收稿日期 2019 01 15 基金項(xiàng)目 上海市農(nóng)業(yè)基礎(chǔ)性研究項(xiàng)目 滬農(nóng)科攻字 2014 第7 2 2號(hào) 上海市科委農(nóng)業(yè)科技重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目 16391901400 作者簡(jiǎn)介 呂文遠(yuǎn) 1993 女 在讀碩士 主要從事草莓分子遺傳學(xué)研究 E mail lvwenyuan1003 126 com 通信作者 E mail kduan936 126 com 上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào) 2020 36 6 1 5 http www nyxb sh cn Acta Agriculturae Shanghai DOI 10 15955 j issn1000 3924 2020 06 01 呂文遠(yuǎn) 張麗勍 高清華 等 紅顏 草莓中果糖激酶基因FaFRK3的克隆與表達(dá)分析 J 上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào) 2020 36 6 1 5 紅顏 草莓中果糖激酶基因FaFRK3的克隆與表達(dá)分析 呂文遠(yuǎn)1 2 張麗勍2 高清華2 段 可2 1上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院 上海201306 2上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院林木果樹研究所 上海201403 摘 要 以 紅顏 草莓果實(shí)為材料 經(jīng)RNA提取后反轉(zhuǎn)錄獲得草莓果糖激酶基因FaFRK3全長(zhǎng)序列 并對(duì) 其進(jìn)行生物信息學(xué)分析和表達(dá)分析 結(jié)果表明 草莓FaFRK3基因完整讀碼框ORF長(zhǎng)1 158 bp 編碼386個(gè)氨基 酸 其編碼蛋白的等電點(diǎn)和相對(duì)分子質(zhì)量分別為5 04和94 292 57 ku 草莓FaFRK3基因與其他植物的FRK基 因相似度較高 FaFRK3基因編碼蛋白屬于pfkB糖激酶家族 實(shí)時(shí)熒光定量PCR發(fā)現(xiàn) FaFRK3基因在 紅顏 草莓不同器官的表達(dá)量相差較大 其中在種子中的相對(duì)表達(dá)量最高 在莖中的相對(duì)表達(dá)量最低 該基因在不同 發(fā)育時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量也存在差異 隨著草莓果實(shí)成熟 FaFRK3基因相對(duì)表達(dá)量逐漸降低 關(guān)鍵詞 紅顏 果糖激酶基因 基因克隆 表達(dá)分析 中圖分類號(hào) S668 4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1000 3924 2020 06 001 05 Cloning and expression analysis of fructokinase gene FaFRK3 from Benihoppe strawberry L Wenyuan1 2 ZHANG Liqing2 GAO Qinghua2 DUAN Ke2 1 College of Fisheries and Life Sciences Shanghai Ocean University Shanghai 201306 China 2 Forest and Fruit Tree Research Institute Shanghai Academy of Agricultural Sciences Shanghai 201403 China Abstract Using Benihoppe strawberry fruit as material the full length sequence of strawberry fructokinase gene FaFRK3 was obtained by RNA extraction and reverse transcription and its bioinformatics and expression analysis were carried out The results showed that the ORF of FaFRK3 gene was 1 158 bp and encoded 386 amino acids The isoelectric point and relative molecular mass of the protein were 5 04 and 94 292 57 ku respectively The FaFRK3 gene of strawberry was similar to that of other plants The protein encoded by FaFRK3 gene belonged to the pfkB glycokinase family Real time fluorescent quantitative PCR showed that the expression of FaFRK3 gene in different organs of Benihoppe strawberry was quite different The relative expression level of FaFRK3 gene in seed was the highest