19 中華人民共和國 國家知識產(chǎn)權(quán)局 12 發(fā)明專利申請 10 申請公布號 43 申請公布日 21 申請?zhí)?202010510611 6 22 申請日 2020 06 08 71 申請人 華中農(nóng)業(yè)大 學(xué) 地址 430000 湖北省武漢市洪山區(qū)獅子山 街1號 72 發(fā)明人 歐陽波 周玉紅 高虎 于會(huì) 洋 陳蓉 石春美 盧永恩 葉志彪 74 專利代理機(jī)構(gòu) 武漢藍(lán)寶石專利代理事務(wù)所 特殊普通 合 伙 42 242 代理人 嚴(yán)超 51 Int Cl C12Q 1 6895 2018 01 C12N 15 11 2006 01 A01H 1 04 2006 01 54 發(fā)明名稱 光亮果皮番茄品種選育的分子標(biāo)記及其應(yīng) 用 57 摘要 本發(fā)明涉及番茄分子標(biāo)記育種領(lǐng)域 具體涉 及光亮果皮番茄品種選育的分子標(biāo)記及其應(yīng)用 本發(fā)明利用番茄自發(fā)突變體glossy與野生番茄 LA1375構(gòu)建F2分離群體 利用BSR定位策略及連 鎖分析將glossy基因定位在1號染色體600kb范 圍內(nèi) 并獲得與之緊密連鎖的分子標(biāo)記GLS 利用 該分子 標(biāo)記及其引物進(jìn)行番茄品種選育 為特殊 番茄品種的開發(fā)提供了資源 并為果實(shí)發(fā)育生物 學(xué)研究奠定 了 基礎(chǔ) 權(quán)利要求書1頁 說明書5頁 序列表1頁 附圖1頁 CN 111621588 A 2020 09 04 CN 111621588 A 1 光亮果皮番茄品種選育的分子標(biāo)記 其特征在于 以2 5版本的番茄參考基因組為 準(zhǔn) 所述分子標(biāo)記為位于番茄1號染色體85257792bp處的58bp核苷酸插入片段 該分子標(biāo)記 的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示 2 檢測權(quán)利要求1所述分子標(biāo)記的擴(kuò)增引物或雜交探針 3 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測權(quán)利要求1所述分子標(biāo)記的引物 其特征在于 所述引物 的核苷酸序列如下所示 正向引物 TCCTAGACTTCTAGAAATACGTGTGG 如SEQ ID NO 2所示 反向引物 TGGAAAAGAAAGGAGAAAGGATGAC 如SEQ ID NO 3所示 4 權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記獲取方法 其特征在于 包括以下步驟 將glossy突變體與番茄野生種質(zhì)LA1375雜交 獲得F1代 F1代自交獲得F2 F2果實(shí)綠熟時(shí)鑒別果實(shí)表型 確定glossy是單隱性基因 選取表型分別為野生型和突變型的不同植株的果實(shí) 切取果實(shí)表皮等量混樣 提取 RNA 進(jìn)行RNA seq 利用BSR基因定位策略進(jìn)行初定位 將glossy定位于1號染色體4M范圍 內(nèi) 利用glossy和LA1375的重測序數(shù)據(jù) 設(shè)計(jì)并篩選多態(tài)性標(biāo)記 分析F2群體中的重組事 件 將目的區(qū)段鎖定在0 798M范圍內(nèi) 擴(kuò)大F2群體 進(jìn)一步開發(fā)分子標(biāo)記 將目的區(qū)段鎖定在600kb范圍內(nèi)并獲得與之緊密連 鎖的分子標(biāo)記GLS 5 權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記在光亮果皮番茄品種選育中的應(yīng)用 6 如權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記在光亮果皮番茄品種選育中的應(yīng)用 其特征在于 番茄 育種中所用的供體材料包括glossy突變體 7 一種用于檢測權(quán)利要求1所述分子標(biāo)記的試劑盒 8 根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于檢測權(quán)利要求1所述分子標(biāo)記的試劑盒 其特征在于 包 括權(quán)利要求2所述的引物 9 由權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記篩選到的光亮果皮番茄在制備果干果脯產(chǎn)品中的應(yīng) 