浙 江 大 學(xué) 學(xué) 報(bào) 農(nóng) 業(yè) 與 生 命 科 學(xué) 版 46 2 177 188 2020 Journal of Zhejiang University A g r i c 2 Institute of New Fertilizer Resources and Technology Guizhou University Guiyang 550025 China 3 Guizhou Key Laboratory for Tobacco QualityStudy Guiyang550025 China Abstract The taxonomic identification and antimicrobial effect of a strain called F11 which has inhibitory effect on strawberry gray mold was studied In order to improve the fermentation efficiency of the strain the fermentation formula and conditions were optimized by orthogonal experiment and single factor test The results showed that the strain F11 could inhibit the growth and reproduction of 12 common pathogens with high inhibition rate reaching 79 88 or more which showed that this strain possessed broad spectrum and high efficiency antimicrobial effect and that it would be a hidden promising resource for biological control agent to resist plant diseases The strain F11 was identified as Bacillus amyloliquefaciens by observation of colony morphology physiological and biochemical tests 16S rRNA and gyrB gene sequencing The fermentation medium of strain F11 was optimized from L 16 4 3 2 6 orthogonal test 3 00 g L beef extract 10 00 g L peptone 5 00g LNaCl 3 00g Lglucose 2 00g LMgCl 2 Furthermore thesinglefactortestfurthershowedthatbasedon DOI 10 3785 j issn 1008 9209 2019 05 301 基 金 項(xiàng) 目 國 家 自 然 科 學(xué) 基 金 31760133 貴 州 省 科 技 計(jì) 劃 2017 0106 貴 州 省 科 技 計(jì) 劃 項(xiàng) 目 黔 科 合 平 臺(tái) 人 才 2017 5788 號(hào) 貴 州大學(xué)人才引進(jìn)項(xiàng)目 2015 10 號(hào) 貴州省生物學(xué)一流學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目 GNYL 2017 009 通信作者 Correspondingauthor 劉麗 https orcid org 0000 0002 4210 7450 E mail liuliz706 第一作者 Firstauthor 陳海念 https orcid org 0000 0003 3541 7116 E mail 571661476 收稿日期 Received 2019 05 30 接受日期 Accepted 2019 09 23 第 46 卷 浙 江 大 學(xué) 學(xué) 報(bào) 農(nóng) 業(yè) 與 生 命 科 學(xué) 版 the optimized medium the suitable initial pH of strain F11 culture was 7 0 and the befitting temperature was 30 andtheproperoscillationratewas150r min whichthenumberofviablecellswere4 67 10 9 CFU mL K e y w o r d s biocontrolbacterium identification