褚新培 男 碩士研究生 主要從事設(shè)施蔬菜抗逆和抗病研究 E mail chuxinpei 通訊作者 Corresponding author 高洪波 女 教授 博士生導(dǎo)師 主要從事設(shè)施蔬菜與無土栽培研究 E mail hongbogao 收稿日期 2019 12 04 接受日期 2020 03 06 基金項目 河北省重點研發(fā)計劃項目農(nóng)業(yè)關(guān)鍵共性技術(shù)攻關(guān)專項 18226907D 國家自然科學(xué)基金項目 31872132 番茄枯萎病菌分離鑒定及嫁接砧木抗病性 評價 褚新培 1 呂桂云 1 鹿秀云 2 賈邱穎 1 梁 垚 1 高洪波 1 1 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院 河北省蔬菜產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心 河北保定 071001 2 河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保 護研究所 河北保定 071000 摘 要 從河北省番茄栽培面積較大的定興和肥鄉(xiāng)地區(qū)枯萎病病株中分離純化菌株 通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)等方法對病原 菌進行鑒定 并采用浸根法鑒定了 10 個番茄砧木的枯萎病抗性 結(jié)果表明 從定興和肥鄉(xiāng)分離到的菌株均為尖孢鐮孢菌 采用尖孢鐮孢菌生理小種特異性引物進行 PCR 擴增 證明 2 個菌株都為尖孢鐮孢菌番茄?；?Fusarium oxysporum f sp lycopersici 生理小種 3 篩選得到了 3 個枯萎病高抗砧木品種 7 個抗病砧木品種 關(guān)鍵詞 番茄 枯萎病菌 砧木 抗病性 主?；?王卿和林玲 2016 目前發(fā)現(xiàn)的番茄 枯萎病菌生理小種有 3 個 分別為生理小種 1 2 3 徐艷輝 等 2008 鄭貴彬和王發(fā)科 2000 王全華等 1996 劉暉等 1991 分別對西安 黑龍江和山東地區(qū)的番茄枯萎病菌生理小種進行了 鑒定 結(jié)果均為生理小種 1 山西省的枯萎病菌除 了生理小種 1 外 生理小種 2 3 也有分布 Chang et al 2018 然而其他地區(qū)有關(guān)番茄枯萎病菌類 型和分布的研究較少 枯萎病菌生理小種目前尚不 明確 大量試驗研究和生產(chǎn)實踐表明 不同番茄品種 抗枯萎病能力存在差異 抗生理小種 2 的品種同時 也抗生理小種 1 生理小種 3 可以使抗生理小種 1 和 2 的番茄植株感病 Sato Araki 1974 Jarvis Shoemaker 1978 研究證明 嫁接栽培已經(jīng)成為 瓜類 王志強 等 2019 和茄果類 李文嘉和莫賤 友 2003 蔬菜防治枯萎病的有效途徑 嫁接苗抗 病能力主要取決于砧木的抗性 番茄嫁接砧木對枯 萎病抗性的研究起步較晚 對不同砧木抗病性的評 價以及番茄抗枯萎病指標(biāo)的篩選有待進一步深入 為此 本試驗從河北省兩個番茄主產(chǎn)區(qū)內(nèi)枯萎病發(fā) 病嚴重區(qū)域分離 純化和鑒定病原菌 旨在明確河 北省的尖孢鐮孢菌番茄?；蜕硇》N 采用浸根 的方法接菌 鑒定不同番茄砧木品種的抗病性 為 番 茄 Solanum lycopersicum 是茄科番茄屬 一年生或多年生草本植物 含有豐富的番茄紅素 胡蘿卜素和維生素等營養(yǎng)物質(zhì) 河北省作為我國番 茄主要產(chǎn)區(qū) 番茄種植區(qū)域廣泛 2018 年栽培面 積已超過 7 萬 hm 2 總產(chǎn)量逾 470 萬 t 黃志喬 2019 隨著栽培時間的延長 連作障礙日趨嚴重 近年來河北省番茄枯萎病發(fā)生情況呈逐年上升趨 勢 尤其設(shè)施生產(chǎn)中更加嚴重 常在開花期侵染番 茄莖基部造成維管束堵塞 植株萎蔫枯死 從而嚴 重影響番茄的產(chǎn)量和品質(zhì) 現(xiàn)已成為影響番茄栽培 面積擴大和效益提升的重要病害之一 張榮 等 2011 枯萎病菌是一種世界范圍內(nèi)廣泛分布的真菌 致病菌為尖孢鐮孢菌 Fusarium oxysporum 有較 強的腐生或寄生能力 通常通過土壤和種子傳病 枯萎病菌寄主范圍較廣 可以侵染西瓜 番茄 黃 瓜 香蕉 苦瓜等作物 研究證明枯萎病菌具有寄 64 中 國 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 研究論文 2020 6 64 68番茄枯萎病的快速鑒定以及減輕枯萎病對河北省番 