 汪 虹 楊煥玲 陳明杰 郭 倩 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所 農(nóng)業(yè)部南方食用菌資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國家食用菌 程技術(shù)研究中心 國家食用菌加 技術(shù)研發(fā)中心 上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室 上海201403 摘 要 以草菇 廠化栽培主栽品種 9715 菌株為研究對象 通過單因素及正交試驗(yàn)對草菇液體菌種的培 養(yǎng)基配方進(jìn)行優(yōu)化 在此基礎(chǔ)上 進(jìn)一步對培養(yǎng)條件 培養(yǎng)溫度 裝液 接種 轉(zhuǎn)速 進(jìn)行了優(yōu)化 結(jié)果表明 草菇9715 菌株液體菌種優(yōu)化的配方為 葡萄糖25 g L 酵母浸粉4 g L KH2PO4 1 g L MgSO4 1 g L 最佳培養(yǎng)條 件為 每250 mL搖瓶裝液 120 mL 接種 2 培養(yǎng)溫度32 轉(zhuǎn)速125 S min 關(guān)鍵詞 草菇 液體菌種 配方優(yōu)化 培養(yǎng)條件 中圖分類號 S646 13 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1000 3924 2020 05 041 05 Optimization of cultivation medium and culture conditions for liquid spawn of Volvariella volvacea YU Changxia LI Zhengpeng ZHAO Yan ZHA Lei WANG Hong YANG Huanling CHEN Mingjie GUO Qian Institute of Edible Fungi Shanghai Academy of Agricultural Sciences Key Laboratory of Edible Fungi Resources and Utilization South Ministry of Agriculture P R China National Engineering Research Center of Edible Fungi National RKey Laboratory of Agricultural Genetics and Breeding of Shanghai Shanghai 201403 China Abstract Taking the main cultivated stSain 9715 of Volvariella volvacea as the test mateSial the cultivation medium foSmula of liquid spawn was optimized by single factoS and oSthogonal expeSiments Based on the optimized cultivation media foSmulation the mycelial biomass was used as Sesponse value and the oSthogonal matSix method was applied to the optimization of liquid cultuSe conditions incubation tempeSatuSe liquid volume inoculation volume Sotation speed foS V volvacea The Sesults showed that the most suitable foSmula of the liquid spawn of the 9715 stSain was glucose 25 g L yeast extSact 4 g L KH2PO4 1 g L and MgSO4 1 g L the optimal cultuSe conditions foS the liquid spawn weSe liquid volume of 120 mL 250 mL inoculation volume of 2 incubation tempeSatuSe of 32 and Sotation speed of 125 S min Key words Volvariella volvacea Liquid