19 中華人民共和國(guó) 國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局 12 發(fā)明專利申請(qǐng) 10 申請(qǐng)公布號(hào) 43 申請(qǐng)公布日 21 申請(qǐng)?zhí)?202010403070 7 22 申請(qǐng)日 2020 05 13 83 生物保藏信息 CGMCC No 6628 2012 09 26 71 申請(qǐng)人 南京農(nóng)業(yè)大 學(xué) 地址 210043 江 蘇省南京市棲霞區(qū)八卦洲 街道江蘇省棲霞現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)園區(qū)南 京農(nóng)業(yè)大學(xué)現(xiàn)代園藝產(chǎn)業(yè)科技創(chuàng)新中 心 72 發(fā)明人 楊天杰 韓崗 徐陽(yáng)春 韋中 沈 其 榮 74 專利代理機(jī)構(gòu) 南京 天華專利代理有限責(zé)任 公司 32 218 代理人 徐冬濤 邢賢冬 51 Int Cl C12N 1 20 2006 01 A01N 63 20 2020 01 A01P 1 00 2006 01 C12R 1 01 2006 01 54 發(fā)明名稱 一種環(huán)絲氨酸與有益菌配合防控番茄土傳 青枯病的應(yīng)用 57 摘要 本發(fā)明公開(kāi)了一種環(huán)絲氨酸與有益菌配合 防控番茄土傳青枯病的應(yīng)用 采用灌根法將環(huán)絲 氨酸與有益菌施入土壤 其中 有益菌為菌株 NJQL A6 分類命 名為皮氏 羅爾斯通氏 菌 Ralstonia pickettii 2012年9月26日保藏于 中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中 心 保藏單位地址 北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路 菌種保 藏號(hào)為CGMCC No 6628 本發(fā)明通過(guò)資源調(diào)控的 方式可以增強(qiáng)有益菌抑制土傳青枯病的能力 同 時(shí)施用有益菌和環(huán)絲氨酸 以環(huán)絲氨酸作為資源 物質(zhì) 不僅能夠促進(jìn)有益菌生長(zhǎng) 還能顯著提高 有 益菌對(duì)青枯菌的抑制能力 從而減少番茄青枯 病的發(fā)病率 防控 番 茄土傳病害 權(quán)利要求書(shū)1頁(yè) 說(shuō)明書(shū)4頁(yè) 附圖2頁(yè) CN 111607535 A 2020 09 01 CN 111607535 A 1 一種環(huán)絲氨酸與有益菌配合防控番茄土傳青枯病的應(yīng)用 其中 有益菌為菌株NJQL A6 分類命名為皮氏羅爾斯通氏菌 Ralstonia pickettii 2012年9月26日保藏于中國(guó)微 生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心 保藏單位地址 北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路 菌種保藏 號(hào)為CGMCC No 6628 2 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用 其特征在于采用灌根法將環(huán)絲氨酸與有益菌施入土壤 3 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用 其特征在于環(huán)絲氨酸的終濃度為0 1 1mmol kg土 4 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用 其特征在于有益菌的終濃度為 107 1 109CFU g土 5 一種環(huán)絲氨酸與有益菌配合防控番茄土傳青枯病的方法 其特征在于包括 番茄幼 苗移栽7 10天后 以灌根法將環(huán)絲氨酸與有益菌菌懸液加入土壤中 環(huán)絲氨酸的終濃度為 0 1 1mmol kg土 有益菌NJQL A6的終濃度為10 7 10 9CFU g土 6 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法 其特征在于有益菌菌懸液的濃度為1 107 