茄生產(chǎn)的影響提供理論和實踐依據(jù) 1 材料與方法 2018 年 4 月分別從河北省定興和肥鄉(xiāng)種植番 茄的溫室中采集枯萎病典型發(fā)病植株各 10 株 在 實驗室內(nèi)分離每個病株得到菌株 從兩地菌株中各 取 5 個進行形態(tài)學(xué)鑒定和分子鑒定 然后各挑選 1 個菌株于 5 12 月在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)林教學(xué)基地日 光溫室內(nèi)進行番茄砧木抗病試驗 1 1 菌株的分離純化及鑒定 1 1 1 菌株的分離純化 采用組織分離法 取番茄 有病癥的莖段 20 30 cm 用 75 酒精消毒后 用滅菌手術(shù)刀切取發(fā)病部位 4 5 cm 的組織到滅菌 PDA 培養(yǎng)皿中 放入 25 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 3 4 d 后觀察待分離菌的生長情況 并用單孢分離法 高 微微 1992 對分離物進行純化 1 1 2 形態(tài)學(xué)鑒定 根據(jù)英國Booth 分類系統(tǒng) Booth 1971 以及菌落在 PDA 培養(yǎng)基上的顏色 和形態(tài)對定興菌株和肥鄉(xiāng)菌株進行形態(tài)學(xué)鑒定 1 1 3 生理小種鑒定 采用真菌 DNA 快速提取試 劑盒 購自生工生物工程 上海 股份有限公司 提取病菌 DNA 提取物于 20 保存 利用鐮孢 菌的通用引物 FOF1 FOR1 Mishra et al 2003 進行 PCR 擴增 反應(yīng)體系為 25 L 模板 2 L MIX 12 5 L 上 下游引物各1 L ddH 2 O 8 5 L PCR 擴增程序為 98 預(yù)變性 1 min 98 變性 8 s 51 退火 20 s 72 延伸 6 s 35 個循環(huán) 72 延伸 10 min PCR 反應(yīng)產(chǎn)物采用 1 瓊脂糖 凝膠電泳檢測 參考 Hirano 和 Arie 2009 的方法 用 2 對特異性引物 sp13f r 和 sp23f r 擴增 DNA 片 段 進行番茄枯萎病菌的生理小種鑒定 反應(yīng)體系 為 25 L 模板 2 L MIX 12 5 L 上 下游引物 各 1 L ddH 2 O 8 5 L PCR 擴增程序為 98 預(yù) 變性 45 s 98 變性 7 s 51 退火 20 s 72 延 伸 4 s 35 個循環(huán) 72 延伸 2 min PCR 反應(yīng)產(chǎn) 物采用 1 瓊脂糖凝膠電泳檢測 1 2 砧木抗病性評價 1 2 1 砧木培養(yǎng) 砧木種子經(jīng)溫湯浸種后播于滅 菌的基質(zhì)穴盤內(nèi)進行育苗 待幼苗長到兩葉一心 時進行接菌處理 砧木品種共 10 個 果砧 1 號 購自京研益農(nóng) 北京 種業(yè)科技有限公司 砧木 A1 愛好 勁霸 購自瑞克斯旺種子有限公司 CHENG GONG 購自荷蘭德奧特種子公司 歐砧 006 購自北京開心格林農(nóng)業(yè)科技有限公司 奧尼 TMS 150 番茄砧木 405 購自上海惠和種業(yè)有限 公司 砧木 3 號 購自廣州華艷種子公司 1 2 2 致病性測定 用 PDA 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)定興 和肥鄉(xiāng)地區(qū)純化后的菌株 用 PDB 培養(yǎng)液搖菌過 濾菌絲 調(diào)整孢子液濃度為 1 10 7 個 mL 1 采用 浸根法接種病菌 王全華 等 1996 每個菌株接 種 18 株 以不接菌處理作為對照 接種后 15 d 統(tǒng) 計病情指數(shù) 1 2 3 病情指數(shù)調(diào)查 病情分級標(biāo)準 柏敏戰(zhàn)和鄭 貴 彬 1997 0 級 無癥狀 1 級 1 2 片子葉 明顯變黃以致脫落 2 級 1 2 片真葉變黃或全株 發(fā)黃 葉片萎蔫下垂 3 級 全株明顯萎蔫或真葉 嚴重變黃 生長受抑制 矮化 4 級 全株嚴重萎蔫 枯死 各級發(fā)病株數(shù) 相應(yīng)發(fā)病級數(shù) 最高發(fā)病級數(shù) 接種總株數(shù) 病情指數(shù) 100 群體抗病性劃分標(biāo)準 高抗 HR 0 病情 指數(shù) 5 抗 病 R 5 病情指數(shù) 20 耐 病 T 20 病情指數(shù) 40 感病 S 病情指數(shù) 40 1 3 數(shù)據(jù)處理 試驗數(shù)據(jù)采用 SPSS Statistics 22 和 Excel 軟件 進行分析及作圖 應(yīng)用 Duncan 新復(fù)極差法進行差 異顯著性檢驗 2 結(jié)果與分析 2 1 田間發(fā)病癥狀 圖 1 A 為番茄枯萎病發(fā)病中期整株癥狀 圖 1 B D F 分別為葉 莖 根感染枯萎病早期發(fā)病 癥狀 具體表現(xiàn)為中午時一側(cè)或兩側(cè)葉片萎蔫 早 晚恢復(fù)正常 維管束稍變褐 根系無明顯癥狀 圖 1 C E G 分別為葉 莖 根感染枯萎病晚期發(fā) 病癥狀 植株表現(xiàn)為從下部葉片開始萎蔫發(fā)黃直至 枯死 莖基部維管束變?yōu)樯詈稚?