浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)Acta Agriculturae Zhejiangensis 2020 32 5 831 839 http www zjnyxb cn 馮江鵬 邱莉萍 梁秀燕 等 草莓膠孢炭疽菌拮抗細(xì)菌貝萊斯芽孢桿菌JK3的鑒定及其抗菌活性 J 浙江農(nóng)業(yè)學(xué) 報(bào) 2020 32 5 831 839 DOI 10 3969 j issn 1004 1524 2020 05 11 收稿日期 2019 12 10 基金項(xiàng)目 浙江省自然科學(xué)基金青年基金 LQ18D050001 臺(tái)州市科技計(jì)劃 1701ny06 浙江省大學(xué)生科技創(chuàng)新活動(dòng)計(jì)劃暨新苗人才 計(jì)劃 2019R436011 2018年臺(tái)州市211人才工程 第三層次擇優(yōu) 臺(tái)州學(xué)院校培育基金 2017PY027 作者簡(jiǎn)介 馮江鵬 1996 男 甘肅酒泉人 本科生 專業(yè)為生物科學(xué) E mail 320834878 qq com 通信作者 鐘永軍 E mail yjzhong tzc edu cn 草莓膠孢炭疽菌拮抗細(xì)菌貝萊斯芽孢桿菌JK3的鑒定及其 抗菌活性 馮江鵬1 2 邱莉萍3 梁秀燕1 2 陳碧秀1 2 夏海洋1 彭春龍2 鐘永軍1 2 1 臺(tái)州學(xué)院生物制藥研究所 浙江臺(tái)州318000 2 臺(tái)州學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 浙江臺(tái)州318000 3 臺(tái)州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院生物技術(shù) 研究所 浙江臨海317000 摘 要 利用平板對(duì)峙法從堆肥中分離篩選到1株對(duì)草莓膠孢炭疽菌具有較強(qiáng)拮抗作用的細(xì)菌株系JK3 通 過(guò)生理生化特征 16S rDNA和rpoB序列分析 將JK3菌株鑒定為貝萊斯芽孢桿菌 利用離體草莓葉片測(cè)定 了JK3發(fā)酵上清液對(duì)草莓炭疽病的防治效果 結(jié)果顯示 JK3發(fā)酵上清液對(duì)草莓膠孢炭疽菌引起的草莓炭疽 病有明顯預(yù)防效果 但治療作用較差 提前24 h或接種膠孢炭疽菌孢子的同時(shí)噴施JK3發(fā)酵上清液 防治效果 超過(guò)95 接種膠孢炭疽菌孢子后24 h噴施發(fā)酵上清液 防治效果為11 5 對(duì)JK3發(fā)酵上清液進(jìn)行不同的 溫度 pH和蛋白酶處理 結(jié)果顯示 發(fā)酵上清中的抑菌物質(zhì)對(duì)pH和蛋白酶處理不敏感 但高溫可降低其抑菌活 性 推測(cè)主要抗菌活性成分不是蛋白質(zhì) 由于芽孢桿菌多產(chǎn)生脂肽類抗菌物質(zhì) 利用相關(guān)合成基因檢測(cè)引物進(jìn) 行PCR擴(kuò)增并測(cè)序 結(jié)果顯示 JK3菌株含有脂肽類抗菌物質(zhì)生物合成相關(guān)基因srfAA bymB fenD bacA和ituC 以上結(jié)果表明 貝萊斯芽孢桿菌JK3有開(kāi)發(fā)為防治膠孢炭疽菌引起的草莓炭疽病的生防制劑潛力 關(guān)鍵詞 草莓炭疽病 膠孢炭疽菌 貝萊斯芽孢桿菌 生物防治 拮抗活性 中圖分類號(hào) S476 1文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A文章編號(hào) 1004 1524 2020 05 0831 09 Identification of antagonistic bacteria Bacillus velezensis JK3 against anthracnose of straw berry and its antipathogenic activity FENG Jiangpeng1 2 QIU Liping3 LIANG Xiuyan1 2 CHEN Bixiu1 2 XIA Haiyang1 PENG Chunlong2 ZHONG Yongjun1 2 1 Institute of Biopharmaceuticals Taizhou University Taizhou 318000 China 2 School of Life Sciences Taizhou University Taizhou 318000 China 3 Biotech Research Institute Taizhou Academy of Agriculture Sciences Linhai 317000 China Abstract A bacterial isolate JK3 which was isolated from compost showed stronger antagonistic activity against Colletotrichum gloeosporioides causing strawberry anthracnose in dual culture assay The isolate JK3 was identified as Bacillus velezensis