西 北 農(nóng) 業(yè) 學 報 網(wǎng)絡(luò)出版日期 網(wǎng)絡(luò)出版地址 基于 基因的寧夏煙粉虱及 溫室白粉虱分子鑒定 收稿日期 修回日期 基金項目 寧夏 十三五 重點研發(fā)計劃重大項目 寧夏自然科學基金 國家自然科學基金 第一作者 宋鮮梅 女 碩士研究生 從事植物保護研究 通信作者 王新譜 男 博士 教授 從事昆蟲系統(tǒng)學與多樣性研究 李 敏 女 博士 副教授 從事昆蟲分子生物學研究 宋鮮梅 李 敏 何云川 賀海明 王新譜 寧夏大學 農(nóng)學院 銀川 太原師范學院 生物系 山西晉中 摘 要 基于線粒體 基因 對寧夏地區(qū)粉虱進行分子鑒定 選取寧 夏 個粉虱地理種群的 個樣本作為試驗材料 用 軟件對 基因序列進行讀取 整合 對齊 比對處理 用軟件 中的 模型計算種內(nèi)與種間遺傳距離 并用鄰接法 法 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 用軟件 進行遺傳多樣性的分析 用軟件 構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)圖 結(jié) 果顯示 個樣本中的 個為 型煙粉虱 個為溫室白粉虱 表明目前 型煙粉虱已經(jīng)傳入寧夏銀川市 石嘴山市 中衛(wèi)市等 亟需對其危害和擴散進行有效控制 關(guān)鍵詞 煙粉虱 溫室白粉虱 生物型 基因 分子鑒定 中圖分類號 文獻標志碼 文章編號 近年來 寧夏蔬菜種植面積達 萬 占全區(qū)作物種植面積的 產(chǎn)值占種植業(yè)總 產(chǎn)值的 蔬菜產(chǎn)業(yè)已成為寧夏的優(yōu)勢特色 產(chǎn)業(yè) 是區(qū)域農(nóng)業(yè)經(jīng)濟發(fā)展的重要支柱 在寧 夏蔬菜生產(chǎn)中番茄和黃瓜的種植面積較大 其中 番茄栽培以保護地栽培為主 可周年生產(chǎn) 目前 粉虱危害已成為阻礙番茄可持續(xù)安全生產(chǎn)的重要 生物災(zāi)害之一 煙粉虱 和溫 室白粉虱 是中國北 方地區(qū)最常見的兩種粉虱 均為番茄的重要害蟲 且在寧夏都有發(fā)生報道 隨著種植面積的增 加 品種的更替 目前寧夏粉虱害蟲的種類及煙粉 虱的生物型是否變化 亟需研究確定 進而為該類 害蟲的綠色防控提供科學依據(jù) 鑒于粉虱類害蟲體型微小 形態(tài)相似 極易隨 蔬菜 花卉 水果及其種苗的貿(mào)易活動遠距離傳 播 且難 以 快 速 準 確 識 別 本研究基于線粒體 基因?qū)幭母鞯販厥覂?nèi)粉虱類害蟲以及煙 粉虱生物型進行分子鑒定 以期對粉虱類害蟲的 快速識別 監(jiān)測 防止入侵等提供依據(jù) 材料與方法 供試蟲源 年 月在寧夏銀川 永寧 賀蘭山 石嘴山 吳忠 中衛(wèi) 中寧 固原等地種植的番茄 黃瓜和豆角等寄主上采集到 個粉虱種群的 個樣品 采集點分布如圖 所示 將采集的粉虱 置于盛有無水乙醇的 離心管中 保存 備用 粉虱樣品的具體采集信息如表 所 示 基因組 提取 取單頭粉虱成蟲于 的離心管中 用 適量的 浸泡 次 每次 用通用型柱式基因組提取試劑盒 康為世 紀 進行總 的提取 用 分 光光度計檢測粉虱基因組 