收稿日期 2019 09 23 基金項(xiàng)目 國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃支持課題 2018YFD1000401 上海市花卉產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè) 滬農(nóng)科產(chǎn)字 2019 第8號(hào) 作者簡(jiǎn)介 陳敏敏 1982 女 博士 副研究員 研究方向?yàn)榛ɑ苓z傳育種 E mail cmm0707 163 com 通信作者 E mail saasflower 163 com 上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào) 2020 36 6 13 17 http www nyxb sh cn Acta Agriculturae Shanghai DOI 10 15955 j issn1000 3924 2020 06 03 陳敏敏 張永春 蔡友銘 等 利用流式細(xì)胞術(shù)快速鑒定61份百合品種倍性 J 上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào) 2020 36 6 13 17 利用流式細(xì)胞術(shù)快速鑒定61份百合品種倍性 陳敏敏1 張永春1 蔡友銘1 楊柳燕1 聶功平2 1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院林木果樹(shù)研究所 上海市設(shè)施園藝技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海201403 2長(zhǎng)江大學(xué)園藝園林學(xué)院 荊州434025 摘 要 采用流式細(xì)胞儀倍性鑒定方法分析61個(gè)百合品種的染色體倍性 結(jié)果表明 亞洲百合 東方百合等 組內(nèi)雜交品種二倍體較多 19個(gè)亞洲百合品種中 僅1個(gè)三倍體 2個(gè)四倍體 其余16個(gè)均為二倍體 16個(gè)東方 百合均為二倍體 而LA OT等組間雜交品種大部分為三倍體 15個(gè)LA品種中有14個(gè)為三倍體 9個(gè)OT品種 中有6個(gè)為三倍體 2個(gè)Martagon品種中有1個(gè)為二倍體 1個(gè)為三倍體 部分二倍體和三倍體品種出現(xiàn)染色 體非整倍化現(xiàn)象 流式細(xì)胞儀鑒定法可縮短鑒定時(shí)間 提高鑒定效率 關(guān)鍵詞 百合 流式細(xì)胞儀 倍性 品種 中圖分類號(hào) S682 29 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1000 3924 2020 06 013 05 Ploidy identification of 61 lily cultivars by flow cytometry CHEN Minmin1 ZHANG Yongchun1 CAI Youming1 YANG Liuyan1 NIE Gongping2 1 Forest and Fruit Tree Research Institute Shanghai Academy of Agricultural Sciences Shanghai Key Laboratory of Protected Horticultural Technology Shanghai 201403 China 2 College of Horticulture and Gardening Yangtze University Jingzhou 434025 China Abstract Chromosome ploidy of 61 lily cultivars were analyzed by flow cytometry identification method in this paper Results showed that most intra section hybridization cultivars of Asiatic and Oriental lily were diploid except for 1 triploid and 2 tetraploid Asiatic cultivars Most inter section hybridization cultivars i e LA OT were triploid 14 of the 15 LA cultivars as well as 6 of the 9 OT cultivars were triploid The two Martagon cultivars were diploid and triploid Chromosomal aneuploidy occured in some cultivars Flow cytometry