1 109CFU mL 7 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法 其特征在于有益菌菌懸液由以下方法制得 菌株NJQL A6采用NA固體培養(yǎng)基活化 挑取NJQL A6單菌落于NA液體培養(yǎng)基 30 170rpm培養(yǎng)過(guò)夜 取 新鮮菌液4500rpm 常溫離心5min 收集菌體 用無(wú)菌生理鹽水洗滌菌體 除去培養(yǎng)基 用無(wú) 菌生理鹽水調(diào)節(jié)菌液濃度為1 107 1 109CFU mL 得到NJQL A6菌懸液 權(quán) 利 要 求 書(shū) 1 1 頁(yè) 2 CN 111607535 A 一種環(huán)絲氨酸與有益菌配合防控番茄土傳青枯病的應(yīng)用 技術(shù)領(lǐng)域 0001 本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域 涉及一種資源配合有益菌防控番茄青枯病的應(yīng)用 具體涉及一種環(huán)絲氨酸和有益菌NJQL A6配合防控番茄土傳青枯病的應(yīng)用 背景技術(shù) 0002 番茄青枯病是由茄科勞爾氏菌 Ralstonia solanacearum 簡(jiǎn)稱青枯菌 引起的一 種土傳病害 多發(fā)于我國(guó)東部和南部地區(qū) 可導(dǎo)致番茄發(fā)生不可逆的萎蔫 死亡 造成番茄 嚴(yán)重減產(chǎn) 制約農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展 施用農(nóng)藥或熏蒸等傳統(tǒng)方式可在短時(shí)間內(nèi)殺滅土傳青枯 菌 有效減緩病害的發(fā)生 但上述方法也會(huì)殺滅土壤中土著微生物 減少土壤物種多樣性或 豐度 0003 目前 施用有益菌是較為綠色 可持續(xù)的防控番茄青枯病措施 可抑制土傳青枯菌 的生長(zhǎng) 在一定程度上減少病害的發(fā)生 在篩選有益菌以及驗(yàn)證其抑菌效果的過(guò)程中 人們 往往使用營(yíng)養(yǎng)較為豐富的培養(yǎng)基 有益菌可大量增殖或表現(xiàn)出很好的抑菌能力 而土壤中 資源種類和數(shù)量都相對(duì)有限 有益菌施入土壤后 無(wú)法獲得足夠以及合適的資源 從而生長(zhǎng) 減緩 甚至無(wú)法在土壤環(huán)境中存活 其生防效率必然下降 0004 因此 需要找尋一種能夠促進(jìn)有益菌生長(zhǎng)的資源 為有益菌在土壤提供一個(gè)適宜 生長(zhǎng)的資源環(huán)境 并增強(qiáng)其抑制土傳青枯菌的能力 發(fā)明內(nèi)容 0005 本發(fā)明的目的在于針對(duì)土壤中養(yǎng)分有限 施用有益菌防控番茄土傳病害時(shí) 有益 菌往往難以在土壤中大量增殖并發(fā)揮應(yīng)有防效的問(wèn)題 發(fā)明人發(fā)現(xiàn) 室內(nèi)微孔板系統(tǒng)中 環(huán) 絲氨酸可以促進(jìn)有益菌NJQL A6生長(zhǎng) 還可顯著提高有益菌對(duì)青枯菌的抑制能力 溫室盆栽 實(shí)驗(yàn)中 環(huán)絲氨酸與有益菌NJQL A6同時(shí)以灌根法施入土壤中 可降低番茄土傳青枯病的病 情指數(shù) 說(shuō)明通過(guò)資源調(diào)控的方式可以增強(qiáng)有益菌抑制土傳青枯病的能力 同時(shí)施用有益 菌和環(huán)絲氨酸 以環(huán)絲氨酸作為資源物質(zhì) 不僅能夠促進(jìn)有益菌生長(zhǎng) 還能顯著提高有益菌 對(duì)青枯菌的抑制能力 從而減少番茄青枯病的發(fā)病率 防控番茄土傳病害 0006 本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的 0007 一種環(huán)絲氨酸與有益菌配合防控番茄土傳青枯病的應(yīng)用 其中 有益菌為菌株 NJQL A6 分類命名為皮氏羅爾斯通氏菌 Ralstonia pickettii 2012年9月26日保藏于中 國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心 保藏單位地址 北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路 