inhibitoryeffect orthogonalexperiment mediumoptimization 以 化 學(xué) 農(nóng) 藥 為 主 導(dǎo) 的 植 物 病 害 防 治 策 略 附 帶 的 農(nóng) 藥 殘 留 超 標(biāo) 病 原 菌 抗 藥 性 增 強(qiáng) 及 生 態(tài) 平 衡 被 破 壞 等 問 題 日 益 凸 顯 1 3 而 微 生 物 防 治 表 現(xiàn) 出 的 無 污 染 無 公 害 長 效 性 處 理 費(fèi) 用 低 廉 等 優(yōu) 勢(shì) 4 7 使 得 生 物 防 治 技 術(shù) 成 為 控 制 植 物 病 害 的 最 佳 選 擇 之 一 8 9 目 前 許 多 有 益 微 生 物 已 應(yīng) 用 于 植 物 病 害 防 治 中 10 12 包 括 真 菌 細(xì) 菌 和 一 系 列 放 線 菌 等 13 生 防 菌 種 類 不 同 其 生 物 防 治 的 機(jī) 制 也 不 相 同 如 枯 草 芽 孢 桿 菌 Bacillus subtilis B 916 產(chǎn) 生 的 抗 真 菌 蛋 白 物 質(zhì) 通 過 核 糖 核 酸 酶 和 凝 結(jié) 作 用 抑 制 水 稻 稻 瘟 病 菌 核 病 紋 枯 病 及 灰 霉 病 病 原 菌 菌 絲 的 生 長 從 而 防 治 水 稻 多 種 病 害 14 木 霉 菌 Trichoderma spp 可 在 其 他 微 生 物 上 纏 繞 生 長 同 時(shí) 產(chǎn) 生 抗 菌 類 物 質(zhì) 來 抑 制 該 微 生 物 的 活 性 降 低 病 原 微 生 物 的 致 病 能 力 促 進(jìn) 植 物 生 長 以 多 粘 芽 孢 桿 菌 Bacillus polymyxa SQR 21 制備 的生 物有 機(jī)肥 施用 于香 蕉根 圍 土 壤 中 可 提 高 香 蕉 植 株 根 尖 的 蛋 白 類 抗 菌 物 質(zhì) 幾 丁 質(zhì) 酶 的 活 性 顯 著 促 進(jìn) 香 蕉 植 株 生 長 降 低 香 蕉 枯 萎 病 的 發(fā) 病 指 數(shù) 15 HELMY 等 16 發(fā) 現(xiàn) 從 熒 光 假 單 胞 菌 Pseudomonas fluorescens 中 分 離 純 化 獲 得 的 嗜 鐵 素 可 有 效 遏 制 煙 草 赤 星 病 菌 Alternaria alternata 尖 孢 鐮 刀 菌 Fusariumoxysporum 黃 曲 霉 Aspergillusflavus 等 多 種 病 原 菌 的 生 長 解 淀 粉 芽 孢 桿 菌 Bacillus amyloliquefaciens FZB42 產(chǎn) 生 的 聚 酮 化 合 物 對(duì) 由 梨 火 疫 病 病 原 菌 Erwinia amylovora 引 起 的 梨 火 疫 病 具 有 良 好 的 防 治 效 果 17 趙 青 云 等 18 發(fā) 現(xiàn) 枯 草 芽 孢 桿 菌Y IVI 能 促 進(jìn) 香 草 蘭 生 長 發(fā) 育 同 時(shí) 減 少 尖 孢 鐮 刀 菌 的 數(shù) 量 降 低 連 作 障 礙 并 可 產(chǎn) 生 鐵 載 體 吲 哚 乙 酸 等 物 質(zhì) 促 進(jìn)甜瓜生長 上 述 研 究 為 生 防 菌 更 好 地 應(yīng) 用 于 農(nóng) 業(yè) 生 產(chǎn) 提 供 了 一 定 的 參 考 依 據(jù) 展 現(xiàn) 出 生 防 菌 良 好 的 農(nóng) 業(yè) 應(yīng) 用 前 景 生 防 菌 株 的 種 屬 確 定 可 培 養(yǎng) 性 發(fā) 酵 效 率 及 其 抑 菌 效 果 等 是 保 證 生 物 防 治 效 果 的 前 提 也 是 決 定 其 能 否 從 實(shí) 驗(yàn) 室 走 向 田 間 的 關(guān) 鍵 培 養(yǎng) 基 組 分 及 發(fā) 酵 條 件 皆 會(huì) 明 顯 影 響 微 生 物 的 生 長 發(fā) 育 和 抑 菌 活 性 物 質(zhì) 的 形 成 19 而 通 常 欲 提 高 生 防 菌 抑 菌 活 性 物 質(zhì) 的 產(chǎn) 量 則 應(yīng) 先 保 證 其 細(xì) 胞 產(chǎn) 量 20 鑒 于 此 我 們 對(duì) 課 題 組 前 期 研 究 篩 選 所 得 的1 株 對(duì) 草 莓 灰 霉 病 菌 strawberry gray mold 具 有 較 佳 拮 抗 作 用 的 菌 株 F11 開 展 了 進(jìn) 一 步 研 究 測(cè) 試 了 該 菌 株 對(duì) 多 種 常 見 病 原 菌 的 抑 菌 效 果 并 結(jié) 合 形 態(tài) 學(xué) 生 理 生 化 方 法 16SrRNA 及gyrB 