identification method shortens the assessment time and improves the assessment efficiency Key words Lilium spp Flow cytometry Ploidy Cultivars 百合 Lilium spp 為百合科百合屬重要的球根花卉 廣泛分布于北半球寒帶與溫帶地區(qū) 目前世界 范圍內(nèi)已知的野生百合超過(guò)100種 已注冊(cè)的商業(yè)品種則超過(guò)上萬(wàn)種 1 百合園藝新品種更新速度快 開(kāi) 展新優(yōu)品種自主選育對(duì)我國(guó)百合產(chǎn)業(yè)的發(fā)展至關(guān)重要 然而 商業(yè)品種一般雜合度高 遺傳背景復(fù)雜 不 同種系內(nèi)與種系間開(kāi)展雜交育種工作較為盲目 因此 開(kāi)展遺傳倍性鑒定對(duì)雜交育種工作尤為重要 根據(jù)英國(guó)皇家園藝學(xué)會(huì)與北美百合學(xué)會(huì)制定的分類系統(tǒng) 百合主要分為亞洲百合雜種系 Asiatic hybrids A 東方百合雜種系 Oriental hybrids O 麝香百合雜種系 Longiflorum L 喇叭形和奧瑞蓮雜種 系 Trumpet and Aurelian Hybrids T 歐洲百合雜種系 Martagon Hybrids 美洲百合雜種系 American Hybrids 純白百合雜種系 Candidum Hybrids 其他種間雜交產(chǎn)生的雜種系 包括LA LO OT OA OL 等 種內(nèi)雜交一般產(chǎn)生AA LL OO TT等二倍體品種群 但也容易產(chǎn)生三倍體品種群 如鐵炮系 LLL 亞洲系 AAA 東方系 OOO 等 2 種間雜交容易產(chǎn)生三倍體 如三倍體LAA或ALA雜交后代是鐵炮 系 L 亞洲系 A 雜交后代 LA 與亞洲系 A 回交的結(jié)果 東方系 O 與喇叭系 T 的雜交后代 OT 作 陳敏敏 等 利用流式細(xì)胞術(shù)快速鑒定61份百合品種倍性 為父本或母本與東方系 O 回交產(chǎn)生OOT或OTO 3 百合倍性相關(guān)研究表明 除卷丹為三倍體外 大部分野生百合為二倍體 4 組間雜種多為三倍體 四 倍體和一些非整倍體 5 李克虎等 4 采用染色體常規(guī)制片技術(shù)對(duì)45個(gè)百合品種進(jìn)行倍性分析 發(fā)現(xiàn)組 內(nèi)雜交品種大部分為二倍體 組間雜交品種大部分為三倍體 周桂雪等 6 報(bào)道組內(nèi)品種群如東方百合和 麝香百合一般為二倍體 而組間品種多為三倍體 Marasek Ciolakowska等 5 也報(bào)道三倍體LAA ALA 和 OOT OTO 雜交種在百合品種中占很大比例 流式細(xì)胞術(shù) FCM 是20世紀(jì)80年代興起的一項(xiàng)新技術(shù) 能簡(jiǎn)單 快速的檢測(cè)植物的倍性 已被用于 多種植物育種及倍性的鑒定中 7 10 本研究擬針對(duì)部分百合園藝新品種倍性不詳?shù)那闆r 采用本實(shí)驗(yàn)室 前期建立的流式細(xì)胞儀倍性鑒定方法開(kāi)展倍性快速鑒定 11 旨在為品種資源的高效利用與育種效率的提 高奠定基礎(chǔ) 1 材料與方法 1 1 材料 61個(gè)代表性百合主栽品種均引自荷蘭 包括19個(gè)亞洲百合品種 16個(gè)東方百合品種 15個(gè)LA雜交 品種 9個(gè)OT雜交品種和2個(gè)Martagon系雜交品種 二倍體對(duì)照材料為索邦 Sorbonne 2n 2x 24 三倍體對(duì)照材料為木門 Conca d or 2n 3x 36 1 2 流式細(xì)胞儀倍性鑒定 取新鮮待測(cè)植物葉片0 1 0 15 g 放置于直徑為6 cm的培養(yǎng)皿中 加入1 0 1 5 mL Kiwifruit Buffer 裂解液 同時(shí)用鋒利刀片一次性快速切碎葉片至糊狀 確保整個(gè)過(guò)程中材料浸沒(méi)在解離液里 以便更好地 游離細(xì)胞核 提取時(shí)間60 s 將培養(yǎng)皿中的液體用30 m濾網(wǎng)過(guò)濾到1 5 mL離心管中 濾液保持在 1 0 mL左右 置于4 冰箱5 min 取出樣品 4 下1 000 r min離心5 min 棄上清 加入600 L解離液 與60 L預(yù)冷PI染色液于4 避光染色15 min 處理結(jié)束后上機(jī)測(cè)試 所用儀器為BeckmanColour流式 細(xì)胞儀 采用Excel 2010軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理 2 結(jié)果與分析 被檢測(cè)的61個(gè)百合品種可以分為5類 包括亞洲百合 A 東方百合 O LA OT