羅宇婷 黃藝清 黃 琪 等 優(yōu)選盆栽小菊高效再生及轉(zhuǎn)化體系的建立 J 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020 48 11 61 66 doi 10 15889 j issn 1002 1302 2020 11 012 優(yōu)選盆栽小菊高效再生及轉(zhuǎn)化體系的建立 羅宇婷 黃藝清 黃 琪 朱品清 鐘聲遠 房偉民 管志勇 王海濱 陳發(fā)棣 蔣甲福 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部景觀設(shè)計重點實驗室 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院 江蘇南京 210095 摘要 為篩選最適盆栽小菊品種 建立再生轉(zhuǎn)化體系 以 11 個盆栽小菊品種無菌苗葉片為外植體 比較不同植物 生長調(diào)節(jié)劑配比和抗生素對葉片愈傷組織誘導(dǎo) 不定芽分化及生根等過程的影響 結(jié)果表明 11 個品種中再生率最 高的為微風(fēng)深紅 其最適分化培養(yǎng)基為 MS 1 0 mg L 6 BA 0 2 mg L NAA 再生率為 95 0 葉片分化對卡那霉 素和潮霉素的抗性選擇壓分別為 15 10 mg L 對植株生根的抗性選擇壓分別為 10 8 mg L 羧芐青霉素抑菌濃度最適 范圍為 200 400 mg L 本研究建立了盆栽小菊葉片外植體的高效再生及轉(zhuǎn)化體系 為今后菊花的轉(zhuǎn)基因工作奠定 良好的基礎(chǔ) 關(guān)鍵詞 盆栽小菊 葉片 不定芽生根 農(nóng)藝性狀 再生 遺傳轉(zhuǎn)化 選擇壓力 中圖分類號 S682 1 10 4 3 文獻標(biāo)志碼 A 文章編號 1002 1302 2020 11 0061 06 收稿日期 2019 06 04 基金項目 江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金 編號 CX 17 3036 江蘇 現(xiàn)代農(nóng) 業(yè) 花 卉 產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系綜合示范基地項目 編 號 JATS2018002 青海省科技項目 編號 2018HZ819 教育部高校 科研基地業(yè)務(wù)費項目 編號 KJFP201703 作者簡介 羅宇婷 1995 女 四川樂山人 碩士研究生 主要從事 觀賞植物育種與栽培技術(shù)研究 E mail 532969000 qq com 通信作者 蔣甲福 博士 教授 博士生導(dǎo)師 主要從事菊花遺傳育種 與分子生物學(xué)研究 E mail jiangjiafu njau edu cn 菊花 Chrysanthemum morifolium amat 在我 國有著源遠流長的栽培歷史 至今已培育出各具特 色的品種群 發(fā)展成為世界四大切花之一 具有很 高的觀賞和經(jīng)濟價值 1 因而篩選 培育具有優(yōu)良 性狀的新品種十分具有實用意義 隨著植物基因 工程技術(shù)的發(fā)展 通過基因工程改良性狀己經(jīng)逐漸 成為植物定向遺傳改良的重要手段 由于菊花的 品種繁多 遺傳背景復(fù)雜 不同基因型菊花的再生 能力也各不相同 2 研究表明 基因型差異是影響 菊花再生的主要因素 3 Horsch 等在之前的農(nóng)桿 菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化試驗中利用葉盤轉(zhuǎn)換法 對多個不同 品種的菊花進行再生試驗 結(jié)果發(fā)現(xiàn) 不同品種的 菊花有著較大差異的遺傳轉(zhuǎn)化率 表明菊花的轉(zhuǎn)化 效率依賴于品種 4 目前 已經(jīng)利用葉片 葉柄 莖 段 花器官等外植體實現(xiàn)了不同品種菊花再生和轉(zhuǎn) 化體系的建立 5 6 而應(yīng)用于遺傳轉(zhuǎn)化最普遍的受 體材料是葉片 7 