的 分 子 生 物 學(xué) 方 法 對(duì) 其 進(jìn) 行 了 鑒 定 最 后 對(duì) 該 菌 株 的 發(fā) 酵 培 養(yǎng) 基 配 方 及 發(fā) 酵 條 件 進(jìn) 行 了 優(yōu) 化 篩 選 研 究 結(jié) 果 可 為 挖 掘 其 作 為 植 物 病 害 防 治 的 潛 在 資 源 提 供 理 論 依 據(jù) 1 材 料 與 方 法 1 1 供 試 材 料 供 試 菌 株 F11 菌 株 由 貴 州 大 學(xué) 新 型 肥 料 資 源 與 技 術(shù) 研 究 所 在 前 期 研 究 時(shí) 從 草 莓 根 際 土 壤 中 分 離篩選得到 對(duì)草莓灰霉病菌具有拮抗性能 供 試 病 原 菌 水 稻 稻 瘟 病 菌 Pyriculariaoryzae 獼 猴 桃 葡 萄 座 腔 菌 Botryosphaeria dothidea 煙 草 黑 脛 病 菌 Phytophthora parasitica var 煙 草 炭 疽 病 菌 Colletotrichum nicotianaeAv 樟 樹 膠 孢 炭 疽 病 菌 Colletotrichum gloeosp orioides 高 粱 斑 點(diǎn) 病 菌 Pseudomonas syringae pv syringae Van Hall 玉 蘭 炭 疽 病 菌 Colletotrchum magnoliaecamara 核 盤 菌 Sclerotinia sclerotiorum 禾 谷 炭 疽 菌 Colletotrichum graminicola Cesati Wilson 玉 米 大 斑 病 菌 Setosphaeria turcica 辣 椒 炭 疽 菌 Colletotrichum capsici 煙 草 赤 星 病 菌 Alternaria alternata Freis Keissler 共12 種 病 原 菌 均 為 貴 州 省山地農(nóng)業(yè)病蟲害重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng) 1 2 培 養(yǎng) 基 營養(yǎng)肉 湯 nutrientbroth NB 液體培 養(yǎng)基 3 00g 牛 肉 膏 10 00g 蛋 白 胨 5 00gNaCl 2 00g LMgCl 2 加 水 至1000mL pH7 0 高 壓 1 10 5 Pa 滅 菌30min 冷卻備用 NB 固 體 培 養(yǎng) 基 在NB 液 體 培 養(yǎng) 基 的 基 礎(chǔ) 上 加 入 瓊 脂20 0 g 高 壓 1 10 5 Pa 滅 菌30 min 冷 卻 備用 178 第 2 期 陳 海 念 等 1 株 生 防 菌 的 鑒 定 及 其 發(fā) 酵 條 件 優(yōu) 化 馬 鈴 薯 葡 萄 糖 瓊 脂 potato dextrose agar PDA 培 養(yǎng) 基 200g 馬 鈴 薯 去 皮 切 塊 煮 沸0 5h 紗 布 過 濾 20g 蔗 糖 20g 瓊 脂 加 水 至1000mL pH 自 然 7 0 高 壓 1 10 5 Pa 滅 菌30 min 冷 卻 后 倒 平 板 備用 1 3 種 子 菌 液 的 制 備 取 一 環(huán)F11 菌 苔 于NB 固 體 培 養(yǎng) 基 上 畫 線 在 30 恒 溫 培 養(yǎng) 箱 GXZ 258A 浙 江 省 寧 波 江 南 儀 器 廠 中 培 養(yǎng)24h 后 挑 取 單 菌 落 接 種 于NB 液 體 培 養(yǎng) 基 中 于30 150r min 下 振 蕩 培 養(yǎng)18h 經(jīng) 前 期 F11 生長曲線確定 獲得F11 種子菌液 1 4 試 驗(yàn) 設(shè) 計(jì) 1 4 1 菌 株F11 對(duì) 病 原 菌 的 抑 菌 效 果 分 析 采 用 經(jīng) 典 的 平 板 對(duì) 峙 培 養(yǎng) 法 觀 察 菌 株F11 的 拮 抗 情 況 并 測(cè) 定 其 對(duì) 各 病 原 菌 的 抑 菌 圈 大 小 具 體 方 法 為 將 直 徑 為7 5 mm 的 圓 形 病 原 菌 苔 菌 塊 置 于 PDA 平 板 的 中 央 在 距 平 板 中 心2 0cm 處 的4 個(gè) 對(duì) 角 線 上 接 種F11 拮 抗 菌 每 個(gè) 處 理 重 復(fù)3 次 另 在PDA 平 板 中 心 接 種 病 原 真 菌 作 空 白 對(duì) 照 在28 生 化 培 養(yǎng) 箱 內(nèi) 培 養(yǎng) 連 續(xù) 培 養(yǎng)6 8d 測(cè) 定 抑 菌 圈 大 小 1 4 2 菌 株F11 的 鑒 定 1 4 2 1 菌株F11 的形態(tài)特征和生理生化特性鑒定 將 稀 釋 的 菌 株 發(fā) 酵 液 均 勻 涂 布 于NB 固 體 