Martagon系 對(duì)不 同種系的倍性情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析 結(jié)果表明 19個(gè)亞洲百合品種中 16個(gè) Heartstrings White Twinkle Trendy Savannah Fata Morgana Matrix Trendy Havana Golden Matrix Tribal Dance 600 Trendy Dakota Tiny Padhye Tiny Bee Tiny Rocket Tiny Invader Tiny Double You Tiny Pearl Levi 為 二倍體 2n 2x 24 1個(gè)品種 Lancifolium Flore Pleno 為三倍體 2n 3x 36 2個(gè)品種 Pink Flight Pearl Frances 為四倍體 2n 4x 48 圖1 種內(nèi)雜交的亞洲百合大部分為二倍體 占所有測(cè) 定品種的23 26 16個(gè)東方百合品種中 15個(gè)品種 Roselily Elena After Eight Sheer Blonde Sunny Martinique Sunny Keys Marlon Roselily Monica Roselily Natalia Reeleeze Roselily Samantha Souvenir Roselily Thalita Sunny Azores Roselily Isabella Entertainer 為二倍體 2n 2x 24 1個(gè)品種 Viviana 出現(xiàn)二倍體非整倍體現(xiàn)象 圖2 種內(nèi)雜交的東方百合大部分為二倍體 占所有測(cè)定品種 的24 59 15個(gè)LA品種中 11個(gè)品種 Albufeira Armandale Beau Soleil Golden Stone Merlet Flamington Nashville Bonsoir Royal Sunset Eyeliner Indian Summerset 為三倍體 2n 3x 36 1個(gè)品種 Honesty 為四倍體 2n 4x 48 3個(gè)品種 Bach Fangio Mynnou 出現(xiàn)三倍體非整倍 化現(xiàn)象 種間雜交的LA品種大部分為三倍體 15個(gè)LA品種中11個(gè)為三倍體 占測(cè)定品種的18 03 圖3 9個(gè)OT品種中 1個(gè)品種 Black Beauty 為二倍體 2n 2x 24 5個(gè)品種 Touchstone Palazzo Manissa Profundo Competition 為三倍體 2n 3x 36 2個(gè)品種 Passion Moon White Eyes 為 四倍體 2n 4x 48 1個(gè)品種 Zambesi 出現(xiàn)三倍體非整倍化現(xiàn)象 種間雜交的OT品種大部分為 41 上 海 農(nóng) 業(yè) 學(xué) 報(bào) 200 400 600 800 FL4 250 200 150 100 50 0 c o u n t s 0 1000 1 FL4 100 80 60 40 20 0 c o u n t s 2 FL4 100 80 60 40 20 0 c o u n t s 3 200 400 600 8000 1000 200 400 600 8000 1000 FL4 100 80 60 40 20 0 c o u n t s 4 200 400 600 8000 1000 FL4 100 80 60 40 20 0 c o u n t s 6 FL4 250 200 150 100 50 0 c o u n t s 7 200 400 600 8000 1000 200 400 600 8000 1000 FL4 100 80 60 40 20 0 c o u n t s 8 200 400 600 8000 1000 FL4 100 80 60 40 20 0 c o u n t s 5 200 400 600 8000 1000 FL4 100 80 60 40 20 0 c o u n t s 10 FL4 100 80 60 40 20 0 c o u n t s 11 200 400 600 8000 1000 200 400 600 8000 1000 FL4 100 80 60 40 20 0 c o u n t s 12 200 400 600 8000 1000 FL4 100 80 60 40 20 0 c o u n t s 9 200 400 600 8000 1000 FL4 200 160 120 80 40 0 c o u n t s 14 FL4 100 80 60 40 20 0 c o u n t s 15 200 400 600 8000 1000 200 400 600 8000 1000 FL4 