by physiological and biochemical characterization 16S rDNA and rpoB gene sequence analysis The inhibitory effects of JK3 fermented liquid on C gloeosporioides were evaluated with the detached strawberry leav es JK3 fermented liquid showed significant protection on strawberry anthracnose but poor therapeutic effect More than 95 control efficiency was achieved by spraying JK3 fermented liquid 24 h before inoculation with the spore suspension of C gloeosporioides or simultaneous inoculation Only 11 5 control efficiency was resulted by spraying JK3 fermented liquid 24 h after inoculation with the pathogen The antagonistic activity of the fermented liquid was stable to different pH values and proteases but sensitive to high temperature Thus implied that active component was not related to proteins It has been reported that most isolates of Bacillus spp produce active lipopeptides The existences of lipopeptide biosynthetic genes in JK3 were examined by PCR amplification with proper primer pairs and DNA sequencing Results showed that the JK3 contained srfAA bymB fenD bacA and ituC genes The above data indicated that B velezensis JK3 had a potential to be developed as biocontrol agent for controlling strawberry anthrac nose caused by C gloeosporioides Key words strawberry anthracnose Colletotrichum gloeosporioides Bacillus velezensis biocontrol antagonistic activity 草莓是重要的經(jīng)濟(jì)作物 在地方特色經(jīng)濟(jì)中 占有重要的地位 草莓炭疽病是威脅草莓產(chǎn)業(yè) 健康發(fā)展的主要病害之一 嚴(yán)重影響草莓的產(chǎn)量 和品質(zhì) 給我國(guó)的草莓產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損 失 1 2 草莓炭疽病菌是典型的高溫高濕型病 菌 28 32 和90 以上的相對(duì)濕度是草莓炭 疽病菌侵染的最適條件 3 草莓栽培多以溫室 大棚為主 草莓棚內(nèi)易形成高溫高濕的環(huán)境 利 于草莓炭疽病發(fā)生 研究表明 草莓炭疽病的病 原菌為炭疽菌屬的多種真菌 有膠孢炭疽菌 Col letotrichum gloeosporioides 尖孢炭疽菌 Colleto trichum acutatum 草莓炭疽菌 Colletotrichum fragariae 等 4 不同地域的草莓炭疽病病菌的 優(yōu)勢(shì)種不同 浙江省草莓炭疽病的優(yōu)勢(shì)病原菌為 膠孢炭疽菌 5 目前 草莓炭疽病的防治主要依賴于化學(xué)藥 劑 但化學(xué)藥劑的大量使用所帶來(lái)的藥物殘留問(wèn) 題 環(huán)境問(wèn)題等 不利于我國(guó)農(nóng)業(yè)綠色可持續(xù)發(fā) 展 6 7 近年來(lái) 生物防治因其綠色 安全等特 點(diǎn) 越來(lái)越為人們所關(guān)注 其中 芽孢桿菌是應(yīng) 用最為廣泛的生防菌 具有抗逆性強(qiáng) 生物安全 性好等突出優(yōu)點(diǎn) 隨著生物防治措施的應(yīng)用和 推廣 篩選拮抗芽孢桿菌來(lái)防治草莓炭疽病也成 為研究熱點(diǎn) 吉沐祥等 8 測(cè)定了枯草芽孢桿菌 和蛇床子素對(duì)草莓炭疽病病菌的室內(nèi)抑菌活性 并結(jié)合田間試驗(yàn)的結(jié)果 證實(shí)枯草芽孢桿菌可用 于草莓炭疽病的防治 Nam等 9 從草莓葉片上 分離到1株貝萊斯芽孢桿菌 Bacillus velezensis NSB 1 發(fā)現(xiàn)其對(duì)草莓炭疽病具有潛在的防治效 果 