用 權(quán) 利 要 求 書 1 1 頁 2 CN 111621588 A 光亮果皮番茄品種選育的分子標(biāo)記及其應(yīng)用 技術(shù)領(lǐng)域 0001 本發(fā)明屬于番茄育種領(lǐng)域 具體涉及光亮果皮番茄品種選育的分子標(biāo)記及其應(yīng) 用 背景技術(shù) 0002 番茄表皮即角質(zhì)膜 它是植物自我保護(hù)的第一級屏障 在植物的生長發(fā)育中發(fā)揮 著重要作用 角質(zhì)膜是植物與環(huán)境的作用界面 它能封閉植物細(xì)胞 減少植物遭受生物和非 生物脅迫 如減少氣孔蒸騰以外的水分散失 減少病菌侵染和昆蟲取食 角質(zhì)膜也能有效阻 擋機(jī)械傷害 角質(zhì)層里的多糖能影響植物角質(zhì)的緊密度和堅(jiān)硬度 進(jìn)而影響植物外表皮的 張力和致密度 番茄表皮既能影響果實(shí)的抗性 耐貯性 也能很大程度上影響果實(shí)的感觀品 質(zhì)和風(fēng)味 特別是影響食用口感 0003 果脯和果干作為傳統(tǒng)食品 在現(xiàn)代社會(huì)依舊備受青睞 番茄可作為蔬菜和水果 也 可以進(jìn)一步加工成果脯和果干 常規(guī)番茄果脯或果干的加工過程需要經(jīng)過清洗 燙漂 去 皮 硬化 滲糖 晾曬或烘干等工藝 排除果實(shí)內(nèi)豐富的水分并促進(jìn)糖分的滲入 但是在去皮 過程中 會(huì)造成維生素和番茄紅素的流失 0004 基于此 開發(fā)一種能夠快速選育出果皮嫩薄 易失水 適于制作果干果脯的番茄品 種的分子標(biāo)記 并將其應(yīng)用于番茄育種領(lǐng)域 具有重要意義 發(fā)明內(nèi)容 0005 基于此 本發(fā)明的目的在于提供一種光亮果皮番茄品種選育的分子標(biāo)記及該分子 標(biāo)記在番茄育種中的應(yīng)用 0006 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下 0007 本發(fā)明提供一種光亮果皮番茄品種選育的分子標(biāo)記 以2 5版本的番茄參考基因 組為準(zhǔn) 所述分子標(biāo)記為位于番茄1號染色體85257792bp處的58bp的核苷酸插入片段 該分 子標(biāo)記的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示 0008 本發(fā)明的保護(hù)范圍還涉及到所有能夠檢測上述分子標(biāo)記的擴(kuò)增引物或雜交探針 所有能夠檢測上述分子標(biāo)記的引物或探針均能夠用于光亮果皮番茄品種的選育 0009 具體地 其中一對分子標(biāo)記的引物核苷酸序列如下所示 0010 正向引物 TCCTAGACTTCTAGAAATACGTGTGG 如SEQ ID NO 2所示 0011 反向引物 TGGAAAAGAAAGGAGAAAGGATGAC 如SEQ ID NO 3所示 0012 本發(fā)明還提供了上述分子標(biāo)記的獲取方法 包括以下步驟 0013 1 突變體的發(fā)現(xiàn)以及鑒定 0014 該突變體是番茄品種Alisa Craig在組織培養(yǎng)過程中自發(fā)產(chǎn)生的 突變體果實(shí)表 現(xiàn)為果皮薄而光亮 食用時(shí)化渣性好 入口即化 口感佳 命名為glossy glossy番茄表皮嫩 薄 易散失水份同時(shí)外源物質(zhì)也容易滲透進(jìn)去 可作為果脯和果干的原料 加工時(shí)無需去 皮 可以減少營養(yǎng)物質(zhì)的流失且能使加工品具有良好的外觀形態(tài) 另外 其嫩薄的表皮也使 說 明 書 1 5 頁 3 CN 111621588 A 得這類番茄鮮食口感較佳且外觀鮮亮 具有吸引人購買的有利性狀 突變體果實(shí)表型如附 圖1所示 經(jīng)遺傳研究發(fā)現(xiàn)glossy可以穩(wěn)定遺傳 為一個(gè)穩(wěn)定的變異 0015 2 glossy緊密連鎖的分子標(biāo)記開發(fā) 0016 利用glossy突變體與番茄野生種質(zhì)LA1375雜交 獲得F1代 F1代自交獲得F2 定植 563株F2單株 到番茄果實(shí)綠熟時(shí)即可準(zhǔn)確鑒別果實(shí)表型 群體中果實(shí)表現(xiàn)為glossy的單 株有138株 利用卡平方檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)卡平方值為0 8657 小于自由度為1的卡平方臨界值 判斷該突變符合3 