利用盆栽小菊進行再生及轉(zhuǎn)化 體系建立至今未見報道 本研究以 11 個盆栽小菊 新品種葉片為外植體 從基因型 6 芐氨基嘌呤 6 BA 和萘乙酸 NAA 激素配比以及抗生素對 菊花再生的影響進行系統(tǒng)深入的研究 旨在建立高 效再生及轉(zhuǎn)化體系 為盆栽小菊的分子遺傳育種奠 定基礎(chǔ) 1 材料與方法 1 1 試驗材料 供試材料為盆栽小菊品種微風(fēng)深紅 花灑綠色 心情 色彩火山 微風(fēng)橙綠 微風(fēng)玫瑰 微風(fēng)索爾 青 檸水晶 夢幻粉水晶 紅水晶 微風(fēng)紅霞和粉色 取 自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)中國菊花種質(zhì)資源保存中心 1 2 性狀選取與數(shù)量采集 從定植到開花期 對 11 個品種的株高 莖粗 花徑 花型 花色 定植時間 現(xiàn)蕾時間 開花時間這 9 個性狀 8 采用直尺 游標(biāo)卡尺 目測的方法進行測 定 每個品種 10 次重復(fù) 1 3 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件 以 MS 培養(yǎng)基 9 作為基本培養(yǎng)基 在此基礎(chǔ)上 添加 30 g L 蔗糖和 6 5 g L 瓊脂 植物生長調(diào)節(jié)劑 選用不同濃度比的 6 BA 和 NAA 用 1 mol L NaOH 調(diào)節(jié) pH 值至 5 8 116 高溫高壓滅菌 30 min 培養(yǎng)室溫度為 25 光照度 20 25 lx 每 天光照 12 h 1 4 不同基因型葉片外植體再生差異 挑選 3 個具有代表性的 含不同濃度比 6 BA 和 NAA 的分化培養(yǎng)基 M2 M5 M7 表 1 對 11 個 16 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020 年第 48 卷第 11 期 品種進行初步篩選 10 從中挑選出再生率高的 6 個品種 使用 9 個不同濃度配比 6 BA 和 NAA 的 分化培養(yǎng)基 M1 M9 表 1 對其細篩選 各品種每 個培養(yǎng)基接種 30 個葉盤 3 次重復(fù) 30 d 后統(tǒng)計再 生率 不定芽再生率 再生不定芽外植體數(shù) 接種 外植體總數(shù) 100 表 1 直接誘導(dǎo)芽再生培養(yǎng)基 mg L 培養(yǎng)基 6 BA 濃度 NAA 濃度 M1 1 0 0 2 M2 1 0 0 5 M3 1 0 0 8 M4 2 0 0 2 M5 2 0 0 5 M6 2 0 0 8 M7 3 0 0 2 M8 3 0 0 5 M9 3 0 0 8 1 5 卡那霉素和潮霉素篩選濃度的確定 1 5 1 葉片外植體分化 以篩選出的品種為材料 將葉片接種于含不同濃度梯度的卡那霉素 Km 和 潮霉素 Hyg 的最適分化培養(yǎng)基上 Km 和 Hyg 設(shè) 置 0 5 10 15 20 25 mg L 6 個濃度處理 每個處理 接種 30 個外植體 3 次重復(fù) 30 d 后統(tǒng)計分化 情況 1 5 2 不定芽生根 以篩選出的品種為材料 將不 定芽接種于含不同濃度梯度的 Km 和 Hyg 的生根 培養(yǎng)基上 Km 和 Hyg 設(shè)置為 0 5 8 10 12 15 mg L 6 個濃度處理 每個處理接種 10 個外植體 3 次重 復(fù) 15 d 后統(tǒng)計生根情況 1 6 羧芐青霉素抑菌濃度的確定 將生長狀況一致的葉片外植體用無菌手術(shù)刀 切成約 5 cm 5 cm 大小的葉盤 在最適分化培養(yǎng) 基上培養(yǎng) 3 d 用農(nóng)桿菌侵染 7 min 后將多余菌液吹 干 置于最適分化培養(yǎng)基中黑暗共培養(yǎng) 3 d 將葉盤 轉(zhuǎn)入含有不同濃度的羧芐青霉素 Cb 培養(yǎng)基中 Cb 設(shè)置為 0 200 300 400 500 mg L 共 5 個處理 同時 以未侵染農(nóng)桿菌的葉盤作為空白對照 