菌種 保藏號(hào)為CGMCC No 6628 0008 菌株NJQL A6具體見(jiàn)申請(qǐng)人于2012年12月19日申請(qǐng)的發(fā)明專利申請(qǐng) 發(fā)明名稱為 一種能防治番茄青枯病的微生物植物疫苗 申請(qǐng)?zhí)?201210466659 7 0009 作為本發(fā)明環(huán)絲氨酸與有益菌配合防控番茄土傳青枯病的應(yīng)用的優(yōu)選技術(shù)方案 采用灌根法 同時(shí)將環(huán)絲氨酸與有益菌施入土壤 環(huán)絲氨酸的終濃度為0 1 1mmol kg土 有益菌的終濃度為1 107 1 109CFU g土 說(shuō) 明 書(shū) 1 4 頁(yè) 3 CN 111607535 A 0010 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種環(huán)絲氨酸與有益菌配合防控番茄土傳青枯病的 方法 包括 3 5片真葉的番茄幼苗移栽7 10天后 以灌根法同時(shí)將環(huán)絲氨酸與有益菌菌 懸液加入土壤中 環(huán)絲氨酸的終濃度為0 1 1mmol kg土 有益菌NJQL A6的終濃度為10 7 109CFU g土 0011 所述的有益菌菌懸液的濃度為1 107 1 109CFU mL 0012 所述的有益菌菌懸液由以下方法制得 菌株NJQL A6采用NA固體培養(yǎng)基活化 挑取 NJQL A6單菌落于NA液體培養(yǎng)基 30 170rpm培養(yǎng)過(guò)夜 取新鮮菌液4500rpm 常溫離心 5min 收集菌體 用無(wú)菌生理鹽水洗滌菌體 除去培養(yǎng)基 用無(wú)菌生理鹽水調(diào)節(jié)菌液濃度為1 107 1 109CFU mL 得到NJQL A6菌懸液 附圖說(shuō)明 0013 圖1為環(huán)絲氨酸對(duì)有益菌NJQL A6生長(zhǎng)的影響 其中 圖1A為環(huán)絲氨酸對(duì)有益菌 NJQL A6 48h生物量的影響 圖1B為環(huán)絲氨酸對(duì)有益菌NJQL A6最大生長(zhǎng)速率的影響 0014 圖2為環(huán)絲氨酸對(duì)有益菌NJQL A6抑制土傳青枯菌生長(zhǎng)的影響 0015 圖3為環(huán)絲氨酸對(duì)番茄土傳青枯病病情指數(shù)的影響 0016 生物材料保藏信息 0017 菌株NJQL A6 分類命名為皮氏羅爾斯通氏菌 Ralstonia pickettii 2012年9月 26日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心 保藏單位地址 北京市朝陽(yáng) 區(qū)大屯路 菌種保藏號(hào)為CGMCC No 6628 具體實(shí)施方式 0018 下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步說(shuō)明 0019 實(shí)施例1 0020 環(huán)絲氨酸促進(jìn)有益菌生長(zhǎng)的室內(nèi)效果 0021 NA液體培養(yǎng)基 葡萄糖10g 蛋白胨5g 牛肉浸膏3g 酵母膏0 5g 去離子水1000mL 調(diào)節(jié)pH 7 2 7 4 115 高壓滅菌30min 0022 NA固體培養(yǎng)基為NA液體培養(yǎng)基加2 3 w w 瓊脂 0023 菌株NJQL A6 分類名為皮氏羅爾斯通氏菌 保藏號(hào)CGMCC No 6628 0024 將甘油保存的NJQL A6在NA固體培養(yǎng)基上劃線 30 培養(yǎng)2d 挑取平板上的單菌落 轉(zhuǎn)接到NA液體培養(yǎng)基 30 170rpm培養(yǎng)過(guò)夜 取新鮮菌液4500rpm 常溫離心5min 收集菌 體 用無(wú)菌生理鹽水 0 85 NaCl 洗滌菌體3次 除去培養(yǎng)基 用無(wú)菌生理鹽水調(diào)節(jié)菌液濃 度為1 108CFU mL 獲得菌懸液 待用 0025 試驗(yàn)設(shè)置2個(gè)處理 1 環(huán)絲氨酸組 加入環(huán)絲氨酸和有益菌NJQL A6 2 對(duì)照組 只添加有益菌NJQL A6 并以等體積水替代環(huán)絲氨酸 培養(yǎng)基為10 NA培養(yǎng)基 用無(wú)菌水將 