中 中國(guó) 國(guó) 瓜 瓜菜 菜 2020 33 6 12 16 一 個(gè) 辣 椒 輕 斑 駁 病 毒 中 國(guó) 分 離 物 的 基 因 組 測(cè) 序 及 分 析 李 麗 麗 1 鄭 敏 2 楊 洪 一 2 1 黑龍江省林業(yè)科學(xué)研究所 哈爾濱 150081 2 東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 哈爾濱 150040 摘 要 利用CTAB法分離辣椒葉片總RNA 利用RT PCR技術(shù)擴(kuò)增出了辣椒輕斑駁病毒中國(guó)分離物Hrb基因組 不同區(qū)域片段 并經(jīng)克隆 測(cè)序 證明其為辣椒輕斑駁病毒特異序列 經(jīng)序列拼接 獲得了6290nt的辣椒輕斑駁 病毒中國(guó)分離物Hrb基因組全序列 該序列與GenBank中已報(bào)道的其他辣椒輕斑駁病毒基因組的序列同源性為 94 0 99 6 系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示辣椒輕斑駁病毒中國(guó)分離物 Hrb與日本分離物 PMMoV J C 1421 Pa18 TPO 2 19 親緣關(guān)系較近 與西班牙分離物Ia親緣關(guān)系較遠(yuǎn) 關(guān)鍵詞 辣椒 辣椒輕斑駁病毒 基因組 中圖分類(lèi)號(hào) S641 3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1673 2871 2020 06 012 05 Genome sequence and analysis of a Chinese isolate of Pepper mild mottle virus LILili 1 ZHENGMin 2 YANGHongyi 2 1 Institute of Forestry Science of Heilongjiang Province Harbin 150081 Heilongjiang China 2 College of Life Sciences Northeast ForestryUniversity Harbin150040 Heilongjiang China Abstract Total RNAwas isolated from leaves of pepper using CTAB method The fragments located in different regions of a Chinese isolate of Pepper mild mottle virus PMMoV were amplified by RT PCR and the PMMoV specific frag ments were confirmed by cloning and sequencing A6290 nt genome sequence of Chinese isolate Hrb was obtained The identities between the sequence and other reported sequences in GenBank were 94 0 99 6 Phylogenetic analysis indicatedthattherewasclosegeneticrelationshipbetweenisolateHrbwithJapanisolates PMMoV J C 1421 Pa18 and TPO 2 19 Inaddition therewasfargeneticrelationshipbetweenisolateHrbwithSpanishisolateIa Keywords Pepper Peppermildmottlevirus Genome 收 稿 日 期 2019 12 16 修 回 日 期 2020 01 16 基 金 項(xiàng) 目 中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目 DL13EA06 03 作 者 簡(jiǎn) 介 李麗麗 女 副研究員 研究方向?yàn)槲⑸飳W(xué) E mail 18830701 通 信 作 者 楊洪一 男 教授 研究方向?yàn)槲⑸飳W(xué) E mail yhyi1 