王美林等 10 研究發(fā)現(xiàn) 1 000億 g 1枯草芽 孢桿菌對(duì)草莓炭疽病的防治效力與25 多菌靈 可濕性粉劑或450 g L 1咪鮮胺水乳劑的防治效 力相當(dāng) 陳哲等 6 研究復(fù)合菌劑對(duì)草莓炭疽菌 的防治效果時(shí)發(fā)現(xiàn) 復(fù)合菌處理對(duì)于草莓炭疽病 的防治效果為68 69 比化學(xué)藥劑的防治效果 提高了23 63 谷春艷等 11 研究發(fā)現(xiàn) 解淀粉 芽孢桿菌WH1G對(duì)草莓炭疽病菌具有較強(qiáng)的抑 制作用 當(dāng)含菌量為1 0 1010 mL 1時(shí) 抑制率達(dá) 89 將咪鮮胺 0 045 3 mg L 1 與解淀粉芽孢 桿菌WH1G 2 3 106 mL 1 按5 5配比使用時(shí) 對(duì)病菌抑制的增效作用和防治效果最好 防效 達(dá)69 94 本研究從堆肥中分離對(duì)草莓膠孢炭疽菌具 有顯著拮抗作用的菌株 通過(guò)生理生化試驗(yàn)和分 子技術(shù)對(duì)其進(jìn)行鑒定 對(duì)其抗菌活性進(jìn)行了初步 研究 該研究為發(fā)掘膠孢炭疽菌引起的草莓炭疽 病的生物防治菌株資源奠定了基礎(chǔ) 1 材料與方法 1 1 供試菌株與培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基 蛋白胨10 0 g L 1 酵母粉5 0 g L 1 NaCl 10 0 g L 1 瓊脂15 0 g L 1 僅固體培 養(yǎng)基 ddH2O 1 000 mL pH 7 2 7 4 PDA培養(yǎng) 基 馬鈴薯浸粉5 0 g L 1 葡萄糖20 0 g L 1 瓊 脂14 0 g L 1 ddH2O 1 000 mL pH 7 0 7 4 供試的膠孢炭疽菌 C gloeosporioides 由臺(tái) 州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供 1 2 試驗(yàn)方法 1 2 1 芽孢桿菌的分離 稱取2 0 g土壤或堆肥樣品放入100 mL錐 形瓶中 加入20 mL 0 9 NaCl溶液 搖勻后80 水浴20 min 取上清液 以10倍稀釋制備5個(gè) 稀釋梯度 吸取10 3 10 5稀釋梯度的稀釋液 238 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào) 第32卷 第5期 200 L涂布LB固體培養(yǎng)基 倒置于30 恒溫箱 中培養(yǎng)24 48 h 從LB平板上挑取形態(tài)不同的 單菌落 反復(fù)劃線分離純化3次 挑取純化的菌 落于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h 加入甘油并將菌液 保藏于 20 冰箱 1 2 2 拮抗芽孢桿菌篩選 采用平板對(duì)峙法篩選拮抗芽孢桿菌 12 13 具體如下 取一塊長(zhǎng)滿膠孢炭疽菌菌絲的PDA平 板 用6 mm打孔器制備菌餅 將菌餅轉(zhuǎn)接于PDA 平板或LB平板的中央 置于30 恒溫培養(yǎng)箱培 養(yǎng)1 d 利用十字交叉 在距離菌餅3 cm處的上 下同時(shí)接種待測(cè)芽孢桿菌發(fā)酵上清液1 5 L 在 距離菌餅3 cm處的左右同時(shí)接種1 5 L LB液 體培養(yǎng)基作為對(duì)照 置于30 恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng) 隔天觀察 用游標(biāo)卡尺測(cè)量草莓膠孢炭疽菌的生 長(zhǎng) 并計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率 菌絲生長(zhǎng)抑制率 dc dt dc 100 其中 dc為對(duì)照組 菌絲直徑 dt為芽孢桿菌處理組菌絲直徑 1 2 3 抑菌試驗(yàn) 制備發(fā)酵液 將待測(cè)芽孢桿菌接種于LB液 體培養(yǎng)基 30 150 r min 1搖床培養(yǎng)3 d 將菌 液分裝于50 mL離心管中 12 000 g離心20 min 收集上清液并過(guò)0 22 m無(wú)菌過(guò)濾器 4 保藏待用 無(wú)菌發(fā)酵上清液的抑制試驗(yàn)參考張紊瑋 等 13 的方法 具體如下 將JK3菌株的無(wú)菌發(fā)酵 上清液按10 的比例混入50 LB固體培養(yǎng)基 并倒平板 以混入10 比例的LB液體培養(yǎng)基作 為對(duì)照 在LB平板中央接種草莓膠孢炭疽菌菌 餅 直徑6 mm 設(shè)置3個(gè)平行 置于30 恒溫 培養(yǎng)箱培養(yǎng) 待對(duì)照組的草莓膠孢炭疽菌菌絲覆 蓋平板3 4面積時(shí) 用游標(biāo)卡尺記錄各個(gè)LB平 板上的菌絲直徑 并計(jì)算無(wú)菌發(fā)酵上清對(duì)菌絲生 長(zhǎng)的抑制率 菌絲生長(zhǎng)抑制率 100 dc dt dc 6 其中 dc為對(duì)照組菌絲直徑 dt為芽孢桿菌處理組菌絲直徑 1 2 4 形態(tài)學(xué)與生理生化試驗(yàn)測(cè)定 按照 常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè) 