spawn Optimization of cultivation medium foSmula CultuSe conditions 隨著食用菌 廠化的發(fā)展 食用菌液體菌種在 廠化 產(chǎn)中已被廣泛應(yīng)用 液體菌種因其具有 長 迅速 菌齡整齊 制種簡便 使用方便 接種點(diǎn)多 萌發(fā)和現(xiàn)蕾快 周期短等優(yōu)點(diǎn) 受到 廠化 產(chǎn)的青睞 同時(shí)可降低 產(chǎn)成本 提高產(chǎn)品質(zhì) 經(jīng)濟(jì)效益顯著 1 2 目前 液體菌種已在金針菇 3 4 杏鮑菇 5 蟹味 菇 6 等 廠化企業(yè)廣泛應(yīng)用 香菇液體菌種 7 也在逐步普及 草菇是最具中國特色的食用菌品種之一 具有較高的市場知名度 售價(jià)一直居高不下 8 其 物學(xué)特 性也顯示了它是最佳的 廠化栽培品種之一 目前 草菇產(chǎn)業(yè)將逐步往 廠化 標(biāo)準(zhǔn)化 規(guī)?；椭悄芑?的方向發(fā)展 多年來 草菇 產(chǎn)中仍采用固體制種方式 9 常規(guī)的固體菌種是采用棉籽殼菌種 經(jīng)過原 余昌霞 等 草菇液體菌種培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件的優(yōu)化 種 栽培種等復(fù)雜的 產(chǎn)環(huán)節(jié) 以及裝瓶 掏瓶 裝袋 滅菌 接種等繁瑣的程序 存在 產(chǎn)周期長 菌齡不 一致 操作不便等缺點(diǎn) 由于草菇 物學(xué)效率較低 因此需要在其制種技術(shù)和栽培技術(shù)方面進(jìn)行改進(jìn) 為適應(yīng)新形勢下的草菇產(chǎn)業(yè)大規(guī)模發(fā)展 草菇液體菌種用于草菇 廠化栽培是發(fā)展的趨勢之一 本研究 通過正交試驗(yàn)分別對草菇液體菌種培養(yǎng)基配方 培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化 為草菇液體菌種應(yīng)用于 廠化栽培 提供參考 1 材料與方法 1 1 供試菌株 草菇 V volvacea 9715 菌株由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所菌種保藏中心提供 1 2 培養(yǎng)基 固體培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基為美國BD公司 產(chǎn)的合成培養(yǎng)基 稱取39 g加水定容至1 L 用于試管和 平板培養(yǎng)菌絲 碳源篩選培養(yǎng)基 g L 碳源20 蛋白胨1 磷酸二氫鉀2 硫酸鎂0 5 供試碳源為葡萄糖 蔗糖 麥芽 糖 果糖 海藻糖 氮源篩選培養(yǎng)基 g L 氮源2 葡萄糖20 磷酸二氫鉀2 硫酸鎂0 5 供試氮源為蛋白胨 酵母浸粉 牛肉浸膏 硫酸銨 硝酸鉀 培養(yǎng)條件優(yōu)化培養(yǎng)基 g L 葡萄糖25 酵母浸粉4 磷酸二氫鉀1 硫酸鎂1 以上所有培養(yǎng)基均在121 下滅菌15 min 1 3 碳 氮源的篩選 將保存的菌種活化 即轉(zhuǎn)接至PDA平板 32 恒溫培養(yǎng)3 d可得母種 然后將活化的母種用打孔器 打孔 取一定 的菌塊經(jīng)均質(zhì)儀打碎后 接入2 以15 mm2菌塊 為1 的菌種接種 的菌液于裝有 100 mL篩選培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中 置于32 轉(zhuǎn)速150 S min搖床上振蕩培養(yǎng)5 d 收集菌絲測定菌 絲 物 每處理5 重復(fù) 1 4 液體菌種配方優(yōu)化 根據(jù)碳 氮源的單因素篩選試驗(yàn)結(jié)果 分別選取較好的碳源 氮源及KH2PO4和MgSO4 設(shè) L9 34 正交試驗(yàn) 對草菇液體菌種的培養(yǎng)基配方進(jìn)行優(yōu)化 試驗(yàn)因素及水平如表1所示 接種方法及培養(yǎng)條件 同1 3 通過測定菌絲 物 確定培養(yǎng)基的最佳配方 表1 最佳配方L9 34 正交試驗(yàn)因素水平 Table 1 Factors and levels of the L9 34 orthogonal experiment g L 1 水平因素A葡萄糖B酵母浸粉C磷酸二氫鉀 KH 2PO4 D硫酸鎂 MgSO4 1 15 1 1 0 5 2 20 2 2 1 3 25 4 4 2 1 5 