200 160 120 80 40 0 c o u n t s 16 200 400 600 8000 1000 FL4 100 80 60 40 20 0 c o u n t s 13 200 400 600 8000 1000 1為二倍體對(duì)照 2為三倍體對(duì)照 3 5為亞洲百合 其中3為二倍體 4為三倍體 5為四倍體 6 8為東方百合 均為二倍體 9 11為L(zhǎng)A百 合 均為三倍體 12 14為OT百合 其中12為四倍體 13為三倍體 14為二倍體 15 16為Martagon系百合 其中15為三倍體 16為二倍體 圖1 部分百合品種流式細(xì)胞儀倍性鑒定 Fig 1 Ploidy identification of some lily varieties by flow cytometry 200 400 600 800 FL4 25 20 15 10 5 0 c o u n t s 0 1000 1 200 400 600 800 FL4 100 80 60 40 20 0 c o u n t s 0 1000 2 200 400 600 800 FL4 50 40 30 20 10 0 c o u n t s 0 1000 3 200 400 600 800 FL4 100 80 60 40 20 0 c o u n t s 0 1000 4 200 400 600 800 FL4 50 40 30 20 10 0 c o u n t s 0 1000 5 1為東方百合 Viviana 與三倍體對(duì)照 Conca d or 2為二倍體對(duì)照 Sorbonne 與LA品種 Bach 3為二倍體對(duì)照 Sorbonne 與LA品 種 Fangio 4為二倍體對(duì)照 Sorbonne 與LA品種 Mynnou 5為二倍體對(duì)照 Sorbonne 與OT品種 Zambesi 圖2 非整倍體百合流式細(xì)胞儀鑒定 Fig 2 Flow cytometry identification of aneuploid lilies 51 陳敏敏 等 利用流式細(xì)胞術(shù)快速鑒定61份百合品種倍性 三倍體 9個(gè)OT品種中5個(gè)為三倍體 占測(cè)定品種的8 20 圖3 2個(gè)Martagon品種中 1個(gè)品種 Manitoba Morning 為二倍體 2n 2x 24 1個(gè)品種 Sunny Morning 為三倍體 2n 3x 36 A三倍體 1 64 A四倍體 3 28 O二倍體 24 59 LA三倍體 18 03 O二倍非整倍 1 64 A二倍體 23 26 M三倍體 1 64 M二倍體 1 64 OT三倍 非整倍體 1 64 OT四倍體 3 28 OT二倍體 1 64 LA四倍體 1 64 LA三倍非整 倍 4 92 OT三倍體 8 20 圖3 不同種類百合倍性 Fig 3 Ploidy identification of different lily cultivars 3 討論 我國(guó)野生百合資源豐富 幾大系中 亞洲百合 Asiatic hybrids 是由Sinomartagon系 包括Lilium dauricum Lilium lancifolium等 種內(nèi)雜交形成 12 東方百合 Oriental hybrids 則是Archelirion系種內(nèi)雜交 形成 鐵炮百合 Longiflorum hybrids 是Leucolirion系種內(nèi)雜交形成 13 本研究中不同種系品種鑒定結(jié)果 表明 19個(gè)亞洲百合中有16個(gè)為二倍體 16個(gè)東方百合有15個(gè)為整二倍體 與李克虎等 4 周桂雪 等 6 簡(jiǎn)佳等 14 報(bào)道的大部分百合組內(nèi)雜交品種為二倍體一致 19個(gè)亞洲百合中有1個(gè)三倍體 有2個(gè) 四倍體 這一結(jié)果與李克虎等 4 報(bào)道的切花亞洲百合多為二倍體 但也有部分三倍體和四倍體品種 與 Zhou等 2 報(bào)道的亞洲百合種內(nèi)雜交也易產(chǎn)生三倍體結(jié)果一致 15個(gè)LA百合有11個(gè)為三倍體 9個(gè)OT 百合有5個(gè)三倍體 圖3 與李克虎等 4 報(bào)道的組間雜交品種多為三倍體結(jié)果一致 榮立蘋等 15 采用根尖壓片法對(duì)卷丹 毛百合 朝鮮百合 蘭州百合 大花卷丹 有斑百合 細(xì)葉百合 垂 花百合的染色體數(shù)目進(jìn)行了觀察研究 結(jié)果表明2 10 二倍體種中出現(xiàn)了染色體數(shù)目的非整倍性變 異 在部分百合中還觀察到B染色體 Khan等 16 報(bào)道當(dāng)二倍體LA雜交種與親本亞洲百合后代回交時(shí) 會(huì)產(chǎn)生二倍體 三倍體和非整倍體 2x 1 2x 2 2x 3 雜交后代 Luo等 17 報(bào)道三倍體OT雜種 OOT 的BC2后代是非整倍體 