NA液體培養(yǎng)基稀釋10倍 環(huán)絲氨酸終濃度為0 1mM 有益菌NJQL A6接種量為1 終濃度為 1 106CFU mL 在30 170rpm下震蕩培養(yǎng)48h 在酶標(biāo)儀上測(cè)定OD 600 考察有益菌NJQL A6 的生長(zhǎng)情況 0026 環(huán)絲氨酸對(duì)有益菌生長(zhǎng)的促進(jìn)作用見(jiàn)圖1和表1 結(jié)果表明 與對(duì)照組相比 環(huán)絲氨 酸可顯著促進(jìn)有益菌NJQL A6生物量和生長(zhǎng)速率的增加 P 0 05 說(shuō) 明 書(shū) 2 4 頁(yè) 4 CN 111607535 A 0027 表1 環(huán)絲氨酸對(duì)有益菌NJQL A6生物量和生長(zhǎng)速率的影響 0028 0029 注 表中同列不同字母表示差異達(dá)到0 05的顯著水平 下同 0030 實(shí)施例2 0031 環(huán)絲氨酸增強(qiáng)有益菌抑制土傳青枯菌的室內(nèi)效果 0032 材料 分離自南京麒麟鎮(zhèn)的青枯菌QL Rs1115 1 其紅色熒光蛋白標(biāo)記菌株RS RFP 為本發(fā)明的模式入侵病原菌 該菌株是將紅色熒光蛋白基因mCherry通過(guò)質(zhì)粒pYC12轉(zhuǎn)入青 枯菌QL Rs1115 可以在30 g mL慶大霉素的NA培養(yǎng)基平板 2 上生長(zhǎng) 命名為RS RFP 有益菌 NJQL A6篩選自南京麒麟鎮(zhèn) 可抑制青枯菌QL Rs1115的生長(zhǎng) 0033 將甘油保存的有益菌NJQL A6在NA固體培養(yǎng)基上劃線 將平板置于30 培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)2d 直至出現(xiàn)單菌落 挑取平板上的單菌落轉(zhuǎn)接到NA液體培養(yǎng)基 30 170rpm培養(yǎng)過(guò) 夜 取新鮮菌液4500rpm 常溫離心5min 收集菌體 用無(wú)菌生理鹽水 0 85 NaCl 洗滌菌體 3次 除去培養(yǎng)基 最后用無(wú)菌生理鹽水調(diào)節(jié)菌液濃度為1 108CFU mL 獲得有益菌菌懸液 待用 0034 青枯菌RS RFP在含有30 g mL慶大霉素的NA固體培養(yǎng)基上復(fù)蘇 將平板置于30 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2d 直至出現(xiàn)單菌落 挑取平板上的單菌落轉(zhuǎn)接到NA液體培養(yǎng)基 30 170rpm培養(yǎng)過(guò)夜 取新鮮菌液4500rpm 常溫離心5min 收集菌體 用無(wú)菌生理鹽水 0 85 NaCl 洗滌菌體3次 除去培養(yǎng)基 最后用無(wú)菌生理鹽水調(diào)節(jié)菌液濃度為1 108CFU mL 獲得 青枯菌菌懸液 待用 0035 試驗(yàn)設(shè)置2個(gè)處理 1 環(huán)絲氨酸組 加入環(huán)絲氨酸 有益菌和青枯菌 對(duì)照組 有 益菌和青枯菌 并以等體積水替代環(huán)絲氨酸 培養(yǎng)基為10 NA培養(yǎng)基 用無(wú)菌水將NA液體培 養(yǎng)基稀釋10倍 環(huán)絲氨酸終濃度為0 1mM 有益菌NJQL A6和青枯菌RS RFP接種量均為1 在30 170rpm下震蕩培養(yǎng)48h 在酶標(biāo)儀上測(cè)定OD 600和紅色熒光強(qiáng)度mCherry 發(fā)射光 587nm 吸收光 610nm 計(jì)算青枯菌相對(duì)生長(zhǎng)量 log10 mCherry OD 600 0036 結(jié)果見(jiàn)圖2和表2 與對(duì)照組相比 環(huán)絲氨酸可顯著增強(qiáng)有益菌NJQL A6抑制青枯菌 的能力 P 0 05 0037 表2 環(huán)絲氨酸對(duì)有益菌NJQL A6抑制青枯菌的影響 0038 0039 實(shí)施例3 0040 環(huán)絲氨酸增強(qiáng)有益菌抑制土傳青枯菌的盆栽效果 0041 將有益菌NJQL A6接入NA液體培養(yǎng)基中 30 170rpm下震蕩培養(yǎng)48h 取新鮮菌液 說(shuō) 明 書(shū) 3 4 頁(yè) 5 CN 