15 Vegetables 2020 6 試驗研究 復合促生菌株篩選及其對油菜 黃瓜幼苗的促生效果 張 亮 1 盛 浩 1 譚 麗 2 袁 紅 1 易建平 3 鄧立平 4 1 湖南農業(yè)大學資源環(huán)境學院 湖南 長沙 410128 2 醴陵市農業(yè)農村局土壤肥料工作站 湖南 醴陵 412200 3 醴陵市 農業(yè)農村局 湖南 醴陵 412200 4 醴陵市農技推廣中心 湖南 醴陵 412200 收稿日期 2020 03 11 基金項目 國家自然科學基金 41571234 湖南省自然科學基金 2019JJ50259 1515 學術創(chuàng)新團隊帶頭人培養(yǎng) 項目 通訊作者 譚麗 摘要 為了篩選獲得復合型功能微生物 PGPR 菌株材料 進而從功能微生物的角度理解稻 油輪 作制度的優(yōu)勢 以稻 稻 稻 油輪作制度下耕層水稻土壤作為篩選源 采用選擇性培養(yǎng)基傳統(tǒng)培養(yǎng)法 對可培養(yǎng)細菌 固氮菌 解磷菌以及產IAA 菌株進行分離和篩選 并利用人工氣候箱培育試驗驗證了對 部分篩選獲得的復合型促生菌株對油菜 黃瓜幼苗早期生物促生效果 結果表明 稻 稻輪作耕層土壤 可分離固氮菌35株 解磷菌3 株 稻 油輪作耕層土壤可分離固氮菌38株 解磷菌35株 具有固氮 解磷 以及較強生長素分泌能力的復合型促生菌株6株 其普遍對油菜和黃瓜早期幼苗株高生長具有一定的促生 效果 可分別提高25 45 111 96 和4 45 18 22 此外 DD 69和DY 111 菌株對黃瓜根長 D Y 6 和 DD 79菌株對黃瓜鮮質量具有顯著的促生作用 關鍵詞 植物根際促生菌 輪作 水稻土 菌株篩選 油菜 黃瓜 Screening of Multifunctional PGPR and Their Promotion Effects on Rape and Cucumber Seedlings ZHANG Liang 1 SHENG Hao 1 TAN Li 2 YUAN Hong 1 YI Jianping 3 DENG Liping 4 1 College of Resources and Environment Hunan Agricultural University Changsha 410128 China 2 Soil Fertilizer Work Station Liling Agricultural and Rural Bureau Liling 412200 China 3 Liling Agricultural and Rural Bureau Liling 412200 China 4 Liling Agricultural Technology Extension Center Liling 412200 China Abstract In order to obtain the materials of composite functional microbial PGPR strains and then understand the advantages of rice rape system from the perspective of functional microorganisms using the arable soil of rice rice and rice rape system as the screening sources the cultivable bacteria nitrogen fixing bacteria NFB phosphate solubilizing bacteria PSB and auxin bacteria AB were isolated and screened by traditional selective medium culture method In the incubator culture experiment the early biological growth promoting effect of some selected compound growth promoting strains on rape and cucumber seedlings was verified The results showed that 35 strains of NFB strains and 3 PSB strains could be isolated from top 16 Vegetables 2020 6 試驗研究 化肥和農藥在現(xiàn)代農業(yè)生產中發(fā)揮著重要作 用 然而隨著化肥與農藥使用量的逐年增加 其 殘留物對環(huán)境造成了巨大危害 在提倡高產 高 效 綠色農業(yè)的大背景下 高效 復合型促生菌 的研究與應用為尋求傳統(tǒng)化肥 