1的分離比 表明glossy受隱性單基因控制 0017 3 基因定位及分子標(biāo)記開發(fā) 0018 在果實(shí)綠熟期選擇果實(shí)表型為野生型和glossy的植株各30株 每株選擇一個(gè)果 實(shí) 切取果實(shí)的表皮等量混樣 提取RNA 送公司進(jìn)行RNA seq 計(jì)算兩個(gè)混池中單核苷酸多 態(tài)性位點(diǎn)的基因型頻率及其差值 通過差值的統(tǒng)計(jì)分析獲取glossy的大致位置 該定位策 略即為BSR 根據(jù)BSR的初定位的結(jié)果 將glossy定位于1號染色體末端 0019 利用glossy和LA1375的重測序數(shù)據(jù)對比番茄參考基因組 提取插入 缺失類型的 變異位點(diǎn) 設(shè)計(jì)引物并篩選多態(tài)性標(biāo)記 將目的區(qū)段鎖定在0 798M范圍內(nèi) 擴(kuò)大F2群體至 2586株 并進(jìn)一步開發(fā)分子標(biāo)記 將目的區(qū)段鎖定在600kb范圍內(nèi)并獲得與之緊密連鎖的分 子標(biāo)記GLS及其檢測引物 所述分子標(biāo)記GLS的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示 0020 本發(fā)明還提供了上述分子標(biāo)記在光亮果皮番茄品種選育中的應(yīng)用 其中 在該應(yīng) 用中所用的供體材料包括glossy突變體 0021 本發(fā)明的目的還在于提供一種用于檢測上述分子標(biāo)記的試劑盒 其中 所述試劑 盒包括上述引物 0022 本發(fā)明的目的還在于提供上述分子標(biāo)記篩選到的光亮果皮番茄在制備果干果脯 產(chǎn)品中的應(yīng)用 0023 本發(fā)明利用番茄自發(fā)突變體glossy與野生番茄LA1375構(gòu)建F2分離群體 利用BSR 定位策略和連鎖分析將glossy基因定位在1號染色體600kb范圍內(nèi) 并獲得與之緊密連鎖的 分子標(biāo)記GLS 利用該分子標(biāo)記及其檢測引物進(jìn)行番茄育種選育 為特殊番茄品種的開發(fā)提 供了資源 并為果實(shí)發(fā)育生物學(xué)研究奠定了基礎(chǔ) 0024 在常規(guī)育種方法中 光亮果皮或果干果脯番茄品種的選育要等到果實(shí)成熟期 浪 費(fèi)大量的時(shí)間和精力 且選擇效率低下 而通過檢測本發(fā)明中與其相關(guān)的分子標(biāo)記 可以在 苗期進(jìn)行淘汰 不僅節(jié)約生產(chǎn)成本而且大大提高選擇效率 不受環(huán)境影響 可以在早期篩選 出優(yōu)良單株 減少材料種植規(guī)模和育種時(shí)間 可應(yīng)用于 化渣性 好且外表鮮亮的番茄品種 選育 也可用于開發(fā)適合番茄果干果脯食品生產(chǎn)的番茄品種 附圖說明 0025 圖1為glossy突變體與野生型番茄果實(shí)表型的比較 其中g(shù)lossy代表glossy突變 體 WT代表野生型番茄 0026 圖2為BSR分析結(jié)果 0027 圖3為實(shí)施例2中GLS分子標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果 其中g(shù) g表示隱性基因 型 G G表示顯性基因型 g G表示雜合基因型 說 明 書 2 5 頁 4 CN 111621588 A 具體實(shí)施方式 0028 以下結(jié)合具體實(shí)施方式對本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述 所舉實(shí)例只用于解釋本 發(fā)明 并非用于限定本發(fā)明的范圍 除非另有定義 本文所使用的所有的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語均 屬于本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員通常理解的含義相同 本文中在本發(fā)明的說明書中所使 用的術(shù)語只是為了描述具體的實(shí)施例的目的 不是旨在于限制本發(fā)明 0029 供試材料 0030 Glossy突變體為本實(shí)驗(yàn)室在Alisa Craig番茄材料的組織培養(yǎng)過程中獲得 果實(shí) 表現(xiàn)為果皮薄而光亮 食用時(shí)化渣性好 入口即化 口感佳 果實(shí)容易失去水分 公眾可從申 請人處獲得 僅可用于重復(fù)本發(fā)明實(shí)驗(yàn)使用 