質(zhì) 量 濃 度 以 值確定其是否被污染 提取的 保存 備用 圖 寧夏粉虱采集地分布圖 擴增及電泳檢測 粉虱種類的鑒定 以 個粉虱樣品基因組為 模板 利用通用型引物 和 進行 擴增 目標片段長度約為 反應(yīng)體系為 其中 全式金 上下游引物 各 模板 左右 加 至 擴增程序為 預(yù) 變 性 次 循 環(huán) 最 后 延 伸 煙粉虱生物型的鑒定 以其中的 個煙粉虱 基因組為模板 利用通用型引物 和 進行 擴增 目標片段長度約為 反應(yīng)體系同上 擴增程序為 預(yù)變性 次循環(huán) 最后 延伸 引物均由上海 生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成 擴增產(chǎn)物 于 保存 備用 擴增結(jié)束后 取擴增產(chǎn)物 用 的瓊脂糖凝膠進行電泳 選取與目標片段長 度一致的單一片段 產(chǎn)物送北京華大基因生 物技術(shù)有限公司測序 每個種群粉虱檢測 頭 共計 條序列 序列分析 用 軟件對公司返回的序列進行 分析 根據(jù)序列峰圖分別刪除兩端引物序列以及 不穩(wěn)定和不準確序列 以確保序列的高質(zhì)量 登陸 查閱并下載相關(guān)粉虱 基因片段序列 用軟件 對所測結(jié)果與 相關(guān)引用序列進行比對分析 利用軟件中的 模型計 算種內(nèi)與種間遺傳距離 以獲得的寧夏地區(qū) 條 基因序列和巴西 煙粉虱 西班牙 煙粉 虱 塞 爾 維 亞 溫 室 白 粉 虱 登 錄 號 分 別 為 和 個地區(qū)粉 虱 基因序列為靶標 黑刺粉虱 基因序列 為外 群 用軟件 中鄰接法 法 構(gòu)建系 統(tǒng)發(fā)育樹 以獲得的 條 型煙粉虱 基因 序列和在 下載的相關(guān)序列 序列命名 登錄 號 采集地 生物型 有的無 為靶標 同樣以黑 刺粉 虱 基 因 序 列 為 外 群 構(gòu) 建 系 統(tǒng) 發(fā) 育 樹 系統(tǒng)發(fā)育樹分支的置信度采用自展法 重復(fù)檢測 次 用 軟件分析群體間的核苷酸多樣性 核酸平均差異度 單倍型多樣性 及 其相應(yīng)標準偏差 在 中構(gòu)建單倍 型網(wǎng)絡(luò)圖 結(jié)果與分析 單頭粉虱基因組質(zhì)量濃度 分光光度計檢測結(jié)果顯示 所提取的單頭供 試粉虱基因組 為 所有基因組 質(zhì)量濃度均大于 滿足試驗需要 擴增 序列測定以及同源性分析 擴增共計獲得 條序列 分別約 和 電泳檢測結(jié)果見圖 經(jīng)測序比對 并提交到 獲得基因序列登錄號 表 條 基因序列與數(shù)據(jù)庫中已知的靶標種相 對應(yīng)的 基因片段的同源性均為 表明所獲得的 基因序列準確可靠 所有煙粉虱序 列 比 對 序 列 和 與其他序列相比有 個堿 基的區(qū)別 分別是第 位的 和第 位 的 同樣所有溫室白粉虱序列相比 序列 與其他序列相比有 個堿基 的區(qū)別是第 位的 結(jié)果顯示 寧夏銀川 期 宋鮮梅等 基于 基因的寧夏煙粉虱及溫室白粉虱分子鑒定 市西夏區(qū) 中衛(wèi)市沙坡頭區(qū)和中寧縣的粉虱為 型煙粉虱 固原市原州區(qū) 吳忠市利通區(qū) 