柯 衛(wèi)東 男 武漢市蔬菜科學(xué)研究所副 所長兼水生蔬菜研究室主任 推廣研 究員 享受國務(wù)院政府特殊津貼 水生 蔬菜行業(yè)計劃及 十二五 國家科技支 撐計劃首席專家 主持國家及省 市重 大科研項目多項 植物遺傳資源學(xué) 報 長江蔬菜 編委 長期從事水生 蔬菜種質(zhì)資源及育種研究 在水生蔬 菜種質(zhì)資源保護(hù)及創(chuàng)新 新品種選育 微型種苗繁殖技術(shù)研究與應(yīng)用等方面 有創(chuàng)造性貢獻(xiàn) 有力推動了我國水生 蔬菜學(xué)科建設(shè)及產(chǎn)業(yè)發(fā)展 發(fā)表論文 論著 100 余篇 部 制定農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo) 準(zhǔn) 9 部 取得國家發(fā)明專利 3 項 獲國 家科技進(jìn)步獎二等獎 第四屆全國杰 出專業(yè)技術(shù)人才獎等 2019 18 DOI 10 3865 j issn 1001 3547 2019 18 015 慈姑組培苗規(guī)范化 生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程 林志城 高美萍 江文 慈 姑 Sagittaria sagittifolia L 是 澤 瀉 科 Alismataceae 慈姑屬宿根性 水生草本植物 原產(chǎn)中國 慈 姑營養(yǎng)價值高 富含淀粉 蛋 白質(zhì) 多種維生素和鉀 磷 鋅等元素 對人體機(jī)能有調(diào) 節(jié)促進(jìn)作用 此外 還具有很 高的藥用價值 中醫(yī)認(rèn)為慈 姑性味甘平 生津潤肺 補(bǔ)中 益氣 因此慈姑不但營養(yǎng)價 值豐富 還能夠敗火消炎 輔 助治療癆傷咳喘 慈姑為穗 狀花序 雌雄異花 且雄花雄 蕊多數(shù) 結(jié)實后只能形成瘦 果 采用種子繁殖自然條件 下很難發(fā)芽 成苗困難且當(dāng) 年只結(jié)細(xì)小球莖 為此 長期 以來 農(nóng)民在種植生產(chǎn)上均 采用球莖自留自繁自種 導(dǎo) 致 原 有 的 慈 姑 品 種 種 性 退 化 易受病蟲侵害 球莖小 產(chǎn)量低 品質(zhì)差 嚴(yán)重阻礙慈 姑產(chǎn)業(yè)健康持續(xù)發(fā)展 組培苗因其種質(zhì)純正 生長整齊健壯 管理方便 易 獲優(yōu)質(zhì)高產(chǎn) 可有效解決種 源帶病及品種退化問題 在 生產(chǎn)上日益得到廣泛應(yīng)用 然而由于各生產(chǎn)單位慈姑組 培苗的生產(chǎn)技術(shù)不同 生產(chǎn) 管理不一 產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)不規(guī)范 造成產(chǎn)品良莠不齊 給種植戶 帶來損失的事件屢有發(fā)生 通過制定慈姑組培苗生產(chǎn)技 術(shù)規(guī)程 規(guī)范慈姑組培苗生 產(chǎn)技術(shù) 工藝及過程 可達(dá)到 提高效益的目的 同時使慈姑 組培苗生產(chǎn)技術(shù)及產(chǎn)品質(zhì)量 有標(biāo)準(zhǔn)可依 以確保供給種植 戶使用的組培苗品種純正 遺 傳性穩(wěn)定 品質(zhì)優(yōu)良 使種植 戶獲得增產(chǎn)增收 本標(biāo)準(zhǔn)的 制定 將從源頭上為確保繁 育的慈姑組培苗實現(xiàn)優(yōu)質(zhì) 安全和穩(wěn)定可控提供技術(shù)支 撐 對發(fā)展慈姑規(guī)范化大規(guī) 模種植 促進(jìn)廣西慈姑產(chǎn)業(yè)持 續(xù)發(fā)展具有現(xiàn)實的指導(dǎo)意義 1 范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了慈姑組培 