and that in stem was the lowest The relative expression of FaFRK3 gene also changed in different developmental stages With the ripening of strawberry fruit the relative expression of FaFRK3 gene decreased gradually Key words Benihoppe Fructokinase gene Gene cloning Expression analysis 草莓果實(shí)中的可溶性糖主要有3種 蔗糖 葡萄糖 果糖 其中果糖甜度最高 紅顏 草莓果實(shí)中果糖含 量相對(duì)較高 1 植物光合作用主要產(chǎn)物是蔗糖 蔗糖和尿苷 5 二磷酸二鈉鹽 UDP 在蔗糖合酶 Sucrose Synthase SS EC2 4 1 13 的作用下水解為果糖和尿苷二磷酸葡萄糖 UDPG 該過程是可逆的 2 果糖在 果糖激酶 Fructokinase FRK EC2 7 1 4 的作用下進(jìn)一步磷酸化生成6 磷酸果糖 己糖激酶 Hexokinase HK EC 2 7 1 1 主要磷酸化葡萄糖 果糖激酶主要磷酸化果糖 3 FRK在果糖代謝過程中具有十分重要的 作用 已知的FRKs是碳水化合物嘌呤激酶家族的成員 被稱為磷酸果糖激酶B pfkB 家族 4 該家族與植 物中的果糖代謝合成途徑密切相關(guān) 對(duì)FRK基因表達(dá)的研究有助于揭示植物中果糖的代謝與合成 呂文遠(yuǎn) 等 紅顏 草莓中果糖激酶基因FaFRK3的克隆與表達(dá)分析 馬鈴薯 5 鱷梨 6 大麥 7 豌豆 8 9 水稻 10 和柑橘 11 等作物中的FRK基因均已被分離出來 甘蔗 中有7個(gè)與果糖激酶相關(guān)的基因 ScFRK1 ScFRK7 其中ScFRK1和ScFRK5是主效基因 ScFRK1基因 表達(dá)量最高 ScFRK5基因次之 ScFRK4基因在赤霉素的脅迫下表達(dá)量明顯上升 12 在擬南芥中 果糖激 酶AtFEK1和AtFRK2基因?qū)蔷哂休^高特異性 13 在日本梨果實(shí)中 隨著果糖含量的增加 果糖激酶 的活性會(huì)持續(xù)下降 14 Qin等 15 在枇杷中分離出果糖激酶EjFRK基因 通過動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)EjFRK基因轉(zhuǎn)錄 本和FRK酶活性的變化 發(fā)現(xiàn)EjFRK基因在果實(shí)發(fā)育早期的表達(dá)水平較高 成熟期表達(dá)水平較低 與 FRK酶活性的變化趨勢(shì)相似 而FRK酶活性的變化與果實(shí)發(fā)育進(jìn)程方向相反 高FRK酶活性不利于枇杷 果實(shí)果糖積累 趙建華等 16 從 寧杞1號(hào) 枸杞果實(shí)中分離得到LbFRK7基因 發(fā)現(xiàn)該基因在枸杞果實(shí)的 發(fā)育過程中對(duì)果糖轉(zhuǎn)化具有一定的作用 特別是在果實(shí)成熟過程中對(duì)果糖含量的升高具有重要作用 Yang等 17 研究發(fā)現(xiàn) 蘋果的莖尖和幼果中 MdFRK2基因的表達(dá)非常高 草莓果實(shí)糖分積累研究較多 但有關(guān)草莓果實(shí)甜度控制重要的果糖代謝和果糖激酶基因的研究尚未見報(bào)道 本試驗(yàn)以 紅顏 草莓果 實(shí)為材料 克隆和分離獲得草莓果實(shí)中FaFRK3基因的cDNA全長(zhǎng)序列 并對(duì) 紅顏 植株不同器官以及草 莓果實(shí)發(fā)育各個(gè)時(shí)期的FaFRK3基因的表達(dá)進(jìn)行分析 以期為后續(xù)基因功能分析和果實(shí)甜度遺傳控制奠 定基礎(chǔ) 1 材料與方法 1 1 植物材料及試劑 選取2017年10月種植于上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院莊行試驗(yàn)站塑料大棚中生長(zhǎng)狀況良好的草莓品種 紅 顏 Fragaria ananassa Duchesne Benihoppe 為試驗(yàn)材料 分別選取綠果期 G 果實(shí)綠色 瘦果緊密 聚合 白果期 W 果實(shí)白色膨大 瘦果不再緊密聚合 轉(zhuǎn)色期 T 果實(shí)著色面積達(dá)25 50 成熟期 R 果實(shí)完全著色成熟 4個(gè)發(fā)育階段的草莓果實(shí) 以及 紅顏 植株的根 短縮莖 葉 花 種子5個(gè)器官 每個(gè)時(shí)期的果實(shí)設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù) 隨機(jī)選取同一時(shí)期的10個(gè)果實(shí)混為一組 共3組進(jìn)行液氮磨樣 存 放于 80 冰箱中備用 所用載體為入門載體pDONR221 大腸桿菌TOP10和根癌農(nóng)桿菌GV3101購(gòu)于上海唯地生物技術(shù)有 限公司 質(zhì)粒小抽試劑盒和DNA純化試劑盒購(gòu)于天根生化科技有限公司 植物RNA提取試劑盒為E Z N A Plant RNA Kit 美國(guó)OMEGA公司 SYBR Green 熒光染料購(gòu)于上海生工生物工程股份有限公司 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于大連TaKaRa公司 引物由上海生工生物工程股份有限公司合成 1 2 試驗(yàn)方法 1 2 1 