銀川市 永寧縣和賀蘭縣等地均為溫室白粉虱 而石嘴山 市大武口區(qū)既有 型煙粉虱又有溫室白粉虱 所測 型煙粉虱與 已知 型煙粉虱 基因序列對齊處理 比對長度為 得 知寧夏 型煙粉虱 序列完全一致 序列中堿 基 的數(shù)量分別為 和 的含量為 型煙粉虱以及外群 黑刺粉虱 部分序列比對見圖 列 出序列以外的其他序列同 可以看出寧夏乃至中國與地中海周圍國家意大 利 摩洛哥 塞浦路斯等 型煙粉虱 序列有 個堿基之差 與地中海東部國家伊拉克 伊 朗 阿拉伯酋長國等相差 個堿基 與美洲 一些國家相差大于 個堿基 分子質(zhì)量標準 圖 引物 對 個粉虱 基因序列的擴增電泳檢測圖 型煙粉虱和溫室白粉虱的種內(nèi)與種間遺 傳距離 基于 基因序列 用軟件 中的 模型計算種內(nèi)與種 間遺傳距離 結(jié)果顯示 型煙粉虱和溫室白粉 虱種內(nèi)遺傳距離均為 種內(nèi)平均遺傳 距離均為 種間遺傳距離為 種 間遺傳距離為種內(nèi)遺傳距離的 倍 型煙粉虱和溫室白粉虱的系統(tǒng)發(fā)育樹分析 用于粉虱種類鑒定的 條 基因序列和 上已知且具代表性的 條 基因序列所 構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖 聚類分析結(jié)果表明 煙粉虱和溫室白粉虱明顯形成獨立的進化分支 由所測 條 型煙粉虱 基因序列和在 下載的相關(guān)序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹 圖 可以 看出 煙粉虱 基因序列首先與黑刺粉虱 基因序列分開 被測樣本序列與 等 條 已知 型煙粉虱序列聚為一支 相 似 度 為 和 聚 為 一 支 相 似 度 為 和 聚為一支 相似度為 和 聚為 一支 相 似 度 為 等 聚 為 一 支 相 似 度 為 被測樣序列與 所在 這一 支 序 列 相 似 度 為 與 所在這一支序列相似度為 與 所在這 一支序列相似度為 與 所在這一支序列相似度為 西 北 農(nóng) 業(yè) 學 報 卷 圖 型煙粉虱 序列比對 期 宋鮮梅等 基于 基因的寧夏煙粉虱及溫室白粉虱分子鑒定 書書書 表 用 于 序 列 分 析 的 粉 虱 的 具 體 采 集 信 息 以 及 登 錄 號 編 號 采 集 地 寄 主 植 物 采 集 日 期 采 集 人 測 序 樣 本 數(shù) 序 列 登 錄 號 銀 川 市 西 夏 區(qū) 軍 馬 場 番 茄 宋 鮮 梅 固 原 市 三 營 鎮(zhèn) 利 民 村 番 茄 宋 鮮 梅 中 衛(wèi) 市 陽 光 怡 然 生 態(tài) 園 番 茄 宋 鮮 梅 中 衛(wèi) 市 東 園 鎮(zhèn) 史 湖 村 黃 瓜 宋 鮮 梅 中 衛(wèi) 市 東 園 鎮(zhèn) 宋 家 莊 番 茄 宋 鮮 梅 中 衛(wèi) 市 柔 遠 鎮(zhèn) 章 家 閘 番 茄 宋 鮮 梅 中 衛(wèi) 市 柔 遠 鎮(zhèn) 柔 遠 村 番 茄 宋 鮮 梅 中 衛(wèi) 市 中 寧 縣 莫 嘴 村 番 茄 宋 鮮 梅 吳 忠 市 利 通 區(qū) 龍 二 村 番 茄 宋 鮮 梅 永 寧 縣 永 清 村 豆 角 宋 鮮 梅 永 寧 縣 北 全 