根系萎縮變少 2 2 病原菌分離純化及鑒定 2 2 1 病原菌分離純化及形態(tài)學(xué)鑒定 定興和肥鄉(xiāng) 地區(qū)各分離得到了 10 個菌株 且在形態(tài)學(xué)上表現(xiàn) 一致 在 PDA 培養(yǎng)基上分離純化得到的菌落呈白 65 中 國 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 研究論文圖 1 番茄枯萎病整株和不同部位田間發(fā)病癥狀 A 番茄枯萎病發(fā)病中期整株癥狀 B D F 分別為葉 莖 根感染枯萎病早期發(fā)病癥狀 C E G 分別為葉 莖 根感染枯萎病晚 期發(fā)病癥狀 彩色圖版見 中國蔬菜 網(wǎng)站 veg org 下圖同 色或粉紅色 圖 2 A B C D 菌絲多分枝且 具有很多銳角分叉 圖 2 E G 分生孢子有大小 兩種類型 大型分生孢子鐮刀形或紡錘形 頂端和 尾部稍彎曲 具 3 5 個隔膜 小型分生孢子長橢 A B C D E F G 圖 2 枯萎病菌菌落 菌絲及分生孢子形態(tài) A B 定興枯萎病菌菌株在 PDA 培養(yǎng)基上的菌落形態(tài) C D 肥鄉(xiāng)枯萎病菌菌株在 PDA 培養(yǎng)基上的菌落形態(tài) E G 定興和肥鄉(xiāng) 菌株菌絲形態(tài) F H 定興和肥鄉(xiāng)菌株分生孢子形態(tài) A E G F H B C D 66 中 國 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 研究論文圓形或卵形 無色 單孢 圖 2 F H 厚垣孢子 圓形或橢圓形 黃褐色 單孢 頂生或間生于菌絲上 2 2 2 生理小種鑒定 尖孢鐮孢菌通用引物 FOF1 FOR1 凝膠電泳結(jié)果證明 分離得到的 5 個定興 和 5 個肥鄉(xiāng)菌株均為尖孢鐮孢菌 利用 2 對特異 性引物 sp13f r 和 sp23f r 分別進行 PCR 擴增 結(jié) 果表明定興菌株和肥鄉(xiāng)菌株均為尖孢鐮孢菌番茄 ?；?F oxysporum f sp lycopersici 生理小種 3 圖 3 2 3 砧木枯萎病抗性評價 從定興 肥鄉(xiāng)兩地得到的菌株中各挑選 1 個 菌株進行接種 2 個菌株均能使番茄砧木品種有不 同程度的枯萎病癥狀 各品種不接菌對照病情指數(shù) 都為 0 如表 1 所 示 10 個砧木品種的病情指數(shù)均 在 20 以下 達到了抗病水平 其中勁霸 CHENG GONG TMS 150 的病情指數(shù)均在 5 以下 達到了 高抗水平 砧木 A1 番茄砧木 405 的抗病性相對 較差 病情指數(shù)在 10 以上 圖 3 番茄枯萎病菌特異性引物的 PCR 擴增結(jié)果 M DL 2000 marker 1 3 分別為定興菌株引物 FOF1 FOR1 sp13f r sp23f r 擴增結(jié)果 4 6 分別為肥鄉(xiāng)菌株引物FOF1 FOR1 sp13f r sp23f r 擴增結(jié)果 表 1 不同番茄砧木品種的枯萎病抗性評價 砧木品種 定興菌株 肥鄉(xiāng)菌株 病情指數(shù) 抗性評價 病情指數(shù) 抗性評價 果砧 1 號 7 50 R 12 50 R 砧木 A1 15 00 R 17 31 R 愛好 7 50 R 5 00 R 勁霸 1 25 HR 2 50 HR CHENG GONG 3 95 HR 2 78 HR 歐砧 006 2 27 HR 6 25 R 奧尼 8 75 R 11 84 R TMS 150 3 95 HR 2 50 HR 番茄砧木 405 10 53 R 13 75 R 砧木 3 號 5 36 R 7 14 R 注 HR 高抗 R 抗病 3 結(jié)論與討論 由于番茄尖孢鐮孢菌的抗逆性較強 防治較為 困難 因此對番茄枯萎病菌系統(tǒng)研究亟待進行 劉 暉 等 1991 鄭貴彬和王發(fā)科 2000 運用近等 位基因系品種 Ip 和 Pearsorn VF 11 VF 11 鑒定 小種法 得出山東 西安地區(qū)的枯萎病菌生理小種 均為生理小種 1 但由于試驗使用的品種存在特殊 性不能普遍適用 Baysal等 2010 Chang等 2018 利用番茄尖孢鐮孢菌生理小種的特異性引物 sp13f r 和 sp23f r 研究發(fā)現(xiàn) 西地中海地區(qū)分布有尖孢鐮 孢菌番茄?