苗生產(chǎn)的術(shù)語和定義 生產(chǎn)設(shè) 備和化學(xué)試劑 消毒滅菌操 作 培養(yǎng)室環(huán)境控制 生產(chǎn)操 作 組培苗變異篩選及控制 組培苗質(zhì)量要求 生產(chǎn)管理規(guī) 章制度等技術(shù)要求 本標(biāo)準(zhǔn)適用于廣西境內(nèi) 慈姑組培苗的生產(chǎn) 2 規(guī)范性引用文件 下列文件對于本文件的 應(yīng)用是必不可少的 凡是注 基 金 項 目 廣 西 平 樂 慈 姑 試 驗 站 桂 TS201409 國 家 現(xiàn) 代 農(nóng) 業(yè) 特 色 蔬 菜 體 系 CARS 24 G 17 廣 西 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 院 基 本 業(yè) 務(wù) 專 項 2015YT055 林 志 城 廣 西 壯 族 自 治 區(qū) 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 院 生 物 技 術(shù) 研 究 所 南 寧 530007 高 美 萍 女 通 訊 作 者 副 研 究 員 廣 西 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 院 生 物 技 術(shù) 研 究 所 530007 電 話 13677716023 E mail 5476581 江 文 廣 西 壯 族 自 治 區(qū) 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 院 生 物 技 術(shù) 研 究 所 收 稿 日 期 2019 08 29 38 2019 18 日期的引用文件 僅所注日期的 版本適用于本文件 凡是不注日 期的引用文件 其最新版本 包 括所有的修改單 適用于本文 件 NY T 2306 花卉種苗組培 快繁技術(shù)規(guī)程 DB45 T 1655 芋頭組培苗 生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程 3 術(shù)語和定義 下列術(shù)語與定義適用于本 文件 3 1 頂芽 著生在球莖上部的芽 3 2 外植體 球莖頂芽和匍匐莖的頂端 生長點 3 3 變異株 在組培生產(chǎn)過程中受到種 源純度 培養(yǎng)基 培養(yǎng)條件等因 素的影響 組培材料或生產(chǎn)出的 組培苗植株以及移栽到大田生 長的植株遺傳特性發(fā)生明顯變 化 其形態(tài)特征如葉色 葉形 球 莖大小 形狀 植株高矮等也顯 著區(qū)別于原品種植株 4 生產(chǎn)設(shè)備和化學(xué)試劑 生產(chǎn)設(shè)備 化學(xué)試劑及滅菌 操作均按 NY T 2306 執(zhí)行 5 培養(yǎng)室環(huán)境條件的控制 5 1 溫度 培養(yǎng)室溫度應(yīng)控制在 26 2 可根據(jù)培養(yǎng)材料所需的最 適溫度進(jìn)行調(diào)節(jié) 廣西夏季氣溫 高 須有空調(diào)系統(tǒng)控溫 保持室 內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定 5 2 濕度 培養(yǎng)室保持 70 80 的相 對濕度 廣西春夏季空氣濕度 大 培養(yǎng)室應(yīng)放置除濕機(jī) 5 3 光照 一般培養(yǎng)室光照強(qiáng)度控制 在 1 500 3 000 lx 以每天 12 16 h 為宜 須根據(jù)培養(yǎng)材料需光 特性調(diào)節(jié)光照強(qiáng)度及光照時間 工廠化生產(chǎn)時可考慮利用自然 光照以降低成本 6 生產(chǎn)操作 6 1 培養(yǎng)基配制與保存 