111607535 A 4500rpm 常溫離心5min 收集菌體 用無(wú)菌的生理鹽水 0 85 NaCl 洗滌菌體3次 除去培 養(yǎng)基 最后用無(wú)菌生理鹽水調(diào)節(jié)菌液濃度為1 108CFU mL左右 獲得有益菌菌懸液 待用 0042 將青枯菌QL Rs1115接入NA液體培養(yǎng)基中 30 170rpm下震蕩培養(yǎng)48h 取新鮮菌 液4500rpm常溫離心5min 收集菌體 用無(wú)菌的生理鹽水 0 85 NaCl 洗滌菌體3次 除去培 養(yǎng)基 最后用無(wú)菌生理鹽水調(diào)節(jié)菌液濃度為1 108CFU mL左右 獲得青枯菌菌懸液 待用 0043 番茄品種 紅矮生番茄 0044 番茄種子經(jīng)表面消毒后 置于墊有無(wú)菌去離子水浸濕濾紙的無(wú)菌平板上 30 催 芽2d 取發(fā)芽均一的種子種植入裝有滅菌基質(zhì)50孔育苗盤(pán)中 待番茄長(zhǎng)出3片真葉后 取長(zhǎng) 勢(shì)一致的幼苗移栽至6孔育苗盤(pán)中 0045 試驗(yàn)設(shè)置2個(gè)處理 1 環(huán)絲氨酸組 幼苗移栽7天后 采用灌根法同時(shí)將環(huán)絲氨酸 與有益菌NJQL A6菌懸液均勻澆入番茄根部附近 環(huán)絲氨酸終濃度為0 1mmol kg土 有益菌 NJQL A6終濃度為10 7CFU g土 7天后 同樣以灌根法接入青枯菌菌懸液 其終濃度為10 6CFU g土 2 對(duì)照組 幼苗移栽7天后 以灌根法接入有益菌NJQL A6菌懸液 并以等體積水替代 環(huán)絲氨酸 有益菌NJQL A6終濃度為10 7CFU g土 7天后 同樣以灌根法接入青枯菌菌懸液 其終濃度為10 6CFU g土 接入青枯菌后一旦番茄出現(xiàn)發(fā)病癥狀 開(kāi)始記錄發(fā)病情況 0046 植株病情等級(jí)分為5級(jí) 3 0 沒(méi)有染病癥狀 1 1 25 的植株部位出現(xiàn)染病癥 狀 2 26 50 的植株部位出現(xiàn)染病癥狀 3 51 75 的植株部位出現(xiàn)染病癥狀 4 76 100 的植株部位出現(xiàn)染病癥狀或者是植株已經(jīng)死亡 用病情指數(shù)表征發(fā)病情況 計(jì) 算公式為 植株病情指數(shù) 各級(jí)病株數(shù) 相應(yīng)級(jí)數(shù) 調(diào)查總株數(shù) 最高級(jí)別值 0047 結(jié)果如圖3和表3 結(jié)果表明 添加環(huán)絲氨酸后 可顯著降低番茄土傳青枯病的病情 指數(shù) P 0 05 減少青枯病發(fā)病程度 0048 表3 環(huán)絲氨酸對(duì)有益菌NJQL A6抑制番茄土傳青枯病的影響 0049 0050 參考文獻(xiàn) 0051 1 Wei Z Yang X M Yin S X Shen Q R Ran W Xu Y C Efficacy of Bacillus fortified organic fertiliser in controlling bacterial wilt of tomato in the field Appl Soil Ecol 2011 48 152 159 0052 2 Tan S Y Gu Y Yang C L Dong Y Mei X L Shen Q R et al Bacillusamyloliquefaciens T 5may prevent Ralstonia solanacearum infection through competitive exclusion Biol Fertil Soils 2015 52 341 351 0053 3 Kempe J and L Sequeira Biogical control of bacterial wilt of potatoes attempts to induce resistance by treating tubers with bacteria Plant disease 1983 67 499 503 說(shuō) 明 書(shū) 4 4 頁(yè) 6 CN 111607535 A 圖1 圖2 說(shuō) 明 書(shū) 附 圖 1 2 頁(yè) 7 CN 111607535 A 圖3 說(shuō) 明 書(shū) 附 圖 2 2 頁(yè) 8 CN 111607535 A