培 養(yǎng) 基 平 板 上 放 入 恒 溫 培 養(yǎng) 箱 28 條 件 下 恒 溫 培 養(yǎng) 2d 出 現(xiàn) 單 菌 落 后 觀 察 菌 落 形 狀 顏 色 邊 緣 表 面 隆 起 形 狀 透 明 度 等 并 在LeicaDM500 電 子 顯 微 鏡 德 國 徠 卡 公 司 下 觀 察 細(xì) 胞 的 形 狀 結(jié) 構(gòu) 大 小 等 菌 株 的 形 態(tài) 特 征 和 生 理 生 化 特 性 鑒 定 參 照2012 年 修 訂 的 伯 杰 氏 系 統(tǒng) 細(xì) 菌 學(xué) 手 冊(cè) 第 二 版 21 1 4 2 2 菌株F11 的16SrRNA 和gyrB 基因鑒定 菌 株DNA 的 提 取 取 對(duì) 數(shù) 生 長 期 的 菌 株F11 菌 液 以1 2 10 4 r min 離 心5min 收 集1 5mL 上 清 液 將 菌 體 懸 浮 于 400 L 提 取 液 10 mmol L NaCl 20 mmol L Tris HCl 1 mmol L 乙 二 胺 四 乙 酸 ethylene diamine tetraacetic acid EDTA 中 pH 8 0 加 入100 L 終 質(zhì) 量 濃 度 為100 g mL 的 蛋 白 酶 K 和500 g mL 的 十 二 烷 基 硫 酸 鈉 sodium dodecyl sulfate SDS 溶 液 將 其 輕 輕 混 勻 后 于37 條 件 下 水 浴1h 再 在65 條 件 下 水 浴1h 加 入600 L 的 酚 三 氯 甲 烷 異 戊 醇 室 溫 下 顛 倒 混 勻 后 以1 2 10 4 r min 離 心10min 將 上 清 液 移 入1 5mL 離 心 管 重 復(fù) 該 步 驟 向 含 有DNA 的 上 清 液 水 相 中 加 入 1 10 體 積 的3mol L 乙 酸 鈉 pH5 5 和2 倍 體 積 的 無 水 乙 醇 輕 顛 混 勻 后 于 20 條 件 下 沉 淀1 h 以 1 2 10 4 r min 離 心15 min 棄 上 清 液 用70 無 水 乙 醇 洗 滌 沉 淀 以1 2 10 4 r min 離 心15min 棄 上清 液 風(fēng) 干 用50 150 L TE 緩 沖 液 10 mmol L Tris HCl 與1mmol LEDTA 的 混 合 緩 沖 液 pH8 0 溶解基因組DNA 在 20 條件下儲(chǔ)存 備用 菌 株DNA 的 聚 合 酶 鏈 式 反 應(yīng) polymerasechain reaction PCR 擴(kuò) 增 以 菌 株F11 基 因 組DNA 為 模 板 進(jìn) 行16SrRNA 和gyrB 基 因 擴(kuò) 增 16SrRNA 引 物 序 列 如 下 27F 5 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3 1492R 5 GGTTACCTTGTTACGACTT 3 gyrB 基 因 引 物 序 列 22 如 下 UP 1 5 GAAGTCATCATG ACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA 3 UP 2r 5 AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTC NACRTCNGCRTCNGTCAT 3 PCR 擴(kuò) 增 體 系 為 10 mol L 正 反 向 引 物 各1 L 天 根2 TaqPCR 混 合 液12 5 L 模 板DNA2 L 用 無 菌 去 離 子 水 補(bǔ) 足 至 25 L 其 中 天 根2 Taq PCR 混 合 液 包 括 0 1 U L Taq 聚 合 酶 各500 mol L dNTP 20 mmol L Tris HCl pH 8 3 100 mmol L KCl 3 mmol L MgCl 2 及 其 他 穩(wěn) 定 劑 和 增 強(qiáng) 劑 PCR 反 應(yīng) 條 件 95 預(yù) 變 性 4 min 98 變 性10 s 62 退 火1 min 72 延 伸2 min 30 個(gè) 循 環(huán) 72 延 伸8 min 將16S rRNA 和 gyrB 基 因 擴(kuò) 增 產(chǎn) 物 純 化 后 進(jìn) 行 測(cè) 序 分 析 通 過 NCBI 數(shù) 據(jù) 庫 https blast ncbi nlm nih gov 與 GenBank 中 的 序 列 對(duì) 測(cè) 序 結(jié) 果 進(jìn) 行Blast 比 對(duì) 分 析 并 構(gòu) 建 系 統(tǒng) 發(fā) 育 樹 從 分 子 水 平 上 對(duì) 菌 株F11 進(jìn) 行 鑒定 1 4 3 培 養(yǎng) 基 配 