農藥替代產品以 及修復受損土壤環(huán)境指明了方向 根際促生菌 Plant Growth Promoting Rhizobacteria PGPR 泛指一類自由生長在根際土壤環(huán)境中或根系內 部 并具有促進植物生長或增加作物產量 抑制 病蟲害能力的根際細菌 其對克服土壤逆境 改 善微生態(tài)環(huán)境具有特殊意義 1 目前為止 國內 外已經發(fā)現(xiàn)的具有防病促生潛能的根際微生物有 20多個種屬 包括根瘤菌 沙雷氏屬 熒光假單 孢菌 芽孢桿菌等 2 上述根際促生菌對于植物 的促生機制主要包括合成對于植物生長發(fā)育有直 接促進作用的物質 如吲哚乙酸 IAA 等植物激 素 改變元素形態(tài)促進植物對于養(yǎng)分的吸收等 如固氮 解磷 2 8 然而 大多數菌株在克服 養(yǎng)分 病害逆境時功能較為單一 因此 篩選獲 得具有復合能力的促生菌株 對高效改善根際營 養(yǎng)與調控土壤微生態(tài)環(huán)境具有非常重要的意義 油菜 Brassica napus L 和黃瓜 Cucumis sativus L 均為我國大面積種植作物 特別是油 菜 因其花期之前可作菜用 花期之后籽?？烧?油而具有 油 菜兼顧 之特色 在我國蔬菜和 食用油領域占有重要地位 9 本研究以稻 油不 同輪作條件下的耕層土壤為樣本 擬通過選擇性 培養(yǎng)方法獲得兼具固氮 解磷以及產IAA 能力的 復合型高效促生菌株 并通 過 盆 栽 試 驗 對 其 促 生 效果予以驗證 本研究不僅能夠為蔬菜種植養(yǎng)分培 育資源的更廣闊替代利用提供優(yōu)良促生菌株材料 還可以從可培養(yǎng)耕層土壤促生菌數量的角度揭示 稻 油輪作制度對地力生態(tài)功能維護的優(yōu)勢 1 材料和方法 1 1 試驗材料 1 1 1 供試土壤與種子 土壤為稻 油輪作與稻 稻輪作耕層土壤 位于湖南瀏陽的農大稻 油輪作試驗田 油菜品種為常雜油菜3 號 購于湖南省農業(yè) 科學院湘科種苗集團 黃瓜品種為蔬研十號 購 于湖南興蔬種業(yè)有限公司 1 1 2 培養(yǎng)基 肉湯酵母培養(yǎng)基 NBY 營養(yǎng)肉湯粉8 g 酵母提取物2 g 磷酸氫二鉀2 g 磷酸二氫鉀0 5 g 葡萄糖2 5 g 1 mol L七水合硫酸鎂1 mL 去離 子水1 L 瓊脂15 g pH值7 5 固氮培養(yǎng)基 阿須貝培養(yǎng)基 無N培養(yǎng)基 蘋果酸2 g 三水合磷酸氫二鉀0 5 g 七水合硫酸 鎂0 2 g 氯化鈉0 1 g 二水合氯化鈣20 mg 鉬酸 鈉2 mg 氫氧化鉀4 5 g 5 溴百里酚5 mL 維生 素H 10 mg 瓊脂15 g 去離子水1 L pH值7 5 解磷培養(yǎng)基 葡萄糖10 g 磷酸鈣5 g 六水合 氯化鎂5 g 七水合硫酸鎂0 25 g 氯化鉀0 2 g 硫 酸銨0 1 g 瓊脂15 g 去離子水1 L pH值7 0 液體LB 培養(yǎng)基 胰蛋白胨10 g 酵母提取物 5 g NaCl 10 g 去離子水950 mL pH值7 0 IAA 檢測培養(yǎng)基為胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基 胰蛋白胨17 g 植物蛋白胨3 g 氯化鈉5 g 磷酸氫 二鉀2 5 g 葡萄糖2 5 g 色氨酸100 g mL 最 終pH值7 3 0 2 1 2 試驗方法 1 2 1 復合促生菌株篩選試驗 土壤可培養(yǎng)細菌分離采用連續(xù)稀釋法 具 soil in rice rice rotation system 38 NFB strains and 35 PSB strains could be isolated from top soil in rice rape rotation system and 6 strains of compound type NFB PSB AB PGPR were isolated from top soil in two rotation systems which could promote the growth of plant height of rape and cucumber seedlings by 25 45 111 96 and 4 45 18 22 respectively In addition DD 69 and DY 111 had significant growth promoting effects on the cucumber root length DY 6 and DD 79 had significant growth promoting effects on the fresh quality of cucumber respectively Keywords