每個處理接 種 20 個外植體 每個處理 3 次重復(fù) 15 d 后統(tǒng)計 抑菌情況 2 結(jié)果與分析 2 1 11 個盆栽小菊農(nóng)藝性狀觀察 對 2018 年定植的 11 個盆栽小菊品種基本性狀 進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計 結(jié)果 表 2 表明 11 個品種的株高 在 15 58 cm 之間 莖粗在 4 83 7 89 cm 之間 微 風(fēng)索爾的花徑最大 達 10 5 cm 花徑最小的品種是 粉色 僅 3 5 cm 花色中多為粉色 紅色 黃色 品種 粉色從定植到開花的時間最短 為 130 d 表 2 11 個菊花品種農(nóng)藝性狀的統(tǒng)計 品種 株高 cm 花徑 cm 莖粗 mm 花型 花色 定植時間 月 日 現(xiàn)蕾時間 月 日 顯色時間 月 日 開花時間 月 日 花灑綠色心情 39 8 7 4 83 蓮座 綠色 05 29 09 24 10 28 11 11 色彩火山 34 7 7 6 11 單瓣 紅黃 05 31 09 25 10 28 11 30 微風(fēng)橙綠 28 8 6 7 30 單瓣 橙色 06 05 09 19 10 18 11 03 微風(fēng)玫瑰 17 7 9 6 21 單瓣 粉色 06 05 09 25 10 22 11 03 微風(fēng)索爾 37 10 5 7 32 單瓣 黃色 05 31 09 25 10 23 11 04 青檸水晶 34 9 6 7 89 蓮座 黃色 06 21 09 28 10 28 11 11 夢幻粉水晶 58 6 8 7 73 蓮座 粉色 06 21 09 23 10 23 11 04 微風(fēng)深紅 44 8 3 5 23 單瓣 紅色 06 21 10 01 10 21 11 09 紅水晶 36 7 9 6 10 蓮座 紅色 06 21 09 29 10 21 11 09 微風(fēng)紅霞 29 7 5 4 95 單瓣 紅色 06 05 09 30 10 14 11 09 粉色 15 3 5 6 44 復(fù)瓣 粉時色 06 10 09 14 10 07 10 18 2 2 不同基因型葉片外植體再生差異 在 3 種常用分化培養(yǎng)基上 11 個品種盆栽小菊 的葉片外植體分化差異較大 其中微風(fēng)深紅 微風(fēng) 索爾 微風(fēng)紅霞 微風(fēng)玫瑰 粉色 紅水晶都能產(chǎn)生 不定芽 但是其他品種夢幻粉水晶 花灑綠色心情 色彩火山 微風(fēng)橙綠 青檸水晶都出現(xiàn)明顯的褐化 現(xiàn)象且不能分化出不定芽 因此 本試驗選擇微風(fēng) 深紅 微風(fēng)索爾 微風(fēng)紅霞 微風(fēng)玫瑰 粉色 紅水晶 6 個品種進行下一步細篩試驗 enou 等的試驗表明 6 BA 和 NAA 是對菊花 26 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020 年第 48 卷第 11 期 再生最佳的植物生長調(diào)節(jié)劑 11 將 6 種盆栽菊花 葉片外植體接種在 9 種含不同配比 NAA 和 6 BA 激素的分化培養(yǎng)基上進行再生率的觀察 從表 3 可以看出 只有品種微風(fēng)深紅可以在所有不同配比 的分化培養(yǎng)基上都分化出不定芽 同一品種在不同 的激素濃度處理下分化情況有著較大的差異 當(dāng) 6 BA NAA 濃度分別為 1 0 0 2 mg L 時 再生率 最高 可達 95 表 3 圖 1 試驗結(jié)果還可以看 出 在同一處理下不同盆栽菊的分化情況也有所不 同 其他 5 個品種只能在特定 NAA 和 6 BA 比例 的 MS 培養(yǎng)基上產(chǎn)生不定芽 此結(jié)論與李金童等對 4 種露地菊建立再生體系的試驗結(jié)果 12 一致 因 此 在后續(xù)試驗中以微風(fēng)深紅作為遺傳轉(zhuǎn)化對象 確定其葉片分化培養(yǎng)基為 MS 1 0 mg L 6 BA 0 2 mg L NAA 其他 5 個品種不作進一步研究 