14 和 伯杰 氏細(xì)菌鑒定手冊(cè) 15 的方法對(duì)拮抗菌的形態(tài)和 生理生化特征進(jìn)行鑒定 1 2 5 PCR擴(kuò)增與序列測(cè)定 抽取待測(cè)菌株的基因組 用引物27F 5 AGAGTTT GATCCTGGCTCAG 3 和1492R 5 GGTTACCTTGTTACGACTT 3 進(jìn)行PCR擴(kuò)增其 16S rDNA序列 16 用引物rpoB f 5 AGGT CAACTAGTTCAGTATGGAC 3 和rpoB r 5 AA GAACCGTAACCGGCAACTT 3 進(jìn)行PCR擴(kuò)增 rpoB基因保守序列 17 用引物srfAF 5 TCGG GACAGGAAGACATCAT 3 和srfAR 5 CCACT CAAACGGATAATCCTGA 3 進(jìn)行PCR擴(kuò)增srfAA 基因序列 18 用引物bmyBF 5 GAATCCCGTT GTTCTCCAAA 3 和bmyBR 5 GCGGGTATT GAATGCTTGTT 3 進(jìn)行PCR擴(kuò)增bymB基因序 列 18 用引物bacAF 5 CAGCTCATGGGAAT GCTTTT 3 和bacAR 5 CTCGGTCCTGAAGGGA CAAG 3 進(jìn)行PCR擴(kuò)增bacA基因序列 18 用引 物fenDF 5 GGCCCGTTCTCTAAATCCAT 3 和 fenDR 5 GTCATGCTGACGAGAGCAAA 3 進(jìn)行 PCR擴(kuò)增fenD基因序列 18 用引物ituCF 5 GGCTGCTGCAGATGCTTTAT 3 和ituCR 5 TCGCAGATAATCGCAGTGAG 3 進(jìn)行PCR擴(kuò)增 ituC基因序列 18 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1 瓊脂糖 凝膠電泳檢測(cè)后 將目的條帶所在膠塊切割并送 至生物工程 上海 有限公司進(jìn)行測(cè)序 利用 NCBI網(wǎng)站的BLAST功能對(duì)所測(cè)的16S rDNA和 rpoB序列進(jìn)行同源性分析 確定親緣關(guān)系 最后 使用MEGA 6 0軟件 19 的Neighbor Joining法 20 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) 1 2 6 抑菌活性物質(zhì)的穩(wěn)定性分析 JK3發(fā)酵上清液抑菌活性物質(zhì)的穩(wěn)定性試驗(yàn)參 考孫平平等 21 和張紊瑋等 13 的方法 具體如下 溫度穩(wěn)定性 將JK3菌株的無(wú)菌發(fā)酵上清分 別置于25 40 50 60 70 80 90和100 處理30 min 按5 的比例將不同溫度處理的無(wú)菌發(fā)酵上 清混入PDA固體培養(yǎng)基并倒平板 以混入5 比 例的LB培養(yǎng)基作為對(duì)照 向PDA平板接種膠孢 炭疽菌菌餅 置于30 恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng) 待對(duì)照 組的草莓膠孢炭疽菌菌絲覆蓋平板3 4面積時(shí) 用游標(biāo)卡尺記錄各個(gè)PDA平板上的菌絲直徑 并 計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率 菌絲生長(zhǎng)抑制率 100 dc dt dc 6 其中dc為對(duì)照組菌絲 直徑 dt為芽孢桿菌處理組菌絲直徑 pH穩(wěn)定性 用1 mol L 1的NaOH或HCl 將 10倍稀釋的JK3無(wú)菌發(fā)酵上清的pH分別調(diào)為 338 馮江鵬 等 草莓膠孢炭疽菌拮抗細(xì)菌貝萊斯芽孢桿菌JK3的鑒定及其抗菌活性 2 3 4 5 6 7 8 9 10和11 靜置3 h后調(diào)回原上 清液pH 7 5備用 用上述方法測(cè)定不同酸堿度 對(duì)其抑菌活性的影響 蛋白酶處理穩(wěn)定性 將胰蛋白酶 胃蛋白酶 和蛋白酶K加入JK3無(wú)菌發(fā)酵上清液 控制體系 中的蛋白酶濃度為20 U mL 1 置于37 水浴處 理1 h 再用前述方法測(cè)定不同蛋白酶處理對(duì)其 抑菌活性的影響 1 2 7 離體草莓葉片防治試驗(yàn) 草莓葉片準(zhǔn)備 植物材料為炭疽易感品種紅 頰 定植于溫室大棚 剪取離芯第2或第3片生 長(zhǎng)健康 大小相近的復(fù)葉 置于保鮮袋帶回 立即 使用 用75 乙醇棉球輕輕擦拭葉片 保留葉柄 2 3 cm 放置2片滅菌濕濾紙于直徑20 cm培 養(yǎng)皿中 加入1 瓊脂塊 并將草莓葉柄插入瓊脂 塊中培養(yǎng) 膠孢炭疽菌孢子準(zhǔn)備和接種 將活化培養(yǎng)后 的膠孢炭疽菌接于液體培養(yǎng)基PDB中 28 搖 床培養(yǎng)2 d 用3層滅菌紗布過(guò)濾后收集分生孢 子 通過(guò)血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后用無(wú)菌水將其稀釋至 105 mL 1 以無(wú)菌水為對(duì)照 均勻噴至草莓葉片 每個(gè)處理組設(shè)置14份草莓葉片 