0031 番茄野生種質(zhì)LA1375從番茄遺傳資源中心TGRC獲得 表型為果實(shí)表皮厚 色澤一 般光亮 0032 實(shí)施例1 0033 光亮果皮或果干果脯番茄品種選育的分子標(biāo)記的開發(fā) 具體步驟如下 0034 S1 以glossy為母本 番茄野生種質(zhì)LA1375為父本 雜交獲得F1代 F1代植株自花 授粉得到F2代 0035 S2 于塑料大棚播種并定植563株F2代植株 正常管理 待果實(shí)坐果后2 3周基本可 以判斷表型 綠熟期表型明顯且穩(wěn)定 每株調(diào)查3個(gè)以上的果實(shí) glossy突變的果實(shí)色澤鮮 亮且觸摸時(shí)有粘手的感覺 正常果實(shí)色澤呈啞光感 觸摸光滑 如果3個(gè)以上果實(shí)全為光亮 且粘手狀則判定為glossy表型即為隱性 否則為顯性 0036 F2群體中果實(shí)表現(xiàn)為glossy的單株有138株 利用卡平方檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)卡平方值為 0 8657 小于自由度為1的卡平方臨界值 判斷該突變符合3 1的分離比 表 明glossy為隱性單基因控制 0037 S3 在果實(shí)綠熟期選擇果實(shí)表型為野生型和glossy的植株各30株 每株選擇一個(gè) 果實(shí) 切取果實(shí)的表皮等量混樣 提取RNA 送公司進(jìn)行RNA seq 該基因定位策略即為BSR 獲得混池RNA seq測序數(shù)據(jù)后 利用FastQC軟件對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評估 使用 Trimmomatic去除接頭 低質(zhì)量和含N較多的reads 對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制 之后 使用 hisat2將各reads比對到2 5版本的番茄參考基因組 獲得的比對文件數(shù)據(jù)利用samtools軟 件以及自主開發(fā)的Perl腳本提取多態(tài)性SNP 計(jì)算隱性池的最大等位基因型頻率SNP index 以及該SNP在顯性池的頻率 并且計(jì)算每個(gè)SNP位點(diǎn)的歐幾里得距離 ED值 過濾掉兩池測 序深度都低于15個(gè)reads 以及SNP index都大于0 7的位點(diǎn) 最后對ED值取冪次方后進(jìn)行線 性回歸擬合并作圖 以所有位點(diǎn)冪次方擬合值的中位值及標(biāo)準(zhǔn)差之和的3倍作為閾值線 高 于閾值線的區(qū)段作為候選區(qū)間 根據(jù)BSR的初定位的結(jié)果 如圖2所示 確定glossy初定位 區(qū)間為 Chr 1 84443855至88138301 0038 S4 結(jié)合重測序數(shù)據(jù) 野生醋栗番茄種質(zhì)LA1375已經(jīng)重測序 相關(guān)序列信息詳見 本實(shí)驗(yàn)室對glossy突變體已利用HiSeq4000測序平臺進(jìn)行基因 組重測序 利用GATK鑒定兩池在候選區(qū)段中的多態(tài)性SNP和InDel 根據(jù)自主開發(fā)的程序鑒 定InDel標(biāo)記并設(shè)計(jì)檢測引物 結(jié)合重組單株分析 將目的區(qū)間定位在0 798M的范圍內(nèi) 0039 S5 利用glossy LA1375的F2分離群體大群體進(jìn)一步獲得與glossy緊密連鎖的分 說 明 書 3 5 頁 5 CN 111621588 A 子標(biāo)記 0040 具體步驟如下 0041 1 擴(kuò)大glossy LA1375的F2群體至2586株 0042 2 利用開發(fā)的3個(gè)多態(tài)性分子標(biāo)記 其檢測引物的序列分別為 0043 L F CTTATAGTCTTCTAGGTTATTCCTTTGG 0044 L R ACGACCAAGATTGACTTAACCTG 0045 M F ACACTCCAACAGTAGGATTGGTTTG 0046 M R GTGACAAATGCTATTTTGACAGCATAC 0047 R F ACTTGTTGTGCGTGCCTTAATG 0048 R R CACAATTGATCCATGAGTTTATGAGATG 0049 獲得每株的基因型 共獲得661株目的區(qū)段為隱性的單株 0050 3 利用上述661株隱性單株 結(jié)合分子標(biāo)記鑒定 獲得7株重要重組單株 經(jīng)表型 