表 3 不同激素配比對菊花葉片再生的影響 培養(yǎng)基編號 不同品種的再生頻率 微風(fēng)紅霞 紅水晶 微風(fēng)索爾 微風(fēng)玫瑰 微風(fēng)深紅 粉色 M1 0 00 0 00b 8 33 7 63ab 3 33 1 15ef 0 00 0 00c 95 00 1 00a 0 00 0 00b M2 5 00 5 00a 0 00 0 00c 16 67 1 52de 0 00 0 00c 61 67 1 53b 10 00 2 89a M3 0 00 0 00b 0 00 0 00c 83 33 1 52a 0 00 0 00c 13 33 1 53c 8 33 6 01ab M4 0 00 0 00b 10 00 5 00a 0 00 0 00c 0 00 0 00c 60 00 3 00b 3 33 3 33ab M5 0 00 0 00b 3 33 5 78abc 20 00 3 00d 0 00 0 00c 63 33 3 06b 1 67 1 67ab M6 0 00 0 00b 0 00 0 00c 88 33 1 52a 0 00 0 00c 18 33 3 06c 1 67 1 67ab M7 0 00 0 00b 0 00 0 00c 0 00 0 00c 28 33 3 51a 76 67 3 79ab 1 67 1 67ab M8 0 00 0 00b 0 00 0 00c 58 33 2 08b 15 00 1 00b 66 67 2 31b 0 00 0 00b M9 0 00 0 00b 1 67 2 89bc 41 67 1 15c 0 00 0 00c 11 67 1 53c 0 00 0 00b 注 采用 Fisher s LSD 法比較差異顯著性 同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示在 0 05 水平上差異顯著 2 3 卡那霉素和潮霉素篩選濃度的確定 2 3 1 對葉片外植體再生的選擇壓力確定 不同 基因型 不同外植體對不同選擇劑甚至同一選擇劑 的敏感程度不同 因此須要進行選擇劑濃度的確 定 本試驗發(fā)現(xiàn) 抗生素 Hyg 和 Km 對菊花幼葉再 生有抑制作用 隨著抗生素濃度的增加 微風(fēng)深紅 葉片外植體再生能力逐漸下降 表 4 當(dāng) Hyg Km 濃度分別為 10 15 mg L 時 葉片脫分化率分別為 表 4 不同濃度抗生素對微風(fēng)深紅葉片分化的影響 抗生素濃度 mg L 接種數(shù) 個 脫分化率 分化率 Km Hyg Km Hyg 0 60 100 0 100 0 96 7 83 3 5 60 96 7 100 0 15 0 3 3 8 60 63 3 90 0 3 3 0 0 10 60 48 3 30 0 1 7 0 0 15 60 6 7 3 3 0 0 0 0 25 60 0 0 0 0 0 0 0 0 36 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020 年第 48 卷第 11 期 30 6 7 不定芽的分化完全被抑制 圖 2 圖 3 由上述結(jié)果可知 10 mg L Hyg 15mg L Km 為 微風(fēng)深紅葉片外植體再生的臨界耐受濃度 可作為 其遺傳轉(zhuǎn)化過程中葉片再生的選擇壓力 2 3 2 不定芽生根的選擇壓力確定 由表 5 可知 抗生素 Km 和 Hyg 對微風(fēng)深紅莖段外植體生根具 有抑制作用 且抗生素濃度越大 抑制作用越明顯 當(dāng) Km 和 Hyg 濃度分別上升為 10 8 mg L 時 莖段 外植體的生根能力完全被抑制 圖 4 圖 5 因此 10 mg L Km 8 mg L Hyg 為微風(fēng)深紅莖段生根的臨 表 5 不同濃度抗生素對微風(fēng)深紅不定芽生根的影響 抗生素濃度 mg L 接種數(shù) 個 生根數(shù) 個 生根率 Km Hyg Km Hyg 0 30 30 30 100 0 100 0 5 30 28 13 93 3 43 3 8 30 11 0 36 7 0 0 10 30 0 0 0 0 0 