收稿日期 2019 02 21 作者簡(jiǎn)介 李菊芬 1982 女 碩士 助理研究員 研究方向?yàn)槲鞴咸鸸线z傳育種 E mail lijufen 1010 163 com Tel 021 34675053 通信作者 E mail maguobin2006 163 com 上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào) 2020 36 6 44 48 http www nyxb sh cn Acta Agriculturae Shanghai DOI 10 15955 j issn1000 3924 2020 06 09 李菊芬 林濤 馬國(guó)斌 甜瓜細(xì)菌性果斑病帶菌種子的處理方法研究 J 上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào) 2020 36 6 44 48 甜瓜細(xì)菌性果斑病帶菌種子的處理方法研究 李菊芬 林 濤 馬國(guó)斌 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院設(shè)施園藝研究所 上海市設(shè)施園藝技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海201106 摘 要 以攜帶細(xì)菌性果斑病菌 Acidovoras avenae subsp citrulli 的甜瓜種子為材料 分別進(jìn)行70 75 80 干熱滅菌 包衣劑 衛(wèi)福Vitavax 70 干熱滅菌 包衣劑5種方式的處理 并利用特異引物 BX L1 BX S R2 對(duì)細(xì)菌性果斑病菌進(jìn)行PCR檢測(cè) 以期探索一種既不影響種子發(fā)芽率 又能有效殺滅種帶細(xì)菌性果斑 病菌的最佳處理方式 結(jié)果表明 除70 干熱滅菌 包衣劑處理外 其他4種處理的種子均能檢測(cè)到279 bp的 目的條帶 實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示 5種處理的種子細(xì)菌性果斑病菌帶菌量均有不同程度的降低 其中以70 干熱滅菌 包衣劑處理效果最佳 活菌分離結(jié)果表明 只能從70 干熱滅菌的種子上分離到細(xì)菌性果斑病菌 種子發(fā)芽試驗(yàn)結(jié)果顯示 75 和80 干熱處理對(duì)種子發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率有一定影響 其他處理均無影響 關(guān)鍵詞 甜瓜 細(xì)菌性果斑病菌 種子處理 中圖分類號(hào) S436 5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1000 3924 2020 06 044 05 Study on the treatment methods of melon seed with bacterial fruit blotch BFB LI Jufen LIN Tao MA Guobin Protected Horticultural Research Institute Shanghai Academy of Agricultural Sciences Shanghai Key Laboratory of Protected Horticultural Technology Shanghai 201106 China Abstract In order to explore a kind of best treatment method which does not affect the seed germination rate but also can effectively kill the BFB pathogen Acidovoras avenae subsp citrulli muskmelon seeds carrying BFB pathogen were treated with 5 methods namely 70 75 80 dry heat sterilization coating agent Vitavax 70 dry heat sterilization coating agent and the specific primers BX L1 BX S R2 were used to detect BFB pathogen The results showed that the 279 bp target band could be detected in all the treatments except 70 dry heat sterilization coating agent treatment Quantitative real time PCR results showed that the amount of BFB pathogen in the 5 treatments decreased in different degrees and the best treatment was 70 dry heat sterilization coating agent The living pathogen isolation results showed that BFB pathogen could only be isolated from seeds sterilized by dry heat at 70 The