村 番 茄 宋 鮮 梅 賀 蘭 山 縣 產(chǎn) 業(yè) 園 區(qū) 番 茄 宋 鮮 梅 賀 蘭 山 縣 新 平 村 番 茄 宋 鮮 梅 石 嘴 山 市 大 武 口 區(qū) 簡 泉 村 番 茄 宋 鮮 梅 西 北 農(nóng) 業(yè) 學 報 卷 圖 鄰接法構(gòu)建的粉虱基于 基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹 遺傳多樣性和單倍型網(wǎng)絡(luò)圖分析 分析的 條序列共定義 個單倍型 表 分別命名為 單倍型的多樣 性為 單倍型 共享個體數(shù)最多 占 總個體數(shù)的 被 個及 個以上種群共享 的單倍型有 和 總?cè)后w的 為 為 和 的 標準差分別為 和 中性檢驗結(jié)果 顯示 總種群的 可推斷 型煙粉虱近段歷 史時期發(fā)生過種群擴張 用 構(gòu)建 單倍型網(wǎng)絡(luò)圖 圖 在所有樣本中較高頻率單 倍型位于圖的左上 其余獨立的單倍型則通過短 支與這幾種高頻率的單倍型相連 從地中海地區(qū) 逐漸到地中海東部 圖右上 亞洲一些國家 圖左 下 或美洲國家 圖右下 呈現(xiàn)從高向低頻率擴散 出現(xiàn)明顯的進化分支 結(jié)果與系統(tǒng)發(fā)育樹相吻合 說 明 型煙粉虱存在種群變異 期 宋鮮梅等 基于 基因的寧夏煙粉虱及溫室白粉虱分子鑒定 圖 鄰接法構(gòu)建的 型煙粉虱基于 基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹 表 型煙粉虱單倍型間的共享情況 單倍型 樣本數(shù)目 樣本編號 西 北 農(nóng) 業(yè) 學 報 卷 圖 型煙粉虱 基因單倍型網(wǎng)絡(luò)中介圖 討 論 本研究以寧夏 個不同地區(qū)種群的粉虱為 試驗材料 采用通用引物 和 擴增 基因序列 分子 鑒定結(jié)果表明 在寧夏銀川市西夏區(qū) 中衛(wèi)市沙坡 頭區(qū) 中寧縣 石嘴山市大武口區(qū)均有 型煙粉 虱的分布 在銀川市永寧縣和賀蘭縣 石嘴山市大 武口區(qū) 固原市原州區(qū) 吳忠市利通區(qū) 有溫室白 粉虱的分布 以上地區(qū)是寧夏蔬菜產(chǎn)業(yè)較發(fā)達的 區(qū)域 除中國北方普遍發(fā)生的溫室白粉虱外 本 研究明確了 型煙粉虱在寧夏的分布情況 而近 年來寧夏番茄種植區(qū)不斷加重的番茄黃化曲葉病 毒 病也從側(cè)面印證了 型煙粉虱的存 在 寧夏的 個地市中 固原市因海拔較高 氣候 冷涼 夏季溫度較低 屬冷涼蔬菜種植區(qū) 該區(qū)域 只有溫室白粉虱分布 尚未發(fā)現(xiàn) 型煙粉虱 究 其原因可能與 型煙粉虱起源于熱帶地區(qū) 冷涼 地區(qū)不適宜生存 寧夏的其他 個地市 夏季干 燥且溫度較高 蔬菜種植面積大 露地與保護地栽 培方式并存 且大量種植的茄果類和瓜菜類蔬菜 為煙粉虱提供了良好的寄主環(huán)境 利于煙粉虱的 生存繁殖 序列比對分析結(jié)果表明 寧夏不同地區(qū)的溫 室白粉虱和 型煙粉虱種內(nèi)遺傳分化現(xiàn)象不明 顯 未形成明顯的地理種群 通過系統(tǒng)發(fā)育樹和 