FaFRK3基因全長(zhǎng)cDNA的克隆 利用E Z N A Plant RNA試劑盒從 紅顏 草莓果實(shí)中提取RNA 利用Oligo軟件進(jìn)行FaFRK3基因 CDS引物 FaFRK3 F和FaFRK3 R 設(shè)計(jì) 表1 使用MLV反轉(zhuǎn)錄酶 RNase Inhibitor進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄 得到單 鏈cDNA PCR反應(yīng)體系為 25 L 2 Es Taq MasterMix Dye 上下游引物各2 L 1 L cDNA 加水至 50 L體系 PCR反應(yīng)程序 98 預(yù)變性5 min 98 變性30 s 62 退火30 s 72 延伸2 min 共30 個(gè)循環(huán) 72 延伸5 min 擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物使用膠回收試劑盒回收得到FaFRK3基因的目的片段 連 接到pDONR221入門載體上 18 重組載體轉(zhuǎn)入TOP10大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中 菌液檢測(cè)呈陽(yáng)性的單克隆 送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序 表1 試驗(yàn)所用引物 Table 1 Primers used in the experiment 引物名稱序列 5 3 Tm 目的片段長(zhǎng)度 bp EF1 F TGGATTTGAGGGTGACAACATGA EF1 R GTATACATCCTGAAGTGGTAGACGGAGG FaFRK3 F ATGGGGAGAAACCGAACCACCCACCTC FaFRK3 R TGGTTTAAGGTCCACTGTTCGAATTG FaFRK3 qRT F GAATGTAGCAGGACATGAAC FaFRK3 qRT R CGAATTGGCTCCTCATAGAC 55 145 62 1 158 55 195 1 2 2 生物信息學(xué)分析 通過Pfam分析得到果糖激酶保守結(jié)構(gòu)域pfkB PF00294 24 氨基酸序列 將該序列在GDR https 2 上 海 農(nóng) 業(yè) 學(xué) 報(bào) www rosaceae org 中進(jìn)行BLAST分析 得到草莓中基因序列mrna07897 1 v1 0 hybrid BLAST分析表 明 該基因序列與FRK3基因一致性最高 因此將其命名為FaFRK3 使用MEGA5構(gòu)建Neighbor Joining 系統(tǒng)進(jìn)化樹 bootstrap重復(fù)次數(shù)為1 000次 圖2 利用ProtParam http web expaasy org protparam 對(duì) FaFRK3蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)性質(zhì)分析 通過DNAMAN進(jìn)行序列相似性分析 利用HMMER http www hmmer org 對(duì)基因序列結(jié)構(gòu)域和功能進(jìn)行分析 利用ProtScale http web expasy org protscale 對(duì) FaFRK3蛋白進(jìn)行親疏水性分析 1 2 3 FaFRK3基因表達(dá)分析 使用Oligo軟件進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析引物 FaFRK3 RT F FaFRK3 RT R 設(shè)計(jì) 表1 內(nèi)參引物為 EF1 參照呂文遠(yuǎn)等 19 定量方法對(duì)FaFRK3基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量分析 3次生物學(xué)重復(fù) 采用2 CT 方法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理 2 結(jié)果與分析 2 1 紅顏 草莓FaFRK3基因克隆分析 利用Oligo軟件設(shè)計(jì)的引物 FaFRK3 F R 進(jìn)行PCR擴(kuò)增 獲得目的基因 圖1 FaFRK3基因含有一 個(gè)1 158 bp的開放閱讀框 ORF 編碼有386個(gè)氨基酸 其編碼蛋白理論等電點(diǎn)和相對(duì)分子質(zhì)量分別為 5 04和94 292 57 ku FaFRK3蛋白分子式為C3757H6241N1275O1611S270 脂肪酸系數(shù)為20 47 不穩(wěn)定系數(shù)為 39 46 是一個(gè)穩(wěn)定的蛋白 屬于pfkB糖激酶家族 通過DNAMAN進(jìn)行序列比對(duì)顯示 其與FRK蛋白氨 基酸序列相似性較高 其中與月季的FRK蛋白氨基酸序列相似性最高 圖2 2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp 1158bp FaFRK3 FaFRK3 CK M 1158bp 注 FaFRK3為目的基因條帶 CK為空白對(duì)照 M為Marker 圖1 紅顏 草莓FaFRK3基因PCR擴(kuò)增電泳 Fig 1 PCR amplification and electrophoresis of Benihoppe strawberry FaFRK3 gene 100 100 100 100 99 99 0 5 草 莓 mrna07897 1 v1 