seed germination results showed that 75 and 80 dry heat treatment had effects on seed germination potential and germination rate while other treatments had no effects Key words Melon Acidovoras avenae subsp citrulli Seed treatment 細(xì)菌性果斑病 Bacteiral fruit blotch 簡(jiǎn)稱BFB 是一種嚴(yán)重危害葫蘆科植物的世界性病害 1 3 是影響 瓜類生產(chǎn)的主要病害之一 其病原為嗜酸菌屬西瓜種 Acidovoras citrulli 4 5 由于細(xì)菌性果斑病菌是典 型的種傳細(xì)菌性病害 6 7 如不及時(shí)進(jìn)行檢測(cè)和滅菌處理 種子生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)者和瓜農(nóng)將面臨遭受經(jīng)濟(jì)損失的 風(fēng)險(xiǎn) 建立快速 準(zhǔn)確的檢測(cè)方法和行之有效的滅菌處理方法是防控此病的重要手段 目前 PCR技 術(shù) 8 13 血清學(xué)檢測(cè)技術(shù) 14 已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌性果斑病菌的檢測(cè) 但在種子處理方面尚缺乏有效的防治 藥劑 15 本試驗(yàn)以在新疆繁育的攜帶瓜類細(xì)菌性果斑病菌的甜瓜種子為材料 分別進(jìn)行70 75 上 海 農(nóng) 業(yè) 學(xué) 報(bào) 80 干熱滅菌 包衣和70 干熱滅菌 包衣5種不同的滅菌處理 采用本實(shí)驗(yàn)室前期建立的PCR體系 和實(shí)時(shí)定量PCR方法分別對(duì)處理后的甜瓜種子帶菌情況進(jìn)行檢測(cè) 并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行活菌分離鑒定 旨 在探索一種既不影響種子發(fā)芽率 又能有效殺滅種帶細(xì)菌性果斑病菌的最佳處理方式 為甜瓜種子的生 產(chǎn)和流通提供技術(shù)參考 1 材料與方法 1 1 材料 供試甜瓜 Cucumis melo L 種子 在新疆繁育的攜帶瓜類細(xì)菌性果斑病菌的 東方蜜1號(hào) 甜瓜種 子 供試菌株 由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹所提供的細(xì)菌性果斑病標(biāo)準(zhǔn)菌株 Acidovoras avenae subsp citrulli 1 2 方法 1 2 1 帶菌種子的不同處理方法 將帶菌的供試甜瓜種子隨機(jī)分成6組 每組2 kg 以其中1組種子為對(duì)照 CK 其他5組分別進(jìn)行如 下5種不同處理 處理1 40 處理2 d 50 處理1 d 70 處理3 d 50 處理1 d 40 處理1 d 處 理2 40 處理2 d 50 處理1 d 75 處理3 d 50 處理1 d 40 處理1 d 處理3 40 處理2 d 50 處理1 d 80 處理3 d 50 處理1 d 40 處理1 d 處理4 包衣處理 包衣劑為衛(wèi)福 有效成分 為萎銹靈200 g L 福美雙200 g L 處理5 處理1 處理4 1 2 2 PCR檢測(cè) 5種處理和對(duì)照各取300粒種子放入滅菌三角瓶中 加入30 mL無菌雙蒸水 置于28 下200 r min 振蕩培養(yǎng)3 h 取1 L懸浮液作為PCR模板 選用特異引物BX L1 BX S R2 BX L1 5 CAGCTGGGAG CGATCTTCAT 3 BX S R2 5 GCGTCAGGAGGGTGAGTAGCA 3 9 進(jìn)行PCR擴(kuò)增 引物由上海生工生 物工程股份有限公司合成 每種處理3個(gè)重復(fù) 普通PCR所需試劑均購于天根生化技術(shù)有限公司 PCR反應(yīng)體系 25 L 10 buffer 2 5 L MgCl2 2 mmol L dNTPs 0 2 mmol L Taq DNA聚合酶1 U 正反 向引物各0 2 mol L 模板為1 L浸提液 無菌三蒸水補(bǔ)齊 擴(kuò)增條件 95 3 min 94 35 s 60 35 s 72 45 s 35個(gè)循環(huán) 72 7 min PCR儀為BIO Rad T100TM Thermal Cycler 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1 瓊 脂糖凝膠電泳 Goldview染液染色后 于紫外凝膠成像系統(tǒng) Tanon 3500 下觀察并拍照 1 2 3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè) 熒光染料為Takara公司的SYBR green定量PCR染料 儀器為Bio Rad CFX96TM Real Time PCR System 反應(yīng)體系按照Takara SYBR Premix Ex TaqTM說明書進(jìn)行 擴(kuò)增程序采用Bio Rad CFX熒光定量 PCR儀默認(rèn)程序 即 95 30 s 95 5 s 60 30 s 40個(gè)循環(huán) 