方 優(yōu) 化 采 用L 16 4 3 2 6 的 正 交 設(shè) 計(jì) 對(duì) 菌 株F11 培 養(yǎng) 基 配 方 進(jìn) 行 優(yōu) 化 其 中 4 水 平 的3 因 素 分 別 為 牛 肉 膏 蛋 白 胨 NaCl 2 水 平 的6 因 素 分 別 為 葡 萄 糖 Mn Mo Fe B Mg 共 設(shè) 置1 16 號(hào) 處 理 表1 以NB 培 養(yǎng) 基 處 理17 作 為 空 白 對(duì) 照 各 處 理 按1 接 種 量 接 種 后 在30 150r min 條 件 下 振 蕩18h 采 用 T6 XSJ 紫外可見 分光光度 計(jì) 北京普析 通用儀器 有 限 責(zé) 任 公 司 測(cè) 定 可 表 征 菌 懸 液 細(xì) 胞 濃 度 的 吸 光 度 值D 600nm 23 24 每 個(gè) 處 理 重 復(fù)5 次 完 全 隨 機(jī) 排 列 根 據(jù) 正 交 試 驗(yàn) 結(jié) 果 分 析 各 試 驗(yàn) 因 素 的 適 宜 水 平 1 4 4 發(fā) 酵 條 件 優(yōu) 化 對(duì) 菌 株F11 進(jìn) 行 不 同 初 始pH 6 0 6 5 7 0 7 5 179 第 46 卷 浙 江 大 學(xué) 學(xué) 報(bào) 農(nóng) 業(yè) 與 生 命 科 學(xué) 版 8 0 不 同 培 養(yǎng) 溫 度 25 30 33 35 40 和 不 同 振 蕩 速 率 100 150 170 180r min 的 發(fā) 酵 條 件 優(yōu) 化 試 驗(yàn) 各 處 理 的F11 種 子 液 接 種 量 均 為1 其 中 不 同 初 始pH 試 驗(yàn) 的 培 養(yǎng) 溫 度 為30 振 蕩 速 率 為 150r min 不 同 培 養(yǎng) 溫 度 試 驗(yàn) 的 培 養(yǎng) 基pH 為 優(yōu) 選 確 定 的pH 振 蕩 速 率 為150 r min 不 同 振 蕩 速 率 試 驗(yàn) 的 培 養(yǎng) 基pH 為 優(yōu) 選 確 定 的pH 培 養(yǎng) 溫 度 為 優(yōu) 選 確 定 的 溫 度 各 處 理 重 復(fù)5 次 完 全 隨 機(jī) 排 列 振 蕩 培 養(yǎng)18 h 測(cè) 定 發(fā) 酵 液 吸 光 度 值D 600nm 由 此 確 定 菌 株F11 的 最 佳 培 養(yǎng) 基 的 初 始pH 培 養(yǎng) 溫 度 和 振 蕩 速 率的優(yōu)化水平 1 4 5 優(yōu) 化 效 果 鑒 定 按1 接 種 量 將 菌 株F11 接 種 于 優(yōu) 選 配 方 培 養(yǎng) 基 上 在 最 佳 發(fā) 酵 條 件 下 振 蕩 培 養(yǎng)18h 獲 得 從 對(duì) 數(shù) 期 剛 轉(zhuǎn) 入 穩(wěn) 定 期 的 菌 株F11 發(fā) 酵 液 測(cè) 定 發(fā) 酵 液 在 600nm 處 的 吸 光 度 值 和 活 菌 數(shù) 以NB 液 體 培 養(yǎng) 基 為對(duì)照 鑒定優(yōu)化效果 1 5 數(shù) 據(jù) 分 析 采 用 混 菌 法 計(jì) 算 相 對(duì) 抑 制 率 采 用 十 字 交 叉 法 測(cè) 量 生 長 菌 落 直 徑 按 下 列 公 式 計(jì) 算 出 相 對(duì) 抑 制 率 相 對(duì) 抑 制 率 對(duì) 照 菌 落 直 徑 mm 處 理 菌 落 直 徑 mm 對(duì) 照 菌 落 直 徑 mm 7 5 mm 100 式 中 處理菌落的初始直徑為7 5mm 試 驗(yàn) 數(shù) 據(jù) 采 用Excel2010 整 理 并 作 圖 采 用DPS 14 0 進(jìn) 行 單 因 素 和 正 交 試 驗(yàn) 方 差 分 析 采 用MEGA 6 0 軟 件 中 的 鄰 接 法 構(gòu) 建 系 統(tǒng) 發(fā) 育 樹 2 結(jié) 果 與 分 析 2 1 菌 株F11 對(duì) 多 種 病 原 菌 的 抑 制 作 用 經(jīng) 平 板 對(duì) 峙 培 養(yǎng) 試 驗(yàn) 對(duì) 病 原 菌 生 長 直 徑 進(jìn) 行 測(cè) 定 并 采 用t 檢 驗(yàn) 發(fā) 現(xiàn) 經(jīng) 菌 株F11 拮 抗 處 理 后 病 原 菌 生 長 受 到 了 明 顯 抑 制 可 見F11 對(duì) 多 種 病 原 菌 的 生 長 具 有 拮 抗 性 能 表2 其 中 菌 株F11 對(duì) 核 盤 菌 的 抑 制 作 用 最 強(qiáng) 相 對(duì) 抑 制 率 達(dá) 到100 00 其 次 為 玉 米 大 斑 病 菌 菌 株F11 