單倍型網(wǎng)絡(luò)圖可以看出 寧夏乃至中國與地中海 周圍的摩洛哥 突尼斯 埃及 西班牙 希臘 意大 利亞等國和非地中海地區(qū)的日本 越南 韓國 加 拿大 危地馬拉等國的 型煙粉虱聚為一支或共 享一個單倍型 寧夏 型煙粉虱所在這一支很有 可能是地中海的本土種群 與地中海東部的以色 列 塞浦路斯 土耳其 敘利亞共和國等國的 型 煙粉虱相似度高達 與伊拉克 伊朗 阿拉伯聯(lián)合酋長國 巴基斯坦相似度達 而與美洲國家的相似度低 本研 究結(jié)果與滕希 關(guān)于 型煙粉虱在中國的發(fā)生 現(xiàn)狀及其基于 序列的系統(tǒng)發(fā)育分析 一 文中論述的中國 型煙粉虱的來源相一致 馬紹國等 報道在寧夏石嘴山市惠農(nóng)區(qū)發(fā)現(xiàn) 型煙粉虱 而本研究中在相同地區(qū)采集的煙粉 虱為 型煙粉虱 未檢測到 型煙粉虱 且最近 期 宋鮮梅等 基于 基因的寧夏煙粉虱及溫室白粉虱分子鑒定 研究 已表明中國農(nóng)區(qū)煙粉虱優(yōu)勢生物型已經(jīng) 由 型轉(zhuǎn)為 型 這可能與兩種不同生物型煙粉 虱的競爭替代有關(guān) 很多研究表明 型煙粉虱 比 型煙粉虱有更強的生存優(yōu)勢 如 型煙粉虱 發(fā)育歷期比 型煙粉虱短 在低溫和高溫的條件 下都表現(xiàn)出更強的生存能力 而且 型粉虱擁有 更強 更廣泛 更穩(wěn)定的抗性 二者混合發(fā)生 時 經(jīng)過一定的時間 型煙粉虱會逐漸成為優(yōu)勢 生物型 結(jié) 論 本研究表明 寧夏銀川市西夏區(qū) 中衛(wèi)市沙坡 頭區(qū)和中寧縣的粉虱為 型煙粉虱 固原市原州 區(qū) 吳忠市利通區(qū) 銀川市永寧縣和賀蘭縣等地均 為溫室白粉虱 而石嘴山市大武口區(qū)既有 型煙 粉虱又有溫室白粉虱 同時發(fā)現(xiàn)寧夏 型煙粉 虱應(yīng)源于地中海本土種群 本研究結(jié)果可對不同 地區(qū)粉虱的針對性防控提供依據(jù) 參考文獻 黃亞玲 李曉瑞 溫淑萍 等 寧夏蔬菜產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)效率的實證 分析 寧夏農(nóng)林科技 張友軍 朱國仁 褚 棟 等 我國蔬菜作物重大入侵害蟲發(fā) 生 危害與控制 植物保護 馬紹國 哈金華 朱建祥 等 寧夏地區(qū)煙粉虱生活習性及發(fā) 生規(guī)律研究 寧夏農(nóng)林科技 顧沛雯 覃 強 王 萍 等 寧夏設(shè)施園藝病蟲害發(fā)生特 點 發(fā)展趨勢及綠色防治技術(shù) 農(nóng)業(yè)科學研究 滕 希 型煙粉風在屮國的發(fā)生現(xiàn)狀及其基于 序 列的系統(tǒng)發(fā)育分析 北京 中國農(nóng)業(yè)科學院 褚 棟 張友軍 近 年我國煙粉虱發(fā)生為害及防治研究 進展 植物保護 劉 晨 張偉兵 洪 波 等 陜西菜田 種粉虱數(shù)量結(jié)構(gòu) 及煙粉虱生物型鑒定 西北農(nóng)業(yè)學報 西 北 農(nóng) 業(yè) 學 報 卷 責任編輯 郭柏壽 期 宋鮮梅等 基于 基因的寧夏煙粉虱及溫室白粉虱分子鑒定