將JK3菌株的無(wú)菌發(fā)酵上清原液噴至草莓 葉片表面 發(fā)酵上清原液噴施時(shí)間分別為膠孢炭 疽菌孢子接種前24 h 同時(shí) 0 h 和接種后24 h 以噴施LB液體培養(yǎng)基作為對(duì)照 草莓葉片置于 25 光照培養(yǎng)箱培養(yǎng) 8 h 12h L D 濕度 85 7 d后觀察記錄 草莓葉片病變面積比例 病變面積 葉片總面積 100 草莓葉片 病變面積防治率 100 a b a 其中 a 為對(duì)照組草莓葉片病變面積比例 b為發(fā)酵上清 液處理組草莓葉片病變面積比例 2 結(jié)果與分析 2 1 膠孢炭疽菌拮抗芽孢桿菌JK3的分離與活 性測(cè)定 從堆肥等樣品中分離純化了204株芽孢桿 菌 利用平板對(duì)峙法分別測(cè)定分離的芽孢桿菌對(duì) 膠孢炭疽菌拮抗活性 其中12株具有明顯的拮 抗活性 JK3菌株對(duì)膠孢炭疽菌的拮抗活性最強(qiáng) 圖 1 A 固體平板上的菌絲生長(zhǎng)抑制率為37 12 A為平板對(duì)峙法檢測(cè)JK3菌株對(duì)膠孢炭疽菌的抑制活性 B和C為JK3菌株無(wú)菌發(fā)酵上清液的抑制活性 其中B為固體平板上的抑制 效果 C為抑制率統(tǒng)計(jì)結(jié)果 CK 空白對(duì)照組 0 1 V 發(fā)酵上清液終濃度稀釋1 000倍 1 V 發(fā)酵上清液終濃度稀釋100倍 10 V 發(fā)酵上清液終濃度稀釋10倍 A was antagonistic activity of the isolate JK3 against C gloeosporioides by the plate confrontation method B was antagonistic activity of JK3 sterile fermented liquid and C was statistical results of inhibition rate of B CK Blank 0 1 V 1 000 fold dilution of final concentration of fermen ted liquid 1 V 100 fold dilution of final concentration of fermented liquid 10 V 10 fold dilution of final concentration of fermented liquid 圖1 JK3菌株對(duì)草莓膠孢炭疽菌的抑制活性 Fig 1 Antagonistic activity of the isolate JK3 against C gloeosporioides 438 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào) 第32卷 第5期 JK3菌株的發(fā)酵上清液對(duì)膠孢炭疽菌具有較強(qiáng)的 抑制活性 圖1 B 原液 相當(dāng)于終濃度稀釋10 倍 處理組的膠孢炭疽菌幾乎不生長(zhǎng) 菌絲生長(zhǎng) 抑制率達(dá)93 93 終濃度稀釋100倍處理組 菌 絲生長(zhǎng)抑制率達(dá)到44 01 圖1 C 2 2 JK3菌株分子鑒定和生理生化特性 用引物27F 1492R通過(guò)PCR擴(kuò)增JK3菌株 的16S rDNA并送測(cè)序 測(cè)序結(jié)果上傳GenBank 登錄號(hào)MN860072 并且在NCBI利用BLAST 比對(duì)分析 結(jié)果顯示 JK3菌株與Bacillus velezen sis XP 27 Bacillus methylotrophicus HB24和Bacil lus methylotrophicus SY33序列最相近 同源性達(dá) 到100 用引物rpoB f rpoB r擴(kuò)增JK3菌株的 rpoB基因保守序列并測(cè)序 測(cè)序結(jié)果上傳Gen Bank 登錄號(hào)MN746370 用16S rDNA和rpoB 基因序列分別構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù) 結(jié)果顯示 JK3菌 株的16S rDNA和rpoB保守序列均與貝萊斯芽孢 桿菌聚為一支 圖2 根據(jù) 常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè) 和 伯杰氏細(xì) 菌鑒定手冊(cè) 按照芽孢桿菌分類要求 對(duì)JK3菌 株進(jìn)行產(chǎn)酶 碳源利用等生理生化特性分析 結(jié) 果見(jiàn)表1 JK3能利用山梨醇 D 果糖 纖維二 糖 甘油 葡萄糖 蔗糖 淀粉和乳糖 而不能利用 D 木糖 半乳糖和鼠李糖 能耐受10 NaCl 并 且過(guò)氧化氫酶試驗(yàn) 尿素酶試驗(yàn) 淀粉水解試驗(yàn) 明膠液化試驗(yàn)和V P試驗(yàn)呈陽(yáng)性 表1 主要 生理生化特性與近源的貝萊斯芽孢桿菌相似 表1 A 基于16S rDNA部分序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù) B 基于rpoB基因保守序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù) 