；蜕硇》N 2 和 3 山西地區(qū)生理小 種 1 2 3 都有分布 本試驗利用形態(tài)學(xué)和分子生 物學(xué)方法對番茄枯萎病菌進行鑒定 得出河北省番 茄栽培面積較大的定興 肥鄉(xiāng)兩地的菌株均為尖孢 鐮孢菌番茄?；蜕硇》N 3 對河北省番茄枯萎 病菌生理小種進行研究為后續(xù)有針對性地防治枯萎 病 培育抗病材料提供重要依據(jù) 荊子桓等 2016 利用田間抗病性鑒定方法和 分子標(biāo)記技術(shù) 對 20 份番茄砧木進行篩選 最終 得到 2 個對枯萎病 青枯病 根結(jié)線蟲等病害具有 良好抗性的聚合多抗材料 本試驗篩選出 3 個番茄 枯萎病高抗砧木 分別為勁霸 CHENG GONG 和 TMS 150 其具體抗病機制需要進一步的研究 綜 上所述 本試驗鑒定出定興和肥鄉(xiāng)地區(qū)的枯萎病菌 生理小種均為生理小種 3 且篩選得到 3 個番茄枯 萎病高抗砧木品種 為番茄枯萎病的防治提供了理 論依據(jù) 參考文獻 柏敏戰(zhàn) 鄭貴彬 1997 番茄枯萎抗病性室內(nèi)鑒定方法研究 植物 病理學(xué)報 27 1 60 64 Booth C 1971 The Genus of Fusarium 陳其煐 譯 1988 鐮刀 菌屬 北京 農(nóng)業(yè)出版社 25 35 高微微 1992 介紹一種簡便的真菌單孢子分離方法 中國中藥雜 志 3 148 黃志喬 2019 河北省番茄種植現(xiàn)狀及發(fā)展建議 河北科技報 2019 07 23 荊子桓 王先裕 龍安四 孫嵐明 陳 寶玲 2016 廣西番茄砧木 多抗材料篩選 中國蔬菜 10 28 32 李文嘉 莫賤友 2003 我國番茄嫁接技術(shù)研究進展 中國蔬菜 4 67 68 劉暉 鄭是琳 黃艷萍 1991 番茄枯萎病菌生理小種及其生物學(xué) M 1 2 3 4 5 6 2 000 bp 1 000 bp 750 bp 500 bp 250 bp 100 bp 67 中 國 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 研究論文Isolation and Identification of Tomato Fusarium Wilt and Evaluation of Disease Resistance of Grafted Rootstocks CHU Xin pei 1 LYU Gui yun 1 LU Xiu yun 2 JIA Qiu ying 1 LIANG Yao 1 GAO Hong bo 1 1 College of Horticulture Hebei Agricultural University Collaborative Innovation Center of Vegetable Industry in Hebei Baoding 071000 Hebei China 2 Institute of Plant Protection Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences Baoding 071001 Hebei China Abstract This paper seperated and purified bacterial strains from wilt tomato plants grown in Dingxing and Feixiang counties with large tomato cultivation areas of Hebei Province Mophology and molecular biology methods were adopted to identify the pathogenic bacteria The wilt resistance of 10 tomato rootstocks were identified by root dip method The results showed that both strains isolated from Dingxing and Feixiang belonged to Fusarium oxysporum f sp lycopersici PCR amplification was conducted using specificity primers of Fusarium