每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)收集熒光信號(hào) 每個(gè)反 應(yīng)設(shè)置3個(gè)重復(fù) 以對(duì)照作為參比 采用相對(duì)定量 CT法 的方法計(jì)算出各處理與CK的CT值之差 CT 以2 CT計(jì)算所得的值即為各處理的相對(duì)帶菌量 1 2 4 活菌分離檢測(cè) 取CK和各處理種子的懸浮液100 L 于KB固體培養(yǎng)基上均勻涂板 置于28 恒溫培養(yǎng)箱中倒置 培養(yǎng)48 h 觀察菌落生長(zhǎng)情況 每處理設(shè)3皿重復(fù) 1 2 4 1 選擇性KB平板的制備及涂板 選擇性KB培養(yǎng)基 蛋白胨20 g L 丙三醇10 mL L MgSO4 7H2O 1 5 g L K2HPO4 1 5 g L 瓊脂 15 g L pH調(diào)至7 0 121 滅菌20 min 冷卻至50 時(shí)加入氨芐青霉素20 mg L 新生霉素5 mg L 放線 菌酮25 mg L 取CK和5種處理種子的懸浮液100 L 于選擇性KB培養(yǎng)基上均勻涂板 置于28 溫箱 中恒溫倒置培養(yǎng)48 h 觀察菌落生長(zhǎng)情況 1 2 4 2 總菌落DNA提取及PCR檢測(cè) 用無菌水沖洗選擇性KB培養(yǎng)基表面上分離培養(yǎng)的所有細(xì)菌菌落 離心濃縮 提取細(xì)菌的基因組 DNA 16 并以此為模板 進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證 反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序同1 2 2 1 2 4 3 不同濃度細(xì)菌性果斑病菌懸浮液的制備及涂板 挑取細(xì)菌性果斑病標(biāo)準(zhǔn)菌株于液體KB培養(yǎng)基中 28 振蕩培養(yǎng)過夜 離心收集菌體 1 mL無菌水 54 李菊芬 等 甜瓜細(xì)菌性果斑病帶菌種子的處理方法研究 吹打至懸浮狀態(tài) 根據(jù)OD600值分別配成2 104 cfu mL 2 103 cfu mL 2 102 cfu mL 3個(gè)濃度梯度 分別 在選擇性KB培養(yǎng)基和KB培養(yǎng)基上進(jìn)行涂板 每個(gè)濃度重復(fù)3皿 觀察選擇性KB培養(yǎng)基對(duì)細(xì)菌性果斑 病菌生長(zhǎng)的影響 1 2 5 不同處理對(duì)種子發(fā)芽的影響 取CK和不同處理種子各100粒 浸泡12 h 置于28 恒溫培養(yǎng)箱中催芽24 h 統(tǒng)計(jì)發(fā)芽率 根長(zhǎng) 以 此判定各處理對(duì)種子發(fā)芽的影響 3次重復(fù) 2 結(jié)果與分析 2 1 PCR與實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè) PCR檢測(cè)結(jié)果顯示 圖1 CK和處理1 4均可擴(kuò)增出特異性目的條帶 279 bp 但條帶亮度有所差 異 其中CK最亮 處理4 包衣處理 的條帶亮度最淡 處理5 70 高溫處理 包衣處理 未擴(kuò)增出目的 條帶 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示 圖2 與CK相比 處理1 4的種子相對(duì)帶菌量均有不同程度的降低 且呈遞減趨勢(shì) 處理4的種子相對(duì)帶菌量降幅最為明顯 處理5基本檢測(cè)不到帶菌 500bp 200bp M CKCK 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 M DL2000 Ladder 1 5 處理1 5 圖1 5種不同處理帶菌甜瓜種子的PCR檢測(cè)結(jié)果 Fig 1 PCR detection of melon seeds carrying pathogens treated with 5 different treatments 1 2 1 0 0 8 0 6 0 4 0 2 0 處 理 細(xì) 菌 性 果 斑 病 菌 相 對(duì) 含 量 1 2 3 4 5CK 處理 細(xì) 菌 性 果 斑 病 菌 相 對(duì) 含 量 圖2 5種不同處理帶菌甜瓜種子的實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果 Fig 2 Quantitative real time PCR results of melon seeds carrying pathogens treated with 5 different treatments 上述結(jié)果表明 帶菌甜瓜種子經(jīng)5種處理后 種子帶菌量均有所下降 其中以70 高溫 包衣處理 的殺菌效果最佳 CK 1 2 3 4 5 CK 1 2 3 4 5 A B 1 5 處理1 5 圖3 不同處理的種子懸浮液在KB A 和選擇性KB B 培養(yǎng)基上的涂板結(jié)果 Fig 3 Suspension incubation results of different treatment seeds on KB medium A and selective KB medium B 2 2 活菌分離檢測(cè) 2 2 1 KB和選擇性KB培養(yǎng)基的涂板及總菌落DNA的PCR檢測(cè) 不同處理的種子懸浮液在KB培養(yǎng)基上涂板 