液體菌種培養(yǎng)條件的確定 經(jīng)正交試驗(yàn)篩選出草菇液體菌種培養(yǎng)的最佳配方后 再對適宜配方的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化 分別選取 接種 液體裝瓶 溫度和轉(zhuǎn)速 采用L9 34 正交表確定液體菌種的最佳培養(yǎng)條件 試驗(yàn)因素及水平如 表2所示 通過測定菌絲 物 確定培養(yǎng)基的最佳配方 表2 最佳培養(yǎng)條件L9 34 正交試驗(yàn)因素水平 Table 2 Factors and levels of the L9 34 orthogonal experiment 水平因素A接種 B裝瓶 mL C溫度 D轉(zhuǎn)速 S min 1 1 1 80 30 100 2 2 100 32 125 3 5 120 34 150 1 6 生物量測定 用無紡布過濾培養(yǎng)結(jié)束的液體培養(yǎng)基中的菌絲 再用蒸餾水沖洗2 3次 收集菌絲在烘箱中 60 24 上 海 農(nóng) 業(yè) 學(xué) 報(bào) 烘 至恒重 用電子分析天平稱其 重 1 7 數(shù)據(jù)分析 測得的數(shù)據(jù)采用SPSS 19 0進(jìn)行分析 2 結(jié)果與分析 2 1 草菇液體菌種培養(yǎng)基配方的確定 2 1 1 不同碳源對草菇菌絲生長的影響 碳源是構(gòu)成細(xì)胞和代謝產(chǎn)物中碳架來源的營養(yǎng)物質(zhì) 也是 長繁殖的能 來源 為食用菌菌絲 長 提供重要的營養(yǎng) 由表3可知 草菇菌絲在5種碳源中均能 長 但以葡萄糖為碳源時(shí) 菌絲 物 達(dá)到 最高 并顯著高于其他碳源 表明葡萄糖可作為 草菇9715 菌株液體菌種的最適碳源 表3 不同碳源對草菇菌絲生長的影響 Table 3 Effect of different carbon source on the mycelial growth of V volvacea g 碳源每100 mL菌絲 物 重碳源每100 mL菌絲 物 重 葡萄糖0 146 9 0 006 7 a果糖0 054 6 0 005 4 c 蔗糖0 134 4 0 003 3 b海藻糖0 136 5 0 006 9 b 麥芽糖0 053 1 0 003 1 c 注 數(shù)據(jù)為 平均數(shù) 標(biāo)準(zhǔn)差 n 5 同行不同小寫字母為P 0 05的差異顯著性 2 1 2 不同氮源對草菇菌絲生長的影響 氮源是食用菌細(xì)胞合成蛋白質(zhì)和核酸的主要原料 在深層發(fā)酵中起著重要作用 由表4可知 草菇 9715 在酵母浸粉 牛肉浸膏和蛋白胨中均能很好的 長 而在硝酸鉀和硫酸銨中 長較差 表明草菇利 用無機(jī)氮的效果不佳 其中以酵母浸粉為氮源時(shí) 菌絲 物 最大 極顯著優(yōu)于其他氮源 表明酵母浸粉 可作為 草菇9715 菌株液體菌種的最適氮源 表4 不同氮源對草菇菌絲生長的影響 Table 4 Effect of different nitrogen source on the mycelial growth of V volvacea g 氮源每100 mL菌絲 物 重氮源每100 mL菌絲 物 重 蛋白胨0 231 4 0 006 8 B硝酸鉀0 029 1 0 003 3 D 酵母浸粉0 347 8 0 028 2 A硫酸銨0 075 8 0 007 5 C 牛肉浸膏0 234 0 0 015 7 B 注 數(shù)據(jù)為 平均數(shù) 標(biāo)準(zhǔn)差 n 5 同行不同大寫字母為P RB RD RC 極差越大起的作用越大 4 因素中對菌絲 物 的影響大小依次為 葡萄糖 A 酵母浸粉 B MgSO4 D KH2PO4 C 其中MgSO4和KH2PO4的影響較小 根據(jù)方差分析結(jié)果 表6 葡萄糖對菌絲 物 的影響最為顯著 在試驗(yàn)設(shè) 范圍內(nèi) 優(yōu)化得到的最佳配方為A3B3C1D2 這與正交試驗(yàn)表中出現(xiàn) 34 余昌霞 等 草菇液體菌種培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件的優(yōu)化 的最大值組合A2B3C1D2不一致 經(jīng)驗(yàn)證 以組合A3B3C1D2培養(yǎng)的草菇液體每100 mL菌種菌絲體 重達(dá) 到 0 507 9 0 022 9 g 優(yōu)于A2B3C1D2 即適合 草菇9715 菌株液體培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基配方為 