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)采用鄰接法構(gòu)建 分支數(shù) 表示1 000次Bootstrap重抽樣分析的支持百分比 圖例0 05和0 01為遺傳距離 Phylogenetic tree constructed based on 16S rDNA partial sequence A and rpoB gene conservative sequence B The phylogenetic tree was generated using the Neighbor Joining method The number of branches indicated the percentage of support for 1 000 bootstrap resampling analy sis the legend 0 05 and 0 01 were the genetic distance 圖2 基于16S rDNA序列和rpoB基因保守序列構(gòu)建的JK3菌株與相近典型菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù) Fig 2 Phylogenetic tree constructed based on the 16S rDNA partial sequence and rpoB gene conservative sequence of the iso late JK3 and other related typical strains 538 馮江鵬 等 草莓膠孢炭疽菌拮抗細(xì)菌貝萊斯芽孢桿菌JK3的鑒定及其抗菌活性 表1 JK3菌株的生理生化試驗(yàn) Table 1 Physiological and biochemical characteristics of the isolate JK3 測(cè)定指標(biāo) Test B velezensis JK3 B velezensis FZB42 10 NaCl 革蘭氏染色Gram staining 山梨糖醇Sorbitol D 果糖D Fructose D 木糖D Xylose 纖維二糖Cellobiose 甘油Glycerol 葡萄糖Glucose 蔗糖Sucrose 淀粉Starch 半乳糖Galactose 鼠李糖Rhamnose 乳糖Lactose 吲哚試驗(yàn)Indole test V P試驗(yàn)Voges Proskauer 甲基紅試驗(yàn)Methyl red test 過(guò)氧化氫酶Catalase 淀粉水解Starch hydrolysis 脲酶Urease 檸檬酸鹽利用Citrate utilization 明膠水解Gelatin hydrolysis 陰性 陽(yáng)性 未見(jiàn)報(bào)道 Positive reaction Negative reaction No report 綜合JK3菌株的分子特性和生理生化試驗(yàn) 結(jié)果 將JK3菌株定為貝萊斯芽孢桿菌 Bacillus veleznsis 命名為貝萊斯芽孢桿菌JK3 B velezensis JK3 2 3 離體草莓葉片法測(cè)定JK3發(fā)酵上清液對(duì)草 莓炭疽病防治效果 圖3顯示 JK3發(fā)酵上清液的噴施時(shí)間對(duì)防 治效果有顯著影響 在接種膠孢炭疽菌孢子前 24 h或接種膠孢炭疽菌孢子的同時(shí)噴施JK3的 發(fā)酵上清液 防治效果明顯 分別達(dá)到95 68 和 98 99 而在膠孢炭疽菌孢子接種后24 h噴施 發(fā)酵上清液 則防治效果差 僅有11 5 因此 認(rèn)為JK3菌株發(fā)酵上清液對(duì)膠孢炭疽菌引起的 草莓炭疽病有比較好的預(yù)防作用 但治療作用 稍差 2 4 JK3菌株產(chǎn)生的主要活性物質(zhì) 為了初步探索JK3菌株產(chǎn)生的抗菌活性物 質(zhì)種類 分別測(cè)定了JK3菌株發(fā)酵上清液的熱穩(wěn) 定性 pH穩(wěn)定性 以及對(duì)蛋白酶 胃蛋白酶 胰蛋 白酶和蛋白酶K 等的穩(wěn)定性 結(jié)果 圖4 表 A 噴施JK3發(fā)酵上清后的代表性草莓葉片 B 草莓葉片病變面 積防治率 24 h表示接種膠孢炭疽菌孢子前24 h噴施JK3 發(fā)酵上清液 0 h表示與接種膠孢炭疽菌孢子同時(shí)噴施JK3發(fā) 酵上清液 24 h表示接種膠孢炭疽菌孢子后24 h噴施JK3發(fā) 酵上清液 A Representative lesions on strawberry leaves after treatment with JK3 fermented liquid B Inhibition rate of lesion area on strawberry leaves 24 h Spraying JK3 fermented liquid 24 h before inocula tion with spore suspension of C gloeosporioides 0 h Simultaneous inoculation with spraying JK3 fermented liquid 24 h Spraying JK3 fermented liquid 24 h after inoculation 