plant growth promoting rhizobacteria rotation paddy soil strain screening rape cucumber 17 Vegetables 2020 6 試驗研究 體步驟為 稱取10 g土壤于置有90 mL無菌水的 250 mL三角瓶中 振蕩搖勻30 min 180 r min 靜置5 min 分別吸取1 mL懸液加入置有9 mL 無菌水的滅菌試管中 后依次連續(xù)稀釋至10 2 10 3 10 4 10 5 10 6 等不同濃度 吸取不同濃度 混合液100 L并涂布于NBY培養(yǎng)皿中 于25 條 件倒置培養(yǎng)于生化培養(yǎng)箱中 菌株純化 每隔12 h觀察上述培養(yǎng)皿生長情 況 待菌落生長至適合形態(tài)時 用接種棒挑取單 菌落劃線至NBY培養(yǎng)皿 25 條件倒置培養(yǎng)于生 化培養(yǎng)箱培養(yǎng) 備用 促生菌初篩 分別將純化后的菌株接種于固 氮 解磷培養(yǎng)基 室溫條件培養(yǎng) 每隔12 h觀察 菌株生長情況 在2 種固氮培養(yǎng)皿上同時可以良 好生長的菌株記為固氮菌 在解磷培養(yǎng)基上可觀 察到清澈透明圈的菌株記為解磷菌 所有記號菌 株均另劃線接種至新NBY 培養(yǎng)皿 編號 室溫培 養(yǎng)3 d 后轉至4 低溫保存 備用 促生菌復篩 將疑似菌株重復進行固氮解磷 培養(yǎng)試驗 以檢驗效果是否準確 同時將疑似固 氮解磷菌株分別接種至含有5 mL液體LB 培養(yǎng)基 的10 mL試管中 于170 r min 28 條件下振蕩 培養(yǎng)48 h 后加入Salkowsky生長素顯色試劑 觀 察顯色反應 確定其產IAA 能力強弱 如顯粉紅 色則為產生長素菌株 記號并進行生長素定量檢 測 IAA 定量檢測 10 接種于IAA 檢測培養(yǎng)基的各 生防菌株在24 150 r min條件下振蕩培養(yǎng)48 h 后 經12 000 r min離心10 min 1 mL菌懸液加入 2 mL Salkowsky試劑并混勻 于28 培養(yǎng)30 min后 得到粉色顯色 并在530 nm條件下進行比色 以 10 100 g mL的標準IAA稀釋液設置標準曲線 單位表示為 g mL 1 2 2 盆栽促生試驗 采用人工氣候箱培育油菜和黃瓜幼苗 具體 步驟為 1 土壤 過2 mm篩風干土 裝杯 2 供試促生菌經純化后接種于100 mL NBY 液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)48 h 備用 3 將形態(tài) 一致的油菜種子 黃瓜種子分別于各菌株發(fā)酵液 中浸種10 min 后均勻播種于上述土杯中 每杯 5 粒 并將剩余菌液倒入各處理土壤 以清水 作為對照 4 培養(yǎng)于人工氣候箱中 培養(yǎng)條 件 28 光照16 h 16 無光8 h 試驗設無菌對照處理和已篩選出的不同復合 菌株處理 各處理重復10杯 日常管理 10 d后 觀察記錄不同處理油菜 黃瓜幼苗植株鮮質量 根長 株高等生長指標 2 結果與分析 2 1 固氮 解磷菌株初篩結果 從表1 可以得出 篩選并純化處理后 最終 獲得稻 稻輪作土壤中可分離菌株194株 稻 油輪作土壤中可分離菌株208株 通過選擇性培養(yǎng)基專性生長培養(yǎng)法 初步篩 選共獲得固氮菌73株 其中稻 稻輪作土壤獲得 35株 稻 油輪作土壤獲得38株 解磷菌38株 其中稻 稻輪作土壤獲得3 株 稻 油輪作土壤 獲得35株 表1 2 2 固氮 解磷菌株復篩驗證 通過對比2 種不同種植制度中所獲解磷菌與 固氮菌編號 圖1 圖2 發(fā)現(xiàn) 同時兼具解磷 與固氮效果的復合菌株編號為 59 69 79號 稻 稻 6 7 14 107 110 111 112 號 稻 油 2 3 復合型固氮解磷菌產IAA能力定量檢測 通過對兼具固氮與解磷特性的復合菌株進 行產IAA 能力定量檢測后發(fā)現(xiàn) DD 69 DD 79 D Y 6 D Y 7 DY 111 DY 112具有較強的 IAA 分泌能力 10 g mL 其濃度范圍為 10 09 12 59 g mL 表2 表1 固氮 解磷菌株篩選結果 土壤來源 可分離細菌 初篩 復篩 初篩解磷菌 初篩固氮菌 兼具固氮解磷菌 稻 稻輪作土壤 194 3 35 3 稻 油輪作土壤 208 35 38 7 株 18 Vegetables 2020 6 試驗研究 2 4 盆栽促生實驗結果分析 如表3 所示 與對照相比 篩選出的6 株復 合型促生菌對油菜和黃瓜幼苗早期株高的生 長普遍具有顯著的促進效果 其增幅分別為 25 45 111 96 和4 45 18 22 以DD 69最 佳 促生菌D Y 6 與D Y 7 菌株對油菜幼苗早期根系 