oxysporum f sp lycopersici race It was proved that these 2 bacterial strains were specialized forms of Fusarium oxysporum f sp lycopersici race 3 Three high resistant and 7 resistant rootstock varieties were screened out Key words Tomato Fusarium wilt Rootstock Disease resistance 特性研究初報 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報 22 4 356 360 王卿 林玲 2016 瓜類枯萎病研究進展 中國瓜菜 3 1 6 王全華 李景富 李永鎬 1996 番茄枯萎病抗病育種研究進展 北方園藝 4 53 55 王志強 劉聲鋒 尚建立 郭松 楊萬邦 田梅 2019 西瓜種質(zhì) 資源枯萎病抗性鑒定 北方園藝 13 73 76 徐艷輝 李燁 許向陽 2008 番茄枯萎病的研究進展 東北農(nóng)業(yè) 大學(xué)學(xué)報 39 11 128 134 張榮 姜子德 李敏慧 習(xí)平根 2011 尖孢鐮孢菌致病機理及相 關(guān)致病基因研究進展 中國農(nóng)學(xué)通報 27 15 254 258 鄭貴彬 王發(fā)科 2000 西安地區(qū)番茄枯萎病尖鐮孢菌的生理型鑒 定 植物病理學(xué)報 30 3 30 31 Baysal Siragusa M kten H Polat I G mr kc E Yigit F Carimi F Teixeira da Silva J A 2010 Fusarium oxysporum f sp Lycopersici races and their genetic discrimination by molecular markers in West Mediterranean region of Turkey Physiological and Molecular Plant Pathology 74 1 68 75 Chang Y D Du B Ling W Wang L Ji P Xie Y J Li X F Li Z G Wang J M 2018 A study on the pathogen species and physiological races of tomato Fusarium wilt in Shanxi China Journal of Integrative Agriculture 17 6 1380 1390 Hirano Y Arie T 2009 Variation and phylogeny of Fusarium oxysporum isolates based on nucleotide sequences of polygalacturonase genes Microbes and Environments 24 113 120 Jarvis W R Shoemaker R A 1978 Toxonomic status of Fusarium oxysporum causing foot and root rot of tomato Phytopathology 68 1679 1680 Mishra P K Fox R T V Culham A 2003 Development of a PCR based assay for rapid and reliable identification of pathogenic Fusaria FEMS Microbiology Letters 2 329 332 Sato R Araki T 1974 On the tomato root rot disease occurring under vinyl house conditions in Southern Hokkaido Annual Report of the Society of Plant Protection of North Japan 25 5 13 牛牌 19 大白菜雜交種種子純度快速鑒定方法研究 作者 劉栓桃 張志剛 王立華 王榮花 李巧云 趙智 中 中國蔬菜 2020 年第 3 期 一文中 基金項目 山東省重點研發(fā)計劃項目 2014GSF21103 更正為 山東省重點研 發(fā)計劃項目 2017GSF21103 作者 信息 更 正 68 中 國 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 研究論文