0 12 30 0 0 0 0 0 0 15 30 0 0 0 0 0 0 界耐受濃度 可作為遺傳轉(zhuǎn)化過程中生根的選擇 壓力 2 4 羧芐青霉素抑菌濃度的確定 由表 6 可知 Cb 對農(nóng)桿菌的抑制效果相對明 顯 當(dāng)不添加 Cb 時 經(jīng)過農(nóng)桿菌侵染的葉片外植 體農(nóng)桿菌大量繁殖導(dǎo)致植株死亡 葉片不能進行分 化 而未經(jīng)侵染的葉片外植體再生率可達 92 9 圖 6 而隨著 Cb 濃度的増大 葉片周圍產(chǎn)生的菌 落逐漸減少 部分外植體傷口邊緣有褐化現(xiàn)象 當(dāng) Cb 濃度達到 400 mg L 時 農(nóng)桿菌生長被完全抑制 無可見菌斑 葉片正常分化 再生頻率可達 89 7 當(dāng) Cb 濃度為 500 mg L 時 雖然抑制了農(nóng)桿菌的生 長 但葉盤也受到了毒害 甚至褐化死亡 再生率下 降 因此 最適抑菌濃度為 400 mg L 3 討論 植物組織培養(yǎng)一直是獲得再生植株和植物基 因工程育種的關(guān)鍵步驟之一 對于遺傳轉(zhuǎn)化體系來 說 擁有高效的再生率是其必要條件 13 但菊花的 組織培養(yǎng)具有復(fù)雜性和多樣性 不同品種間再生能 46 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020 年第 48 卷第 11 期 表 6 不同濃度的羧芐青霉素抑菌效果對微風(fēng)深紅葉片分化的影響 處理 Cb 濃度 mg L 抑菌效果 再生率 CK 0 0 92 9 CK 1 0 農(nóng)桿菌孳生嚴(yán)重 菌群布滿容器 0 1 100 農(nóng)桿菌孳生嚴(yán)重 染菌數(shù)為 60 28 3 2 200 農(nóng)桿菌孳生 染菌數(shù)為 40 42 8 3 300 少量農(nóng)桿菌孳生 染菌數(shù)為 15 62 0 4 400 農(nóng)桿菌生長被完全抑制 無可見菌斑 89 7 5 500 農(nóng)桿菌生長被完全抑制 無可見菌斑 32 9 注 CK 0 指外植體未經(jīng)農(nóng)桿菌侵染的空白對照 CK 1 指外植體經(jīng) 農(nóng)桿菌侵染的對照 力有很大的差異 激素種類以及配比的不同都對再 生有影響 14 在菊花的離體培養(yǎng)中使用最廣泛的激 素為 6 BA 和 NAA 15 毛洪玉等誘導(dǎo)地被菊中國紅 葉片 在 MS 2 0 mg L 6 BA 0 2 mg L NAA 的 培養(yǎng)基上獲得了最高的不定芽分化率 16 梁芳等誘 導(dǎo)菊花品種獅子頭葉片 發(fā)現(xiàn)最適的分化培養(yǎng)基為 MS 0 1 mg L NAA 1 0 mg L 6 BA 17 吳志蘋 等的試驗表明 菊花金不凋愈傷組織不定芽分化的 最適培養(yǎng)基為 MS 1 5 mg L 6 BA 0 5 mg L NAA 不定芽分化率為 90 0 18 本研究以 MS 培 養(yǎng)基為基礎(chǔ) 在不同的 6 BA 和 NAA 組合下 對 11 個不同基因型盆栽小菊葉片外植體進行再生能 力評估 其中 菊花品種微風(fēng)深紅的分化能力最 強 在 MS 1 0 mg L 6 BA 0 2 mg L NAA 的分 化培養(yǎng)基中再生頻率高達 95 結(jié)果表明 不同基 因型菊花最適的 6 BA 和 NAA 配比是不同的 基 因型是影響外植體高效再生的決定性因素 這與前 人的觀點 19 一致 在使用不同濃度激素配比進行最適再生培養(yǎng) 基篩選時 很多葉片會出現(xiàn)褐化現(xiàn)象 組培褐化的 發(fā)生與否通常由植物種類及自身基因型決定 20 本試驗中除微風(fēng)深紅其他品種均出現(xiàn)褐化且再生 率較低 這可能與植物自身的基因型有關(guān) 彭思維 等在研究火龍果莖段愈傷組織誘導(dǎo)時發(fā)現(xiàn) 高濃度 的生長調(diào)節(jié)劑噻苯隆 TDZ 會導(dǎo)致植物組織加快分 裂 使得愈傷組織來不及吸收營養(yǎng)最終褐化 21 在 