根據(jù)培養(yǎng)材料品種類型及 生長發(fā)育特性 選擇相應(yīng)的基本 培養(yǎng)基種類和植物生長調(diào)節(jié)劑 種類 濃度 配比 慈姑組織培養(yǎng) 常用 MS 基本培養(yǎng)基 成分參考 NY T 5022 2006 無公害食品香 蕉生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程 制作培養(yǎng)基 前需要先配制母液 應(yīng)用去離子 水配制 根據(jù)生產(chǎn)情況 可以配 制成單一化合物母液或幾種化 合物的混合母液 植物生長調(diào)節(jié) 物 質(zhì) 的 母 液 配 制 濃 度 為 0 1 1 0 mg mL 配制方法參見表 1 母液配制好后貼上標(biāo)簽 注明名 稱 配制日期 存放 4 的冰箱 中 存放時間不宜過長 一般不 超過 2 個月 發(fā)現(xiàn)有不明沉淀 渾濁或變色則停止使用 根據(jù)要配制的培養(yǎng)基的量 分別量 稱 取母液 蒸餾水 固 化劑和蔗糖等 混合 攪拌加蒸 餾 水 溶 解 充 分 攪 拌 后 用 0 1 mol L 的 HCl 或 0 1 mol L的 NaOH 調(diào)節(jié) pH 值至 5 6 0 2 后 用蒸餾水定容 加熱溶解后趁熱 按每瓶 袋 33 40 mL 的量分裝 至 250 mL 的培養(yǎng)瓶或 100 mm 120 mm 聚丙烯培養(yǎng)袋中并封好 瓶 袋 裝 消 毒 盒 蓋 經(jīng) 121 20 min 高壓蒸汽消毒 于室溫凝 固 注明培養(yǎng)基編號及消毒日 期 存放 3 5 d 選擇無菌污染的 培養(yǎng)基接種 6 2 外植體采集與處理 宜選擇生長健壯 無病蟲 害 具有優(yōu)良品種性狀的球莖頂 芽作為外植體 頂芽外植體 將采集的 球莖頂芽或匍匐莖用自來水沖 洗 2 3 遍 剪取所需幼芽莖段 2 3 cm 略晾干 在超凈臺上 細(xì)胞分 裂素 6 BA 1 0 3 5 KT 0 1 2 0 生長素 IAA 0 01 1 00 0 5 3 5 0 5 1 0 0 5 4 0 NAA 0 01 0 50 0 2 3 0 IBA 促進(jìn)細(xì)胞分裂 誘導(dǎo)芽的分化 促進(jìn)根萌發(fā)生長 抑制頂端優(yōu)勢 常與生長素配合使用 用以調(diào) 節(jié)細(xì)胞分裂 細(xì)胞伸長 細(xì)胞分化和器官形成 促進(jìn)細(xì)胞伸長生長和細(xì)胞分裂 促進(jìn)不定根和側(cè)根生成 促進(jìn)細(xì)胞伸長生長和細(xì)胞分裂 促進(jìn)生根 促進(jìn)細(xì)胞生長 促進(jìn)生根 先用少量 0 5 1 0 mol L 的鹽酸 HCl 溶解 然后加蒸餾水定容 先用少量 1 0 mol L 的 KOH 或 NaOH 溶解 然后加蒸餾水定容 類別 種類 常用濃度 mg L 功能 配制方法 表 1 慈姑組培苗生產(chǎn)常用植物生長調(diào)節(jié)劑濃度及配制方法 39 將 預(yù)處理的慈姑球莖頂芽截取 直徑 3 5 mm 長 10 20 mm 莖 尖段放入燒杯中 用 75 酒精處 理輕搖 1 2 min 倒出酒精 用無 菌水沖洗外植體 2 3 遍 再用 2 次氯酸鈉浸泡 10 15 min 然 后用無菌水沖洗 3 5 遍后瀝干 封存于經(jīng)滅菌的培養(yǎng)瓶內(nèi)供接 種用 匍匐莖莖尖外植體 在 超凈臺上 將預(yù)處理的慈姑匍匐 莖截取直徑 3 5 mm 長 5 10 mm 莖尖段放入燒杯中 倒入 75 酒 精 輕輕搖晃 10 30 s 倒出酒 精 用無菌水沖洗外植體 3 5遍 再用 2 次氯酸鈉浸泡 8 10 min 然后用無菌水沖洗 3 5 遍后瀝 干封存于經(jīng)滅菌的培養(yǎng)瓶內(nèi)供 接種用 6 3 接種和增殖培養(yǎng) 取經(jīng)消毒處理的外植體 