經(jīng)28 恒溫培養(yǎng)48 h后 各處理和CK均有菌落長(zhǎng)出 其 中以CK長(zhǎng)出的菌落最為密集 處理1次之 處理2 5的菌落總數(shù)雖相對(duì)較少 但雜菌生長(zhǎng)旺盛 圖3A 由 于雜菌量過多 且生長(zhǎng)速度較細(xì)菌性果斑病菌快 嚴(yán)重影響了總菌落DNA的PCR檢測(cè)結(jié)果 因此 選用優(yōu) 64 上 海 農(nóng) 業(yè) 學(xué) 報(bào) 化的選擇性KB培養(yǎng)基進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn) 500bp 250bp M Ac CK CK CK 1 1 1 M DL2000 Ladder Ac 細(xì)菌性果斑病菌 1 處理1 圖4 CK和處理1種子中分離的細(xì)菌性果斑病菌的PCR檢測(cè) Fig 4 PCR detection of Acidovoras avenae subsp citrulli isolated from the melon seeds of CK and treatment 1 選擇性KB培養(yǎng)基的涂板結(jié)果表明 圖3B 只 有CK和處理1有菌落長(zhǎng)出 處理2 5均無菌落長(zhǎng) 出 提取CK和處理1的總菌落DNA進(jìn)行PCR檢 測(cè)表明 圖4 二者均能擴(kuò)增出目的條帶 279 bp 2 2 2 選擇性KB培養(yǎng)基對(duì)果斑病菌生長(zhǎng)的影響 將細(xì)菌性果斑病菌標(biāo)準(zhǔn)菌株懸浮液稀釋成2 104 cfu mL至2 102cfu mL 3個(gè)10倍濃度梯度 分 別在KB和選擇性KB培養(yǎng)基上涂板 結(jié)果表明 細(xì) 菌性果斑病病菌在KB和選擇性KB培養(yǎng)基上長(zhǎng)出 的菌落生長(zhǎng)速度一致 數(shù)量相當(dāng) 且菌落數(shù)目呈梯 度變化 說明選擇性KB培養(yǎng)基對(duì)細(xì)菌性果斑病標(biāo) 準(zhǔn)菌株的生長(zhǎng)無影響 圖5 A B 從左到右依次為2 104 2 102 cfu mL 圖5 不同稀釋濃度的細(xì)菌性果斑病菌在選擇性KB A 和KB培養(yǎng)基 B 上的生長(zhǎng)情況 Fig 5 Growth of Acidovoras avenae subsp citrulli on selective KB medium A and KB medium B with different dilutions 2 3 不同處理對(duì)種子萌發(fā)的影響 由表1可知 處理3對(duì)種子發(fā)芽率的影響較為明顯 發(fā)芽率僅為87 CK和其他4種處理的發(fā)芽率 均在90 以上 處理1和處理4的種子平均根長(zhǎng)較CK增長(zhǎng)顯著 處理5與CK無顯著差異 而處理2和 處理3的種子根長(zhǎng)生長(zhǎng)卻受到明顯抑制 表1 不同處理對(duì)種子發(fā)芽的影響 Table 1 Effects of different treatments on seed germination 處理總數(shù) 粒發(fā)芽數(shù) 粒發(fā)芽率 平均根長(zhǎng) mm CK 100 97 97 7 69 2 27 c 處理1 100 96 96 8 76 2 24 d 處理2 100 91 91 3 86 1 16 b 處理3 100 87 87 2 12 0 60 a 處理4 100 95 95 9 79 2 55 e 處理5 100 94 94 7 18 2 15 c 注 同列不同字母代表差異顯著 P 0 05 3 結(jié)論與討論 PCR和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明 除處理5外 CK和處理1 4均能檢測(cè)到細(xì)菌性果斑病菌 但帶 菌程度不同 帶菌量呈遞減趨勢(shì) 用選擇性KB培養(yǎng)基進(jìn)行涂板 可在很大程度上抑制雜菌的生長(zhǎng) 但對(duì) 細(xì)菌性果斑病菌的生長(zhǎng)無明顯影響 活菌分離試驗(yàn)表明 只有CK和處理1的種子上能分離到細(xì)菌性果 斑病菌 發(fā)芽試驗(yàn)表明 只有處理2和處理3對(duì)種子的萌發(fā)和生長(zhǎng)有抑制作用 綜合試驗(yàn)結(jié)果 處理5 70 高溫 包衣 既不影響種子發(fā)芽 又可有效殺滅細(xì)菌性果斑病菌 效果最佳 另外 雖然處理2 4的種子PCR和熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果均顯示陽性 但均未分離到活的細(xì)菌性 果斑病菌 究其原因 可能是帶菌種子經(jīng)過這3種方式處理后 其攜帶的細(xì)菌性果斑病菌已被殺滅 但仍 存在不同程度的DNA殘留 PCR和熒光定量PCR以殘留的DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增 所以呈現(xiàn)陽性結(jié)果 因此 在種子細(xì)菌性果斑病菌的檢驗(yàn)檢疫過程中 除了常規(guī)的PCR檢測(cè)或者血清學(xué)檢測(cè)方法外 還應(yīng)進(jìn)行 活菌分離或生長(zhǎng)法來檢測(cè)種子的帶菌情況 這樣檢測(cè)的結(jié)果才更加準(zhǔn)確可靠 