0 hybrid 月 季 XP 024157436 1 水 蜜 桃 XP 007205340 1 棗 XP 015873836 1 番 木 瓜 XP 021909927 1 柑 橘 XP 006425063 1 番 茄 XP 004241162 1 南 瓜 XP 022964857 1 擬 南 芥 AT1G06020 1 獼 猴 桃 PSR86166 1 圖2 植物果糖激酶家族基因系統(tǒng)進(jìn)化樹 Fig 2 Phylogenetic tree of fructosekinase family gene in plant 2 2 FaFRK3蛋白結(jié)構(gòu)分析 對(duì)測(cè)序所得基因序列結(jié)構(gòu)域和功能進(jìn)行分析 利用SignalP工具進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)顯示 該基因含有一 個(gè)信號(hào)肽 位置為1 27堿基 分值為0 450 圖3 利用ProtScale進(jìn)行親疏水性分析表明 FaFRK3蛋白 大部分氨基酸屬于疏水性氨基酸 圖4 說明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定 2 3 FaFRK3基因定量表達(dá)分析 由定量分析結(jié)果可以看出 FaFRK3基因在 紅顏 草莓莖中的相對(duì)表達(dá)量最低 在種子中的相對(duì)表達(dá) 3 呂文遠(yuǎn) 等 紅顏 草莓中果糖激酶基因FaFRK3的克隆與表達(dá)分析 量最高 圖5 FaFRK3基因在 紅顏 草莓果實(shí)綠果期表達(dá)量最高 隨后逐漸降低 成熟期FaFRK3基因 表達(dá)量最低 圖6 信 號(hào) 肽 位 置 C score ATGGGGAGAAACCGAACCACCCACCTCACTTCCTCCCCTCGCCGCTGCCTGATTGCCGGACACTACTGCC S score Y score 1 0 0 8 0 6 0 4 0 2 0 位 置 分 值 10 20 30 40 50 60 700 圖3 紅顏 草莓FaFRK3蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè) Fig 3 Signal peptide prediction of FaFRK protein in Benihoppe strawberry 2 5 2 0 1 5 1 0 0 5 0 0 5 1 0 位 置 分 值 200 400 600 8000 1 000 1 200 圖4 紅顏 草莓FaFRK3蛋白親疏水性分析 Fig 4 Hydrophobicity analysis of FaFRK3 protein in Benihoppe strawberry 器官 1 2 1 0 0 8 0 6 0 4 0 2 0 相 對(duì) 表 達(dá) 量 根 莖 葉 果 種子 圖5 紅顏 草莓不同器官中FaFRK3基因定量分析 Fig 5 Quantitative analysis of FaFRK3 gene in different organs of Benihoppe strawberry 發(fā)育時(shí)期 1 2 1 0 0 8 0 6 0 4 0 2 0 相 對(duì) 表 達(dá) 量 綠果期 白果期 轉(zhuǎn)色期 成熟期 圖6 紅顏 草莓不同發(fā)育時(shí)期FaFRK3基因定量分析 Fig 6 Quantitative analysis of FaFRK3 gene in different developmental stages of Benihoppe strawberry 3 結(jié)論與討論 植物中的FRK基因?qū)χ参锏墓欠e累具有明顯的影響 草莓果實(shí)中的FaFRK3蛋白氨基酸序列與 月季 Rosachinensis XP 024157436 1 中的氨基酸序列相似率高達(dá)90 16 與水蜜桃 Prunus persica XP 007205340 1 棗 Ziziphus jujuba XP 015873836 1 番木瓜 Carica papaya XP 021909927 1 克里曼丁 橘 Citrus clementina XP 006425063 1 等植物也高度同源 氨基酸序列比對(duì)分析表明 FaFRK3蛋白具有 pfkB糖激酶家族的明顯特征 屬于pfkB糖激酶家族 提示FaFRK3基因是 紅顏 草莓果實(shí)中果糖激酶蛋 白的關(guān)鍵編碼基因之一 定量表達(dá)分析發(fā)現(xiàn) FaFRK3基因在 紅顏 草莓果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量差 別較大 并且在不同器官中相對(duì)表達(dá)量明顯不同 隨著 紅顏 草莓果實(shí)的成熟 FaFRK3基因的相對(duì)表達(dá) 量明顯減少 這與枸杞中的LbFRK7基因 16 和楊梅中的MrFRK2基因 20 表達(dá)趨勢(shì)分析結(jié)果一致 參 考 文 獻(xiàn) 1 王貴元 夏仁學(xué) 吳強(qiáng)盛 果實(shí)中糖分的積累與代謝研究進(jìn)展 J 北方園藝 2007 3 56 58 2 李麗娜 孔建強(qiáng) 植物蔗糖合酶的結(jié)構(gòu) 功能及應(yīng)用 J 中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào) 2015 31 9 904 913 3 GRANOT D Role of tomato hexose kinases J Functional Plant