圖3 離體草莓葉片試驗(yàn)檢測(cè)JK3發(fā)酵上清液對(duì)膠孢炭 疽菌的防治效果 Fig 3 Inhibitory effect of JK3 fermented liquid on C gloeosporioides on detached strawberry leaves 明 JK3菌株發(fā)酵上清液pH穩(wěn)定性好 對(duì)50 以上高溫略敏感 處理30 min抑菌活性仍然能保 留70 以上 胃蛋白酶 胰蛋白酶和蛋白酶K處 理后 發(fā)酵上清液的菌絲生長(zhǎng)抑制活性幾乎不受 影響 推測(cè)JK3產(chǎn)生的主要活性物質(zhì)可能是非蛋 白質(zhì)類的小分子物質(zhì) 也有可能產(chǎn)生類似其他芽 孢桿菌的脂肽類物質(zhì) 由于芽孢桿菌脂肽類物質(zhì)合成基因比較保 守 利用芽孢桿菌脂肽合成基因檢測(cè)引物 以JK3 基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增 結(jié)果顯示 能 擴(kuò)增出Surfactin合成相關(guān)基因srfAA Bacillomycin 638 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào) 第32卷 第5期 圖4 溫度 A pH B 和蛋白酶 C 對(duì)發(fā)酵上清抑菌活性影響 Fig 4 Effect of different temperatures A pH B and proteases C on inhibitory stability of JK3 sterile fermented liquid against C gloeosporioides 合成相關(guān)基因bymB Bacillysin合成相關(guān)基因ba cA Fengycin合成相關(guān)基因fenD iturin A合成相 關(guān)基因ituC預(yù)期大小片段 圖5 測(cè)序結(jié)果顯 示 擴(kuò)增出的DNA片段均為預(yù)期的基因片段 用NCBI中的BLAST比對(duì)分析 結(jié)果顯示 克隆 出的基因序列均與來(lái)源于貝萊斯芽孢桿菌的相 關(guān)基因高度同源 表明該菌株具有合成多種脂肽 類抗菌物質(zhì)的能力 推測(cè)這些脂肽類物質(zhì)對(duì)草莓 膠孢炭疽菌具有抑菌活性 M DNA標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量 M DNA marker 圖5 JK3菌株脂肽合成酶基因PCR凝膠電泳檢測(cè) 結(jié)果 Fig 5 Detection of lipopeptide biosynthesis genes in the isolate JK3 by PCR 3 結(jié)論與討論 芽孢桿菌分類向來(lái)略有爭(zhēng)議 2016年 Dun lap等 23 利用全基因組比較對(duì)貝萊斯芽孢桿菌 甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌 解淀粉芽孢桿菌植物亞種 的分類地位進(jìn)行研究 認(rèn)為甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿 菌 解淀粉芽孢桿菌植物亞種與貝萊斯芽孢桿菌 互為同物異名 貝萊斯芽孢桿菌屬于枯草芽孢 桿菌群 鑒于16S rDNA序列在分類上的分辨率 問(wèn)題 22 本文利用rpoB基因和16S rDNA聯(lián)合分 析 結(jié)合生理生化試驗(yàn)結(jié)果 將JK3菌株鑒定為 貝萊斯芽孢桿菌 報(bào)道顯示 貝萊斯芽孢桿菌分布廣泛 在河 水 農(nóng)作物土壤 魚類腸道 植物組織和根際 以 及野牦牛牛糞等不同生境中均有發(fā)現(xiàn) 并且報(bào)道 的貝萊斯芽孢桿菌多表現(xiàn)出促植物生長(zhǎng)和防治 植物病害的作用 22 本文從堆肥中分離到1株 對(duì)草莓膠孢炭疽菌具有顯著拮抗效果的貝萊斯 芽孢桿菌JK3 利用離體草莓葉片測(cè)試膠孢炭疽 菌引起的草莓炭疽病防治試驗(yàn) 發(fā)現(xiàn)JK3發(fā)酵上 清液對(duì)草莓膠孢炭疽菌引起的草莓炭疽病有較 好的保護(hù)作用 但治療效果稍差 因此 使用JK3 菌株可以用于預(yù)防由膠孢炭疽菌引起的草莓炭 疽病 由于浙江省草莓炭疽病主要病原菌為膠 孢炭疽菌 本文僅測(cè)試了JK3對(duì)膠孢炭疽菌的拮 抗 后一步應(yīng)該廣泛收集植物病原菌 進(jìn)行JK3 抗菌譜試驗(yàn) 明確其可能的作用范圍 室內(nèi)毒力測(cè)定顯示 稀釋10倍的無(wú)菌發(fā)酵 上清液對(duì)膠孢炭疽病菌菌絲生長(zhǎng)抑制率達(dá)到 93 顯示良好的應(yīng)用潛力 但室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié) 果不一定與田間防效成正比 離體葉片接種試驗(yàn) 展示了應(yīng)用潛力 但由于離體葉片抗病性明顯降 低 可能與活體效果會(huì)有差異 因此 后續(xù)需要 進(jìn)一步利用盆栽試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證防治效果 