74 李菊芬 等 甜瓜細(xì)菌性果斑病帶菌種子的處理方法研究 參 考 文 獻(xiàn) 1 LATIN R X Bacterial fruit blotch of watermelon The hypothetical exam question becomes reality J Plant Disease 1995 79 8 761 765 2 O BRIEN R G MARTIN H L Bacterial blotch of melons caused by strains of Acidovorax avenae subsp citrulli J Australian Journal of Experimental Agriculture 1999 39 4 479 485 3 LANGSTOND B J WALCOTT R R GITAITIS R D et al First report of a fruit rot of pumpkin caused by Acidivorax avenae subsp citrulli in Georgia J Plant Disease 1999 83 2 199 4 SCHAAD N W G SOWELL J R GOTH RW et al Pseudomonas pseudoalcaligenes subsp citrullis subsp nov J International Journal of Systematic Bacteriology 1978 28 1 117 125 5 WILLEMS A GOOR M THIELEMANS S et al Transfer of several phytopathogenic Pseudomonas species to Acidovorax avenae subsp nov comb nov Acidovorax avenae subsp citrulli Acidovorax avenae subsp cattleyae and Acidovorax avenae subsp konjaci J International Journal of Systematic Bacteriology 1992 42 1 107 119 6 趙廷昌 王建榮 孫福在 等 哈密瓜細(xì)菌性果斑病綜合治理指南 J 植保技術(shù)與推廣 2003 23 4 17 18 7 RANE K K LATIN R X Bacterial fruit blotch of watermelon association of the pathogen with seed J Plant Disease 1992 76 5 509 512 8 WALCOTT R R GITAITIS R D CASTRO A C Role of blossoms in watermelon seed infestation by Acidovorax avenae subsp Citrulli J Phytopathology 2003 93 5 528 534 9 BAHAR O EFRAT M HADAR E et al New subspecies specific polymerase chain reaction based assay for the detection of Acidovorax avenae subsp citrulli J Plant Pathology 2008 57 4 754 763 10 回文廣 趙廷昌 Schaad N W 等 哈密瓜細(xì)菌性果斑病菌快速檢測(cè)方法的建立 J 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué) 2007 40 11 2495 2501 11 田艷麗 胥婧 趙玉強(qiáng) 等 利用PCR技術(shù)專化性檢測(cè)瓜類細(xì)菌性果斑病菌 J 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2010 26 3 512 516 12 任毓忠 李暉 李國(guó)英 等 哈密瓜細(xì)菌性果斑病種子帶菌的PCR檢測(cè) J 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué) 2004 41 5 329 332 13 馮建軍 許勇 李建強(qiáng) 等 免疫凝聚試紙條和TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)西瓜細(xì)菌性果斑病菌比較研究 J 植物病理學(xué)報(bào) 2006 36 2 102 108 14 王政 胡俊 哈密瓜細(xì)菌性果斑病種子帶菌血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)的初探 J 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) 2005 26 3 20 23 15 蔡馥宇 關(guān)巍 喬培 等 瓜類細(xì)菌性果斑病研究新進(jìn)展 J 中國(guó)瓜菜 2017 30 11 1 5 16 盧圣棟 現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù) M 2版 北京 中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社 1999 34 36 責(zé)任編輯 閆其濤 84