進行愈傷誘導(dǎo)時使用不同濃度配比的 6 BA 和 NAA 隨著 6 BA 濃度的升高 褐化品種的葉片褐 化率升高 菊花葉片的褐化是與植物自身的基因 型有關(guān) 還是與植物生長調(diào)節(jié)劑的類型及濃度使用 不當(dāng)有關(guān) 具體原因須要進一步研究 菊花的遺傳轉(zhuǎn)化中最常使用的選擇標(biāo)記抗生素 主要是卡那霉素和潮霉素 22 卡那霉素的使用濃度 范圍一般為 5 50 mg L 潮霉素為 5 20 mg L 15 本試驗發(fā)現(xiàn) 微風(fēng)深紅對 Hyg 比對 Km 更為敏感 當(dāng) Hyg 濃度為 10 mg L 時已經(jīng)可以完全抑制其分 化 但是 Km 濃度要達到 15 mg L 時才能起到完全 抑制分化的作用 寧云霞用葉盤作為外植體對菊 花白安娜分化的 Hyg 濃度進行篩選 發(fā)現(xiàn) 8 mg L Hyg 是菊花葉盤最適的抗性選擇壓力 23 在本試驗 中微分深紅葉盤分化的臨界濃度為 10 mg L Hyg 這表明不同基因型菊花對 Hyg 的敏感度不同 本 56 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020 年第 48 卷第 11 期 試驗中只看到少數(shù)轉(zhuǎn)化后的外植體產(chǎn)生抗性芽 原 因之一可能是預(yù)培養(yǎng)的時間不合理 賈紅梅等的研 究表明 預(yù)培養(yǎng)時間過長會造成菊花葉片切割處褐 化 影響轉(zhuǎn)化的成功率 24 原因之二可能是潮霉素 對植物組織有很大的毒害作用 即使是低濃度的潮 霉素也會產(chǎn)生很大的毒害作用 25 26 本試驗在經(jīng) 過農(nóng)桿菌侵染后添加 Cb 抑菌 從試驗結(jié)果可以看 出 Cb 濃度升高使得不定芽分化受到抑制 這與 da Silva 發(fā)現(xiàn)的 Cb 對菊花外植體分化不定芽具有一定 毒性的結(jié)論 27 一致 因此 抗生素在篩選轉(zhuǎn)化細胞 的同時也對細胞有毒害作用 如何減少抗生素的毒 害作用 提高轉(zhuǎn)化效率是今后菊花基因工程育種努 力的方向 4 結(jié)論 本研究從 11 個盆栽小菊品種中篩選出較其他 品種有很大再生優(yōu)勢的品種微風(fēng)深紅 通過葉片外 植體建立再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系 其最適分化培 養(yǎng)基為 MS 1 0 mg L 6 BA 0 2 mg L NAA 再 生率為 95 0 葉片分化對 Km 和 Hyg 的抗性選擇 壓分別為 15 10 mg L 生根的抗性選擇壓分別為 10 8 mg L Cb 的最適濃度范圍為 200 400 mg L 本研究能為今后菊花的轉(zhuǎn)基因工作奠定良好的 基礎(chǔ) 參考文獻 1 Peng H Zhang F Jiang J F et al Identification of quantitative trait loci for branching traits of spray cut chrysanthemum J Euphytica 2015 202 3 385 392 2 王碧玉 菊花再生及遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究 D 沈陽 沈陽農(nóng)業(yè) 大學(xué) 2017 3 周蘊薇 劉 彧 馬 欣 等 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)地被菊 紫妍 遺 傳轉(zhuǎn)化體系的建立 J 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報 2016 25 12 1861 1869 4 Horsch B Fry J E Hoffmann N L et al A simple and general method for transferring genes into plants J Science 1985 227 4691 1229 