葡萄糖 25 g L 酵母浸粉4 g L KH2PO41 g L MgSO41 g L 表6 配方正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析 Table 6 Variance analysis of orthogonal experiment result of cultivation medium 變異來源自由度平方和均方F顯著性 葡萄糖2 0 076 0 038 26 924 酵母浸粉2 0 025 0 013 8 957 磷酸二氫鉀2 0 000 0 000 0 176 硫酸鎂2 0 023 0 012 8 204 誤差27 0 069 0 001 總和35 1 206 2 2 草菇液體菌種培養(yǎng)條件的確定 根據(jù)2 1中優(yōu)化得到的培養(yǎng)基組合作為基本培養(yǎng)基 選擇液體裝瓶 等作為基本因子 進(jìn)行L9 34 正交試驗(yàn) 結(jié)果如表7 不同處理菌絲 物 有一定差異 由極差分析結(jié)果可以看出 RD RC RA RB 4 因素對草菇液體菌種菌絲 物 的影響依次為 轉(zhuǎn)速 D 溫度 C 接種 A 裝液 B 通過 方差分析 四因素中 轉(zhuǎn)速和溫度的影響較為顯著 其中轉(zhuǎn)速的作用最為顯著 表8 在試驗(yàn)設(shè) 范圍內(nèi) 優(yōu)化得到的最佳培養(yǎng)條件為A2B3C1D2 即接種 2 裝瓶 120 mL 溫度32 轉(zhuǎn)速125 S min 表7 最佳培養(yǎng)條件L9 34 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 Table 7 Results of the L9 34 orthogonal experiment of optimal culture conditions 序號A B C D每100mL菌絲 物 重 g 1 1 1 1 1 0 164 4 0 021 0 2 1 2 2 2 0 387 9 0 042 2 3 1 3 3 3 0 305 4 0 042 1 4 2 1 2 3 0 344 6 0 017 1 5 2 2 3 1 0 149 5 0 010 7 6 2 3 1 2 0 602 2 0 084 7 7 3 1 3 2 0 475 1 0 071 0 8 3 2 1 3 0 488 7 0 017 0 9 3 3 2 1 0 121 8 0 020 2 K1 0 285 9 0 328 1 0 418 4 0 145 2 K2 0 365 5 0 342 0 0 284 8 0 488 4 K3 0 361 8 0 343 1 0 310 0 0 379 6 R 0 079 6 0 015 0 0 133 6 0 343 2 表8 培養(yǎng)條件正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析 Table 8 Variance analysis of orthogonal experiment result of culture conditions 變異來源自由度平方和均方F顯著性 接種 2 0 061 0 030 15 744 裝液 2 0 002 0 001 0 550 溫度2 0 151 0 076 39 337 轉(zhuǎn)速2 0 923 0 461 239 925 誤差36 0 069 0 002 總和44 1 206 3 結(jié)論與討論 草菇液體菌種 長的影響因素較多 如 長所需的營養(yǎng)物質(zhì) 培養(yǎng)溫度 接種 等 液體菌種培養(yǎng)基 的優(yōu)化對菌絲 長產(chǎn) 重要的影響 特別是碳 氮源的種類及濃度的選擇優(yōu)化 任海霞等 10 研究表明 液 體培養(yǎng)條件下 適宜草菇菌絲 長的最佳碳源是淀粉 最佳氮源是蛋白胨 最佳碳氮比是10 1 最佳淀粉 濃度是3 0 草菇菌絲 長的最適溫度為30 最適pH為7 0 張萍等 11 研究了不同碳源 氮源及無 機(jī)鹽對 草菇V110 液體培養(yǎng)菌絲 長的影響 結(jié)果表明草菇液體培養(yǎng)較適宜的碳源是蔗糖 氮源是蛋白 胨 酵母膏和牛肉膏 無機(jī)鹽是KH2PO4 杜姝蓮等 12 研究表明 草菇V238 菌株液體菌種較適宜的葡 44 上 海 農(nóng) 業(yè) 學(xué) 報(bào) 萄糖濃度為1 1 5 最佳 長溫度為33 轉(zhuǎn)速為200 S min 接種 為5 本研究通過單因素篩 選試驗(yàn) 以菌絲 物 作為評價(jià)指標(biāo) 13 14 確定了 草菇9715 液體菌種最適碳源為葡萄糖 最適氮源為 酵母浸粉 結(jié)果表明 草菇菌絲既可以利用單糖也可以利用雙糖物質(zhì)的碳源 且葡萄糖的效果較好 可能 是因?yàn)樾》肿犹荚纯杀恢苯游绽?