生長具有一定促進效果 DD 79 DY 111 菌促生 效果均不顯著 促生菌DD 69與DY 111 對黃瓜幼 苗早期根系生長具有一定促進效果 且與CK 和其 他菌株差異顯著 促生菌對油菜幼苗早期鮮質量 的影響差異不顯著 但促生菌D Y 6 和DD 79對黃 瓜幼苗早期鮮質量具有顯著促生效果 3 結論與討論 本研究通過選擇性培養(yǎng)基分離等傳統(tǒng)微生物 技術對稻 稻輪作與稻 油輪作制度下耕層水 稻土壤中的促生細菌進行了分離與篩選工作 結果表明稻 稻輪作耕層土壤中分離獲得194個 菌株 其中含固氮菌35株 解磷菌3 株 稻 油 輪作耕層土壤中分離獲得208個菌株 其中含固 氮菌38株 解磷菌35株 復合驗證結果顯示 兼具固氮 解磷以及較強生長素分泌能力的促 生菌株共6 株 分別為DD 69 DD 79 D Y 6 D Y 7 DY 111 DY 112 其IAA 分泌濃度為 10 09 12 59 g mL 經人工氣候箱培育試驗發(fā) 現(xiàn) 獲得的6 株復合型促生菌普遍對油菜和黃瓜 早期幼苗株高生長具有一定的促生效果 尤其是 有利于幼苗株高的生長 根際促生菌 PGPR 是一類根際環(huán)境友好 型微生物 具有改善土壤理化性質 提高土壤 肥力 抑制病蟲害發(fā)生等重要農業(yè)利用屬性 11 顏色越透明 解磷能力越強 圖1 解磷菌平板篩選結果 阿須貝培養(yǎng)基 無N 培養(yǎng)基 能夠同時在無氮培養(yǎng)基和阿須貝培養(yǎng)基上生長的菌株為固氮菌 生長越旺盛 固氮能力越強 圖2 固氮菌平板篩選結果 表2 產IAA能力檢測結果 部分菌株 IAA高產菌株編號 濃度 g mL DD 69 10 13 DD 79 10 09 DY 6 11 26 DY 7 10 58 DY 111 11 12 DY 112 12 59 19 Vegetables 2020 6 試驗研究 對復合型高效促生菌的篩選是獲得這類有益微生 物的必然途徑 本研究以稻 稻 稻 油等不同 輪作制度的耕層水稻土壤為篩選材料 通過傳統(tǒng) 微生物分離技術 對其中的固氮菌 解磷菌以及 生長素代謝菌等可培養(yǎng)功能細菌進行了分離與篩 選 并經復篩與盆栽試驗對獲得的6 株復合型促 生菌株的促生效果予以了明確 這與前人 11 有關 固氮 解磷菌促進作物生長的試驗結果一致 本 研究中6 株促生菌雖對油菜幼苗和黃瓜幼苗的早 期生長具有一定促進效果 但對根系的促生效果 普遍不夠顯著 DD 69和DY 111 除外 這可能 與接種劑量以及容重等土壤理化性狀有關 12 此 外 本研究結果還顯示出稻 油輪作制度下耕層 水稻土壤中的可分離細菌以及具有固氮 解磷 產IAA 能力促生菌可篩選數量明顯高于稻 稻輪 作制度的種植土壤 從根際有益微生物的角度佐 證了稻 油輪作制度對作物根際土壤生態(tài)環(huán)境的 積極作用 參考文獻 1 KLOEPPER J W SCHORTH M KLOEPPER J et al Plant growth promoting rhizobacteria in radishes C proceedings of the 4th international conference on plant pathogenic bacteria Tours Gilbert Clarey 1978 879 882 2 林凡 王正芳 宋末 等 聯(lián)合固氮菌的應用效益與增產 機理 J 中國農學通報 1998 14 3 32 34 3 劉淑琮 馮斷 于潔 植物根際促生菌的研究進展及其環(huán) 境作用 J 湖北農業(yè)科學 2009 48 11 2882 2287 4 田宏 張德罡 姚拓 土壤聯(lián)合固氮菌的研究進展 J 草 原與草坪 2004 2 3 7 5 田婧 李邵 馬寧 等 植物根際促生菌作用機理研究進 展 J 安徽農業(yè)科學 2016 44 10 1 2 39 6 GLICK B R The enhancement 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CK 3 93d 1 53ab 0 13a 2 47c 1 39b 0 58b DD 69 8 33a 1 43ab 0 17a 2 92a 1 77a 0 70ab DD 79 6 17b 1 77ab 0 18a 2 73a 1 55b 0 72a DY 6 4 93c 2 57a 0 19a 2 64b 1 46b 0 79a DY 7 7 17ab 2 40a 0 24a 2 88a 1 48b 0 66b DY 111 7 27ab 1 80ab 0 20a 2 75a 1 84a 0 70ab DY 112 6 03b 1 13b 0 18a 2 58bc 1 57b 0 64b 注 同列不同小寫字母表示在0 05水平上差異顯著