其染色體數(shù)目從25到29不等 Xi等 18 報(bào)道異源三倍體LO雜交種 LLO 易產(chǎn) 生非整倍體功能性雌性配子 從而造成所有的后代均為非整倍體 因此 商品種會(huì)出現(xiàn)一定比例的非整 倍體 本研究中也鑒定出1個(gè)二倍體非整倍體品種和4個(gè)三倍體非整倍體品種 包括了東方百合 LA和 OT百合 說(shuō)明不同種系均可能出現(xiàn)非整倍體 不同倍性的百合材料雜交親和性不同 Johnston 19 提出Endosperm Balance Number EBN 假說(shuō) 認(rèn)為 在雜種胚乳中 只有當(dāng)母本基因與父本基因比為2 1時(shí)胚乳才可以正常發(fā)育 否則胚乳的發(fā)育會(huì)停滯 向 仕華等 20 報(bào)道以四倍體為母本的雜交組合種子萌發(fā)率遠(yuǎn)高于以二倍體為母本的雜交組合 Barba Gonzalez等 21 報(bào)道以二倍體為母本與三倍體百合進(jìn)行雜交能獲得子代 而以四倍體為母本 三倍體為父 本時(shí)沒(méi)有獲得子代 上述研究表明 不同倍性百合做親本時(shí)會(huì)顯著影響雜交子代 因此在親本選配前了 解倍性有利于提高雜交效率 另外 多倍體百合相較二倍體不僅觀賞性更佳 抗性更強(qiáng) 而且作為雜交親 61 上 海 農(nóng) 業(yè) 學(xué) 報(bào) 本有可能可以克服遠(yuǎn)緣雜交的不育性 22 從Da Laat等 23 首次采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)植物倍性水平以來(lái) 該方法已成為植物倍性鑒定的常用方 法 較傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定與染色體計(jì)數(shù)鑒定法 流式細(xì)胞儀鑒定法具有如下優(yōu)點(diǎn) 樣品制備程序簡(jiǎn)單 檢 測(cè)通量高 可在較短時(shí)間內(nèi)快速檢測(cè)大量樣品 精準(zhǔn)度高 每個(gè)樣品可收集大量細(xì)胞核進(jìn)行檢測(cè) 同時(shí) 這 種方法僅需少量植物材料 對(duì)植物破壞性小 本研究采用本實(shí)驗(yàn)室已建立的鑒定方法對(duì)61個(gè)百合品種 葉片材料進(jìn)行快速倍性鑒定 獲得的結(jié)果可為花期不同種系間雜交組合的配制提供理論參考 本研究發(fā) 現(xiàn)以二倍體品種 Sorbonne 或三倍體品種 Conca d or 為對(duì)照進(jìn)行倍性檢測(cè)時(shí) 有5個(gè)品種存在非 整倍體現(xiàn)象 圖2 圖3 但流式細(xì)胞儀僅能檢測(cè)出其為非整倍體 無(wú)法確定其增加或缺失的染色體條數(shù) 仍需用染色體壓片或熒光原位雜交技術(shù)對(duì)這些品種進(jìn)行進(jìn)一步確定 參 考 文 獻(xiàn) 1 VAN TUYL J M ARENS P MARASEK CIOLAKOWSKA A In Kamenetsky R and H Okubo eds Ornamental geophytes from basic science to sustainable horticultural production M Boca Raton CRC press 2011 2 ZHOU S VAN TUYL J M Different ways to create triploid lilies J The Lily Yearbook of the North American Lily Society 2011 2012 63 95 99 3 ZHANG X REN G LI K et al Genomic variation of new cultivars selected from distant hybridization in Lilium J Plant Breeding 2012 131 227 230 4 李克虎 周桂雪 任貴玲 等 百合品種染色體倍性觀察 J 園藝學(xué)報(bào) 2011 38 5 970 976 5 MARASEK CIOLAKOWSKA A NISHIKAWA T et al Breeding of lilies and tulips interspecific hybridization and genetic background J Breeding Science Preview 2018 68 1 35 52 6 周桂雪 李克虎 張線線 等 亞洲百合品種倍性 花粉育性及其雜交研究 J 園藝學(xué)報(bào) 2011 38 4 733 739 7 OCHATT S J Flow cytometry in plant breeding J Cytometry Part A 2008 73A 581 598 8 李靖 李成斌 頓文濤 