對(duì) 其 的 相 對(duì) 抑 制 率 為 94 74 且 對(duì) 煙 草 炭 疽 病 菌 玉 蘭 炭 疽 病 菌 和 獼 猴 桃 葡 萄 座 腔 菌 等 病 原 菌 的 抑 制 率 均 達(dá)79 88 以 上 由 此 說 明 F11 具 有 高 效 廣 譜 的 抑 菌 效 果 表 現(xiàn) 出 良好的生防應(yīng)用潛能 2 2 菌 株F11 的 形 態(tài) 特 征 如 圖1A 所 示 菌 株F11 菌 落 呈 圓 形 邊 緣 不 整 齊 呈 鋸 齒 狀 表 面 干 燥 有 褶 皺 無 黏 性 不 透 明 乳 白 色 光 學(xué) 顯 微 鏡 下 可 見 該 菌 株 細(xì) 胞 為 短 桿 狀 部 表 1 L 16 4 3 2 6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案 Table1 DesignofL 16 4 3 2 6 orthogonalarrayexperiment 處理 Treatment 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 牛肉膏 Beefextract 1 1 00 1 1 00 1 1 00 1 1 00 2 2 00 2 2 00 2 2 00 2 2 00 3 3 00 3 3 00 3 3 00 3 3 00 4 5 00 4 5 00 4 5 00 4 5 00 蛋白胨 Peptone 1 2 00 2 5 00 3 7 00 4 10 00 1 2 00 2 5 00 3 7 00 4 10 00 1 2 00 2 5 00 3 7 00 4 10 00 1 2 00 2 5 00 3 7 00 4 10 00 NaCl 1 2 00 2 5 00 3 7 00 4 10 00 2 5 00 1 2 00 4 10 00 3 7 00 3 7 00 4 10 00 1 2 00 2 5 00 4 10 00 3 7 00 2 5 00 1 2 00 葡萄糖 Glucose 1 0 00 1 0 00 2 3 00 2 3 00 2 3 00 2 3 00 1 0 00 1 0 00 1 0 00 1 0 00 2 3 00 2 3 00 2 3 00 2 3 00 1 0 00 1 0 00 Mn MnSO 4 2H 2 O 1 0 00 1 0 00 2 0 50 2 0 50 2 0 50 2 0 50 1 0 00 1 0 00 2 0 50 2 0 50 1 0 00 1 0 00 1 0 00 1 0 00 2 0 50 2 0 50 Mo Na 2 MoO 4 1 0 00 2 0 05 1 0 00 2 0 05 1 0 00 2 0 05 1 0 00 2 0 05 2 0 05 1 0 00 2 0 05 1 0 00 2 0 05 1 0 00 2 0 05 1 0 00 B H 3 BO 3 1 0 00 2 0 05 1 0 00 2 0 05 2 0 05 1 0 00 2 0 05 1 0 00 2 0 05 1 0 00 2 0 05 1 0 00 1 0 00 2 0 05 1 0 00 2 0 05 Fe FeSO 4 7H 2 O 1 0 00 2 0 10 1 0 00 2 0 10 2 0 10 1 0 00 2 0 10 1 0 00 2 0 10 1 0 00 2 0 10 1 0 00 1 0 00 2 0 10 1 0 00 2 0 10 Mg MgCl 2 1 0 50 2 2 00 2 2 00 1 0 50 1 0 50 2 2 00 2 2 00 1 0 50 2 2 00 1 0 50 1 0 50 2 2 00 2 2 00 1 0 50 1 0 50 2 2 00 括號(hào)內(nèi)的數(shù)據(jù)為培養(yǎng)基中各因子水平的實(shí)際量 g L Datainparenthesesaretheactualdosageofthelevelofeachfactorinthemedium g L 180 第 2 期 陳 海 念 等 1 株 生 防 菌 的 鑒 定 及 其 發(fā) 酵 條 件 優(yōu) 化 分 橢 圓 狀 有 芽 孢 形 成 兩 端 鈍 圓 很 少 成 鏈 成 單 或 是 成 短 鏈 排 列 初 步 鑒 定 為 芽 孢 桿 菌 屬 圖1B 2 3 菌 株F11 的 生 理 生 化 特 征 生 理 生 化 鑒 定 結(jié) 果 表3 表 明 菌 株F11 經(jīng) 革 蘭 氏 染 色 呈 陽 性 在1 8 NaCl 處 理 條 件 下 均 可 生 長 在 鳥 氨 酸 脫 羧 酶 賴 氨 酸 脫 羧 酶 甲 基 紅 反 應(yīng) 硫 化 氫 實(shí) 驗(yàn) 中 結(jié) 果 為 陰 性 在 半 乳 糖 苷 酶 接 觸 酶 氧 化 酶 脲 酶 精 氨 酸 雙 水 解 酶 淀 粉 水 解 明 膠 