1231 5 程密密 楊 霞 楊玉燦 等 翠菊品種庫蕾娜葉片和葉柄及莖段 的再生研究 J 黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014 10 20 22 6 魏曼曼 王江民 Imtiaz M 等 菊花花色嵌合花瓣的離體培養(yǎng)及 植株再生 J 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報 2014 36 4 107 112 7 丁曉霞 菊花組培再生體系研究進展 J 遼寧林業(yè)科技 2018 4 64 65 68 8 馮晴云 切花菊表型性狀遺傳多樣性分析及初選核心種質(zhì)構(gòu)建 D 南京 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 2015 9 Murashige T Skoog F A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures J Physiologia Plantarum 1962 15 3 473 497 10 吳慧瑩 藍色花色轉(zhuǎn)基因受體菊花品種篩選及其再生體系建立 D 南京 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 2015 11 enou J P Brochard P Jalouzot ecovery of transgenic chrysanthemum Dendranthema grandiflora Tzvelev after hygromycin resistance selection J Plant Science 1993 89 2 185 197 12 李金童 吳雅妮 丁 兵 等 四種露地菊再生體系的建立 J 北方園藝 2016 19 119 124 13 張 微 王良群 劉 勇 等 玉米不同部位愈傷組織誘導(dǎo)及植 株再生的比較研究 J 核農(nóng)學(xué)報 2017 31 11 2135 2144 14 趙喜亭 蔣麗微 王 苗 等 懷黃菊間接體胚受體再生體系的 建立及 CmTGA1 的遺傳轉(zhuǎn)化 J 植物學(xué)報 2016 51 4 525 532 15 許高娟 部分菊花近緣種屬植物黑斑病苗期抗性及 hrfA 基因 轉(zhuǎn)化菊花的研究 D 南京 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 2009 16 毛洪玉 周 楊 劉 迪 等 地被菊 中國紅 再生及遺傳轉(zhuǎn)化 體系的建立 J 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報 2015 46 6 672 677 17 梁 芳 王默霏 王潔瓊 等 菊花高效再生體系的建立及抗生 素對葉片分化的影響 J 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2015 43 6 40 43 18 吳志蘋 高亦珂 范 敏 等 菊花 金不凋 再生及遺傳轉(zhuǎn)化體 系的構(gòu)建 J 分子植物育種 2020 18 1 150 158 19 da Silva J A T Chrysanthemum advances in tissue culture cryopreservation postharvest technology genetics and transgenic biotechnology J Biotechnology Advances 2003 21 8 715 766 20 馮代弟 王 燕 陳劍平 植物組培褐化發(fā)生機制的研究進展 J 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報 2015 27 6 1108 1116 21 彭思維 王永清 范建新 等 火龍果莖段愈傷組織誘導(dǎo)及再生 體系的建立 J 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