芽孢桿 菌類產(chǎn)品通常以芽孢的形式進(jìn)行銷售和使用 芽 孢桿菌的定殖和原位拮抗決定防治效果 后續(xù)試 驗(yàn)需要研究JK3在草莓葉面的定殖 本文僅測(cè) 738 馮江鵬 等 草莓膠孢炭疽菌拮抗細(xì)菌貝萊斯芽孢桿菌JK3的鑒定及其抗菌活性 試了代謝產(chǎn)物的作用效果 如果菌體定殖和代謝 產(chǎn)物能夠發(fā)生協(xié)同作用 將顯著提高JK3的應(yīng)用 效果 本試驗(yàn)利用脂肽合成基因引物對(duì)JK3菌株 的基因組進(jìn)行掃描 檢測(cè)到了Surfactin Bacillo mycin Bacillysin Fengycin和iturin A的合成相關(guān) 基因片段 顯示JK3菌株具有合成多種脂肽類物 質(zhì)的能力 初步試驗(yàn)顯示JK3產(chǎn)生的主要抑菌 物質(zhì)對(duì)溫度 pH和蛋白酶穩(wěn)定 顯示JK3菌株具 有進(jìn)一步研究的潛力 由于芽孢桿菌的抗菌物 質(zhì)是當(dāng)前芽孢桿菌研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一 而貝萊 斯芽孢桿菌顯示了開(kāi)發(fā)成生防制劑的潛力 并且 本文研究的JK3菌株對(duì)草莓膠孢炭疽菌引起的 草莓炭疽病顯示出良好的防治效果 因此 JK3 研究可以為進(jìn)一步發(fā)掘防治草莓炭疽病生防菌 資源奠定基礎(chǔ) 參考文獻(xiàn) References 1 徐銘毅 趙娜 趙陽(yáng) 草莓炭疽病的發(fā)生與防治 J 上海 蔬菜 2018 1 65 67 XU M Y ZHAO N ZHAO Y Occurrence and control of strawberry anthracnose J Shanghai Vegetables 2018 1 65 67 in Chinese 2 張曉慧 草莓病害研究進(jìn)展 J 安徽農(nóng)學(xué)通報(bào) 2018 24 18 52 57 ZHANG X H Research progress of strawberry diseases J Anhui Agricultural Science Bulletin 2018 24 18 52 57 in Chinese with English abstract 3 溫慶文 鐘霞 王蕾 等 大棚草莓定植后謹(jǐn)防炭疽病 J 農(nóng)業(yè)知識(shí) 2017 26 27 29 WEN Q W ZHONG X WANG L et al Beware of anthrac nose after planting strawberries in greenhouses J Agricultur al Knowledge 2017 26 27 29 in Chinese 4 張國(guó)珍 我國(guó)對(duì)草莓炭疽根腐病的重視程度亟待提高 J 植物保護(hù) 2015 41 2 234 236 ZHANG G Z Urgent attention to anthracnose root rot of straw berry is highly needed in China J Plant Protection 2015 41 2 234 236 in Chinese with English abstract 5 任海英 蔣桂華 方麗 等 浙江省草莓炭疽病菌鑒定及 生物學(xué)特性研究 J 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào) 2011 23 5 937 941 REN H Y JIANG G H FANG L et al Identification and characterization of the pathogen of strawberry anthracnose in Zhejiang Province J Acta Agriculturae Zhejiangensis 2011 23 5 937 941 in Chinese with English abstract 6 陳哲 黃靜 趙佳 等 防治草莓炭疽病的芽孢桿菌組合 的篩選 J 中國(guó)生物防治學(xué)報(bào) 2018 34 4 582 588 CHEN Z HUANG J ZHAO J et al Screening of the combi nations of Bacillus strains against strawberry anthracnose J Chinese Journal of Biological Control 2018 34 4 582 588 in Chinese with English abstract 7 王金楠 淺談生物農(nóng)藥的特點(diǎn)及發(fā)展現(xiàn)狀 J 現(xiàn)代化農(nóng) 業(yè) 2014 11 4 5 WANG J N Brief talk about the characteristics and develop ment status of biopesticides J Modernizing Agriculture 2014 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