水 解 酪 素 水 解 硝 酸 鹽 還 原 檸 檬 酸 生 長 50 生 長 VP Voges Proskauer 反 應(yīng) 的 實(shí) 驗(yàn) 中 結(jié) 果 為 陽 性 對(duì) 比 發(fā) 現(xiàn) 菌 株F11 的 生 理 生 化 特 征 與 其 他4 種 解 淀 粉 芽 孢 桿 菌 基 本 一 致 結(jié) 合 菌 株F11 的 菌 落 及 細(xì) 胞 形 態(tài) 特 征 初 步 擬 定 菌 株F11 為 解 淀 粉 芽 孢 桿菌 2 4 菌 株F11 的 分 子 鑒 定 在 細(xì) 菌 的 進(jìn) 化 過 程 中 16S rRNA 基 因 和gyrB 基 因 具 有 較 高 的 保 守 性 16S rRNA 平 均 每5 000 萬 年 堿 基 的 替 換 變 化 率 為1 而gyrB 基 因 每100 萬 年 堿 基 的 替 換 變 化 率 為0 7 0 8 gyrB 可 彌 補(bǔ) 16SrRNA 序 列 無 法 區(qū) 分 近 緣 種 的 缺 陷 能 更 好 地 區(qū) 分 近 似 種 因 此 結(jié) 合2 種 基 因 擴(kuò) 增 測(cè) 序 方 式 可 使 菌 株 的 種 屬 鑒 定 更 為 準(zhǔn) 確 經(jīng) 測(cè) 序 菌 株F11 的 16S rRNA 及gyrB 基 因 序 列 長 度 分 別 為1 457 bp 和 879bp 測(cè) 序 結(jié) 果 通 過NCBI 數(shù) 據(jù) 庫 進(jìn) 行Blast 比 對(duì) 其 識(shí) 別 號(hào) 分 別 為8TCWE8SN015 和8TE5X4BT014 A B 100 m A 肉眼觀察 B 光學(xué)顯微鏡下觀察 A Visualobservation B Observationunderopticalmicroscope 圖1 菌株F11 的形態(tài) Fig 1 MorphologyofstrainF11 表 2 菌株 F 11 對(duì) 12 種病原菌的抑制作用 Table2 InhibitoryeffectsofstrainF11on12pathogens 病原菌 Pathogen 煙草黑脛病菌 Phytophthoraparasiticavar 煙草炭疽病菌 ColletotrichumnicotianaeAv 樟樹膠孢炭疽病菌 Colletotrichumgloeosporioides 高粱斑點(diǎn)病菌 Pseudomonassyringaepv syringaeVanHall 玉蘭炭疽病菌 Colletotrchummagnoliaecamara 核盤菌 Sclerotiniasclerotiorum 禾谷炭疽菌 ColletotrichumgraminicolaCesatiWilson 玉米大斑病菌 Setosphaeriaturcica 煙草赤星病菌 Alternariaalternata Freis Keissler 辣椒炭疽菌 Colletotrichumcapsici 水稻稻瘟病菌 Pyriculariaoryzae 獼猴桃葡萄座腔菌 Botryosphaeriadothidea 相對(duì)抑制率 Relativeinhibition rate 80 53 90 69 86 67 80 97 83 51 100 00 82 15 94 74 81 42 86 06 79 88 91 52 病原菌直徑 Pathogendiameter 對(duì)照組 Controlgroup cm 5 63 1 02 5 05 0 35 9 00 0 00 8 63 0 64 8 63 0 63 9 00 0 00 6 63 0 49 7 40 0 96 7 30 0 56 9 00 0 00 6 30 0 36 9 00 0 00 F11 拮抗組 AntagonismgroupofF11 cm 1 70 0 26 1 15 0 07 1 85 0 07 2 25 0 49 2 05 0 21 0 75 0 01 1 80 0 20 1 10 0 20 1 97 0 21 1 90 0 20 1 87 0 21 1 45 0 21 t 檢驗(yàn) ttest 6 46 15 30 12 35 11 81 13 54 11 82 15 73 11 08 15 54 12 31 18 44 14 13 P 值 Pvalue 0 0029 0 0021 0 0001 0 0013 0 0087 0 0001 0 0001 0 0002 0 0001 0 0014 0 0001 0 0002 181 第 46 卷 浙 江 大 學(xué) 學(xué) 報(bào) 農(nóng) 業(yè) 與 生 命 科 學(xué) 版 選 取 相 似 度 較 高 的 序 列 及 大 腸 埃 希 菌 等 相 似 度 較 低 的 菌 株 序 列 為 外 群 采 用 鄰 近 法 構(gòu) 