在 無菌墊紙上切取 0 3 0 5 mm 的 莖尖組織 初代培養(yǎng) 萌發(fā)培養(yǎng) 將切 取的外植體 接種在 1 2 MS 6 BA 0 5 1 0 mg L NAA 0 01 0 05 mg L 蔗糖 30 g L 的萌發(fā)培 養(yǎng)基上 溫度為 26 2 光照 1 000 2 000 lx 每日光照 16 h 7 10 d 后 選擇無污染且已萌發(fā) 的外植體再進(jìn)行分化培養(yǎng) 繼代培養(yǎng) 將初代培養(yǎng)所 得叢生芽分切成帶有 2 3 個芽 點 的 小 塊 轉(zhuǎn) 接 MS 6 BA 2 0 3 5 mg L NAA 0 1 0 5 mg L 蔗 糖 30 g L的繼代培養(yǎng)基上 溫度 為 26 2 光照 1 500 3 000 lx 每日光照 12 h 根據(jù)培養(yǎng)材料的 發(fā)育及長勢 適當(dāng)調(diào)整繼代培養(yǎng) 基中植物生長調(diào)節(jié)劑的用量和 比例 使增殖系數(shù)控制在 2 0 5 0 宜以 28 d 為一個繼代周期 6 4 組培苗的生根培養(yǎng)和煉苗 選擇繼代培養(yǎng)材料中葉色 正常 生長健壯的繼代苗 接種 在生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng) 將分化苗接種在 MS 6 BA 0 5 1 0 mg L NAA 0 5 1 0 mg L 蔗 糖 30 g L 的培養(yǎng)基上生根 放置 在溫度 26 2 光強(qiáng) 2 000 lx 的光照培養(yǎng)室內(nèi) 培養(yǎng) 10 15 d 苗高 5 8 cm 莖粗壯 根系發(fā) 達(dá) 即可轉(zhuǎn)移到煉苗大棚培養(yǎng) 慈姑組培苗在光照培養(yǎng)室內(nèi)培 養(yǎng)后 必須轉(zhuǎn)移在常溫自然散射 光 較 強(qiáng) 的 煉 苗 大 棚 煉 苗 15 30 d 后可種植 7 慈姑組培苗變異篩選及 控制 增殖系數(shù)控制在 2 0 5 0 繼代材料不應(yīng)選用老化的芽或 植株 繼代次數(shù)控制在 8 代以 內(nèi) 培養(yǎng)基組培繼代增殖和生根 培養(yǎng)的培養(yǎng)基中 植物激素的濃 度 應(yīng) 控 制 為 6 BA 3 5 mg L NAA 2 5 mg L 組培苗生產(chǎn)過 程中及時淘汰變異株 如失綠 葉片畸形扭曲 分蘗葉片細(xì)弱呈 叢生狀 匍匐莖明顯過長 植株 矮小 生根數(shù)少等的植株 8 慈姑組培苗質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 慈姑組培苗種源來自品種 純正 遺傳性狀穩(wěn)定 優(yōu)質(zhì)高產(chǎn) 的無污染母本園或母株 宜選用 通過省級以上的農(nóng)作物品種委 員會審定的品種 慈姑生根組培 苗無污染 植株生長形態(tài)正常無 變異 合格慈姑組培苗的質(zhì)量要 求見表 2 9 生產(chǎn)記錄及檔案建立 應(yīng)建立生產(chǎn)記錄檔案 生產(chǎn) 記錄應(yīng)包括 母液及培養(yǎng)基配 制 培養(yǎng)基高壓蒸汽滅菌 員工 接種 組培材料繼代和生根入出 庫 品種材料生產(chǎn)檔案和產(chǎn)品銷 售情況 慈 姑 組 培 生 根 苗 慈 姑 組 培 繼 代 苗 一級 8 0 0 30 3 0 5 3 0 淺綠色 濃綠 3 0 合格組培 苗標(biāo)準(zhǔn) 株高 cm 莖粗 cm 單株葉片數(shù) 片 生根數(shù) 條 根長 cm 植株葉色 變異株率 表 2 慈姑組培苗分級指標(biāo) 二級 8 0 0 20 0 29 2 0 3 2 0 淺綠色 濃綠 5 0 注 變異株指形態(tài)不正常的植株 2019 18 40