Biology 2007 34 6 564 570 4 RIGGS J W CAVALES P C CHAPIRO S M et al Identification and biochemical characterization of the fructokinase gene family in Arabidopsis thaliana J BMC Plant Biology 2017 17 83 5 SMITH S B TAYLOR M A BURCH L R et al Primary structure and characterization of a cDNA clone of fructokinase from potato Solanum tuberosum L cv record J Plant physiology 1993 102 3 1043 6 COPELAND L TANNER G J Hexose kinases of avocado J Physiologia Plantarum 1988 74 3 531 536 4 上 海 農(nóng) 業(yè) 學(xué) 報(bào) 7 BAYSDORFER C KREMER D F SICHER R C Partial purification and characterization of fructokinase activity from barley leaves J Journal of Plant Physiology 1989 134 2 156 161 8 COPELAND L STONE S R TURNER J F Kinetic studies of fructokinase I of pea seeds J Archives of Biochemistry and Biophysics 1984 233 2 748 760 9 TURNER J F HARRISON D D COPELAND L Fructokinase fraction IV of pea seeds J Plant Physiology 1977 60 5 666 669 10 JIANG H DIAN W LIU F et al Isolation and characterization of two fructokinase cDNA clones from rice J Phytochemistry 2003 62 1 47 52 11 QIN Q P ZHANG S L CHEN J W et al Isolation and expression analysis of fructokinase genes from citrus J Acta Botanica Sinica 2004 46 12 1408 1415 12 陳毅鴻 甘蔗果糖激酶基因家族基因組演化及功能研究 D 福州 福建師范大學(xué) 2016 13 GONZALI S PISTELLI L DE BELLIS L et al Characterization of two fructokinases J Plant Science 2001 160 6 1107 1114 14 SUZUKI Y ODANAKA S KAMAYAMA Y Fructose content and fructose related enzyme activity during the fruit development of apple and Japanese pear J Journal of the Japanese Society for Horticultural Science 2001 70 1 16 20 15 QIN Q P CUI Y Y ZHANG L L et al Isolation and induced expression of a fructokinase gene from loquat J Russian Journal of Plant Physiology 2014 61 3 289 297 16 趙建華 尹躍 李浩霞 等 枸杞果糖激酶基因LbFRK7的克隆及表達(dá)分析 J 西北植物學(xué)報(bào) 2018 38 5 816 822 17 YANG J ZHU L CUI W et al Increased activity of MdFRK2 a high affinity fructokinase leads to upregulation of sorbitol metabolism and downregulation of sucrose metabolism in apple leaves J Horticulture Research 2018 5 71 18 郭姍姍 張蒙 單衛(wèi)星 基于Gateway技術(shù)的植物表達(dá)載體的構(gòu)建 J 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào) 自然科版 2010 38 11 161 166 172 19 呂文遠(yuǎn) 張玲 王延秀 等 草莓蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因FaSUT5對(duì) 申陽(yáng) 草莓果實(shí)糖分積累的影響 J 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào) 2018 30 8 16 20 20 陳馨 施麗愉 邵佳蓉 等 楊梅果糖激酶基因MrFRK2的克隆及在成熟期果實(shí)中的表達(dá)分析 J 園藝學(xué)報(bào) 2016 43 8 1585 1592 責(zé)任編輯 閆其濤 5