建 系 統(tǒng) 發(fā) 育 樹 16S rRNA 系 統(tǒng) 發(fā) 育 樹 圖2 顯 示 菌 株F11 與 解 淀 粉 芽 孢 桿 菌B amyloliquefaciens Fito F321 序 列 號(hào) MG836692 1 在 同 一 分 支 上 Blast 比 對(duì) 相 似 性 高 達(dá)99 79 在gyrB 基 因 系 統(tǒng) 發(fā) 育 樹 圖3 上 表 3 菌株 F 11 與其他解淀粉芽孢桿菌生理生化鑒定結(jié)果對(duì)比 Table3 ComparisonofphysiologicalandbiochemicalidentificationresultsofstrainF11withotherBacillusamyloliquefaciens 指標(biāo)Index 半乳糖苷酶 galactosidase 接觸酶Catalase 氧化酶Oxidase 脲酶Urease 精氨酸雙水解酶Argininedihydrolase 淀粉水解Starchhydrolysis 明膠水解Gelatinhydrolysis 酪素水解Caseinhydrolysis 鳥氨酸脫羧酶Ornithinedecarboxylase 賴氨酸脫羧酶Lysinedecarboxylase 硝酸鹽還原Nitratereduction 檸檬酸生長Citricacidgrowth 50 生長Growthat50 VP 反應(yīng)Voges Proskauerreaction 甲基紅反應(yīng)Methylredreaction 硫化氫產(chǎn)生Hydrogensulfideproduction 甘露醇Mannitol 山梨醇Sorbitol 鼠李糖L rhamnose 蔗糖D sucrose 蜜二糖Melibiose 革蘭氏染色Gramstain F11 LX1 25 WTD 26 H 2 27 H 7 28 LX1 WTD H 2 H 7 為4 種解淀粉芽孢桿菌 陽性反應(yīng) 陰性反應(yīng) LX1 WTD H 2 andH 7belongtoBacillusamyloliquefaciens Positivereaction Negativereaction NR116022 1 Bacillus amyloliquefaciens BCRC 11601 CP006960 1 Bacillus amyloliquefaciens UMAF6614 CP014783 1 Bacillus amyloliquefaciens B15 KY007189 1 Bacillus amyloliquefaciens SH207 MG836692 1 Bacillus amyloliquefaciens Fito F321 F11 NR102783 2 Bacillus subtilis subsp subtilis NR112116 2 Bacillus subtilis IAM 12118 NR116017 1 Bacillus subtilis BCRC 10255 AM293345 1 Bacillus thuringiensis NR 074540 1 Bacillus cereus ATCC 14579 KY982963 1 Bacillus sp CKG5 KY982962 1 Bacillus thuringiensis CKG2 AJ704827 1 Bacillus sp P9 J01859 1 Escherichia coli M25588 1 Escherichia coli 52 98 60 99 87 100 100 88 13 13 75 94 7 圖2 16SrRNA 的系統(tǒng)發(fā)育樹 Fig 2 Phylogenetictreeof16SrRNA 182 第 2 期 陳 海 念 等 1 株 生 防 菌 的 鑒 定 及 其 發(fā) 酵 條 件 優(yōu) 化 菌 株F11 與 解 淀 粉 芽 孢 桿 菌 B amyloliquefaciens Rx 35 序 列 號(hào) JN086142 1 在 同 一 分 支 上 Blast 比 對(duì) 相 似 性 高 達(dá)99 89 結(jié) 合 菌 株 形 態(tài) 和 生 理 生 化 特 征 確 定 菌 株 F11 為 解 淀 粉 芽 孢 桿 菌 B amyloliquefaciens 2 5 基 于NB 培 養(yǎng) 基 的 配 方 優(yōu) 化 如 圖4 所 示 菌 落F11 菌 懸 液D 600nm 值 在 處 理 間 存 在 顯 著 差 異 P 0 05 其 中 正 交 試 驗(yàn) 處 理12 14 的D 600nm 值 均 顯 著 高 于NB 培 養(yǎng) 基 處 理17 的 D 600nm 值 0 59 以處理12 的D 600nm 值 1 41 為最高 圖5 與 表4 顯 示 在 各 因 子 中 除B 和Fe 的2 水