等 流式細(xì)胞術(shù) FCM 在生物學(xué)研究中的應(yīng)用 J 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào) 2008 24 6 107 111 9 施春暉 徐蘭蘭 王曉慶 等 流式細(xì)胞儀鑒定獼猴桃倍性技術(shù)研究 J 植物研究 2014 34 6 845 849 10 付春華 郭文武 鄧秀新 用流式細(xì)胞儀和RAPD快速鑒定柑橘體細(xì)胞雜種 J 華中科技大學(xué)學(xué)報(bào) 2005 33 10 102 105 11 陳敏敏 周音 孫億敬 等 秋水仙素誘導(dǎo)百合多倍體及流式細(xì)胞儀倍性鑒定研究 J 上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào) 2018 34 2 82 88 12 NISHIKAWA T OKAZAKI K ARAKAWA K et al Phylogenetic analysis of section Sinomartagon in Genus Lilium using sequences of the internal transcribed spacer region in Nuclear Ribosomal DNA J Breeding Science 2001 51 39 46 13 WU H ZHENG S HE Y et al Diploid female gametes induced by colchicine in Oriental lilies J Scientia Horticulturae 2007 114 50 53 14 簡(jiǎn)佳 方李琴 譚欣 等 盆栽亞洲百合的雜交和染色體加倍 J 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào) 2013 21 5 627 630 15 榮立蘋 雷家軍 畢曉穎 等 8種野生百合染色體數(shù)目的變異 J 東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) 2009 37 9 48 50 16 KHAN N ZHOU S RAMANNA M S et al Potential for analytic breeding in allopolyploids an illustration from Longiflorum Asiatic hybrid lilies Lilium J Euphytica 2009 166 399 409 17 LUO J R RAMANNA M S ARENS P et al GISH analyses of backcross progenies of two Lilium species hybrids and their relevance to breeding J Journal of Horticultural Science Biotechnology 2012 87 654 660 18 XI M VAN TUYL J M ARENS P GISH analyzed progenies generated from allotriploid lilies as female parent J Scientia Horticulturae 2015 183 130 135 19 JOHNSTON S A The significance of genic balance to endosperm development in interspecific crosses J Theoretical and Applied Genetics 1980 57 1 5 7 20 向仕華 鄭思鄉(xiāng) 趙雁 等 不同倍性東方百合雜交后代染色體數(shù)目觀察 J 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) 2007 22 5 631 634 21 BARBA GONZALEZ R VAN SILFHOUT R A A RAMANNA M S et al Progenies of allotriploids of Oriental Asiatic lilies Lilium examined by GISH analysis J Euphytica 2006 151 243 250 22 徐順超 呂英民 百合雜交育種中染色體研究進(jìn)展 J 園藝學(xué)報(bào) 2012 39 9 1809 1818 23 DE LAAT A M M GOHDE W VOGELZAKG M J Determination of ploidyof single plants and plant populations by flow cytometry J Plant Breeding 1987 99 4 303 307 責(zé)任編輯 郭嬌 71