鑒定確定該7個(gè)單株的果實(shí)均為glossy表型 因此將glossy定位在600kb的范圍內(nèi)并獲得與 glossy緊密連鎖的分子標(biāo)記GLS GLS為一個(gè)插入 缺失標(biāo)記 片段大小為58bp 其序列如SEQ ID NO 1所示 0051 4 檢測上述分子標(biāo)記GLS的一對引物序列為 0052 GLS F TCCTAGACTTCTAGAAATACGTGTGG SEQ ID NO 2 0053 GLS R TGGAAAAGAAAGGAGAAAGGATGAC SEQ ID NO 3 0054 上述引物序列在突變體中擴(kuò)增出的序列如SEQ ID NO 4所示 0055 實(shí)施例2 0056 利用實(shí)施例1中所得到的分子標(biāo)記GLS及引物序列對13份由glossy突變體作為供 體材料得到的植株材料進(jìn)行鑒定 并與其果實(shí)表型進(jìn)行比較 具體步驟如下 0057 1 以番茄相關(guān)株系基因組DNA為模板 引物為GLS 北京全式金生物技術(shù)有限公司 的Easy Taq聚合酶推薦的反應(yīng)體系和程序進(jìn)行擴(kuò)增 PCR產(chǎn)物用2 的瓊脂糖凝膠電泳檢 測 0058 其中 上述技術(shù)方案中所述的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系 按總體積為15 l計(jì) 包括如下各 組分 0059 0060 PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為 94 0 預(yù)變性3min 94 0 變性30s 55 0 復(fù)性30s 72 0 說 明 書 4 5 頁 6 CN 111621588 A 延伸30s 循環(huán)33次 72 0 延伸5min 4 保存 0061 2 結(jié)果分析 0062 擴(kuò)增結(jié)果可能會(huì)出現(xiàn)如下三種情況 0063 第一種情況 出現(xiàn)一條195bp的條帶 表明為純合顯性 表型為正常果實(shí) 0064 第二種情況 出現(xiàn)一條253bp的條帶 為純合隱性 表型為光亮果實(shí) 0065 第三種情況 同時(shí)出現(xiàn)一條195bp的條帶和一條253bp的條帶 則為雜合 表型為果 實(shí)表皮正常 0066 13份植株材料的結(jié)果如附圖3所示 其中正常果實(shí)的為4株 光亮果實(shí)的為9株 與 成熟后果實(shí)表型一致 0067 以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例 并不用以限制本發(fā)明 凡在本發(fā)明的精神和 原則之內(nèi) 所作的任何修改 等同替換 改進(jìn)等 均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi) 說 明 書 5 5 頁 7 CN 111621588 A 序列表 華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 光亮果皮番茄品種選育的分子標(biāo)記及其應(yīng)用 4 SIPOSequenceListing 1 0 1 58 DNA InDel Tomato 1 aaattatttc atgaatttta taatgtgaga cattaaaatt aatattaatt gtgtgaag 58 2 26 DNA 人工序列 GLS F 2 tcctagactt ctagaaatac gtgtgg 26 3 25 DNA 人工序列 GLS R 3 tggaaaagaa aggagaaagg atgac 25 4 253 DNA 番茄 Tomato 4 tcctagactt ctagaaatac gtgtggataa caattttatg tttaaattaa aattaatatt 60 aattgtgtga agaaaattat ttcatgaatt ttataatgtg agacattaaa attaatatta 120 attgtgtgaa gaaattattt catgaatttt ataatgtgag acccattaca atctaacttc 180 accttcttcc taattctttc tttctttgtt cctttttctt cattttttgt catcctttct 240 cctttctttt cca 253 序 列 表 1 1 頁 8 CN 111621588 A 圖1 圖2 圖3 說 明 書 附 圖 1 1 頁 9 CN 111621588 A