在培養(yǎng)前期可使菌種快速定植 而大分子的碳源需要通過菌絲體 分泌的胞外酶水解為葡萄糖后才被利用 以酵母浸粉為氮源 因其是酵母細(xì)胞經(jīng)過破壁之后的水提取 其營養(yǎng)成分更加豐富而更利于菌絲 長所需 正交試驗(yàn)在研究多因素多水平的試驗(yàn)中具有高效 快速等優(yōu)點(diǎn) 是目前常用的優(yōu)化培養(yǎng)基的方法之 一 本試驗(yàn)進(jìn)一步通過正交試驗(yàn) 對適合 草菇9715 菌絲 長的液體培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu) 化 經(jīng)試驗(yàn)得到 草菇9715 液體菌種的最佳配方為葡萄糖25 g L 酵母浸粉4 g L KH2PO4 1 g L MgSO4 1 g L 最佳培養(yǎng)條件為接種 2 裝瓶 120 mL 溫度32 轉(zhuǎn)速125 S min 此時(shí)草菇液體每100 mL菌 種的菌絲 物 可達(dá) 0 602 2 0 084 7 g 本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果有相似之處 也有不同之處 其 原因可能是試驗(yàn)選用的菌種不同或培養(yǎng)基的物料配比差異導(dǎo)致的 本研究可為草菇 廠化液體菌種的 應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù) 并加快草菇 廠化栽培的進(jìn)程 參 考 文 獻(xiàn) 1 戴建清 曾志恒 食用菌液體菌種研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢 J 中國食用菌 2012 31 5 1 3 2 郭靜利 劉旭 食用菌液體和固體制種技術(shù)比較經(jīng)濟(jì)效益分析 J 中國農(nóng)業(yè)科學(xué) 2011 44 4 835 841 3 譚一羅 蘇文英 王朝暉 等 廠化金針菇菌株液體培養(yǎng)基的篩選和優(yōu)化 J 食品與發(fā)酵科技 2019 55 1 35 37 43 4 黃竹青 鄭劍玲 鄧鐵宏 等 白色金針菇液體菌種制備及 廠化 產(chǎn)應(yīng)用初探 J 微 物學(xué)雜志 2013 33 2 75 79 5 王濤 譚琦 李玉 等 杏鮑菇液體菌種應(yīng)用 藝參數(shù)的優(yōu)化 J 上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào) 2019 35 1 33 37 6 王迎鑫 蟹味菇 廠化栽培穩(wěn)定性研究 D 重慶 西南大學(xué) 2014 7 周峰 李巧珍 楊仁智 等 香菇液體菌種與固體菌種的 產(chǎn)成本和使用效果分析 J 食藥用菌 2017 25 3 199 202 204 8 湯倩倩 孫占剛 俞美蓮 等 上海市食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀及對策研究 J 中國食用菌 2019 38 1 80 84 88 9 張麗蓉 草菇菌種質(zhì) 控制技術(shù)研究 D 福州 福建農(nóng)林大學(xué) 2011 10 任海霞 楊鵬 曲玲 等 草菇液體菌種培養(yǎng)條件優(yōu)化研究 J 山東農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014 46 2 58 60 11 張萍 蔣小滿 卜慶梅 等 不同營養(yǎng)條件對草菇液體培養(yǎng)的影響 J 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2005 5 97 99 12 杜姝蓮 全衛(wèi)豐 劉廣建 草菇液體菌種最佳 長因子試驗(yàn) J 食用菌 2004 1 16 18 13 李維煥 于蘭蘭 韓峰 等 2種食用菌液體菌種發(fā)酵終點(diǎn)的質(zhì) 變化檢測方法 J 中國釀造 2010 11 160 162 14 林增祥 付永前 曾憲賢 食用菌液體菌種發(fā)酵終點(diǎn)的簡便檢測方法 J 中國食用菌 2006 25 4 25 26 責(zé)任編輯 張睿 54