試驗(yàn)研究 辣椒輕斑駁病毒 Pepper mild mottle virus PMMoV 是當(dāng)前辣椒生產(chǎn)中遇到的主要病毒之 一 1 辣椒輕斑駁病毒屬煙草花葉病毒屬 Tobamo virus 病毒粒體呈直桿狀 辣椒輕斑駁病毒曾在 英國(guó) 美國(guó)辣椒田中引起毀滅性災(zāi)害 目前該病毒 已在美國(guó) 德國(guó) 日本等地廣泛發(fā)生 并在世界各地 廣泛分布 2 向本春等 3 于1994年在新疆辣椒上發(fā) 現(xiàn)了辣椒輕斑駁病毒 是我國(guó)的首次報(bào)道 此后 相繼在青島 北京等地廣泛被報(bào)道 4 辣椒輕斑駁 病毒為種傳病毒 帶毒種子是病毒擴(kuò)散的重要因 素 辣椒輕斑駁病毒可隨辣椒制品進(jìn)入人體 經(jīng)消 化 排出體外后仍具有侵染性 5 早期侵染后 辣椒 輕斑駁病毒可使葉片輕度褪綠 部分植株矮化 癥 狀可能較輕微 后期可能使葉片斑駁 黃化 可使辣 椒果實(shí)呈現(xiàn)凹凸 壞死斑點(diǎn)或淺黃色斑駁 從而影 響辣椒產(chǎn)量及品質(zhì) 1 辣椒輕斑駁病毒對(duì)辣椒生產(chǎn)造成了巨大威脅 因而迫切需要控制辣椒輕斑駁病毒造成的危害 培育抗病毒品種是控制植物病毒病危害的主要策 略 當(dāng)前已獲得了辣椒輕斑駁病毒的抗性基因 6 然而 由于病毒的快速變異 一些新的病毒分離物 可能使抗性基因失效 7 9 獲得病毒不同分離物的 基因組序列并分析其分子變異特點(diǎn)是病毒防控的 基礎(chǔ)性工作 筆者在前期研究中已獲得了一個(gè)辣 12 第6期 等 基因組測(cè)序及分析 試驗(yàn)研究 李麗麗 等 一個(gè)辣椒輕斑駁病毒中國(guó)分離物的基因組測(cè)序及分析 椒輕斑駁病毒中國(guó)分離物 在本試驗(yàn)中探索獲得其 基因組序列并分析其分子變異特點(diǎn) 1 材料與方法 1 1 材料 感染辣椒輕斑駁病毒的辣椒植株于2014年取 自哈爾濱農(nóng)田 經(jīng)RT PCR鑒定其為辣椒輕斑駁病 毒 該分離物被命名為Hrb 基于辣椒輕斑駁病毒基因組序列 GenBank登 陸號(hào) NC 003630 設(shè)計(jì)引物 引物序列見(jiàn)表1 引 物由上海生工生物工程公司合成 1 2 總RNA 分離 向離心管中加入490 LCTAB 10 L 巰基乙 醇 采集幼嫩葉片 經(jīng)液氮速凍 快速研磨至細(xì)粉 并轉(zhuǎn)入離心管 輕輕晃動(dòng)離心管 65 水浴 之后 加入等體積的氯仿 異戊醇 24 1 混勻后12000r min 1 離心5 min 取上清 再次進(jìn)行氯仿 異戊醇抽提 12 000 r min 1 離心5 min 取上清并加入1 10體積 3 mol L 1 醋酸鈉 三倍體積無(wú)水乙醇 混勻后 12 000 r min 1 離心5 min 加入30 L去離子水溶 解沉淀 1 3 利 用RT PCR 技 術(shù) 擴(kuò) 增 病 毒 基 因 組 不 同 區(qū) 域 片段 反轉(zhuǎn)錄體系如下 總RNA 1 0 L RNase free H2O 12 L M MLV Buffer 4 L 隨機(jī)引物1 0 L dNTPs 0 5 L 10 mmol L 1 RNasin Ribonuclease Inhibitor 0 5 L M MLV 1 L 200 U 反應(yīng)條件 為 37 2 5h 72 30min PCR體系如下 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 L 10 Buffer 2 L MgCl23 L 10 甘油2 L 上下游引物各2 L 引物組合分別為A11 A22 B11 B22 C11 C22 D11 D22 E11 E22 F11 F22 dNTPs0 4 L 10mmol L 1 Taq DNA酶0 75 U 加去離子水至25 L 反應(yīng)條 件 94 2min 94 30s 55 40s 72 1min 35個(gè)循環(huán) 72 5min 1 4 PCR 產(chǎn)物的克隆和測(cè)序 利用TaKaRa公司的瓊脂糖凝膠回收試劑盒回 收目的片段 將回收的目的片段與pMD 18T載體連 接 反應(yīng)體系如下 5 L solution I buffer 1 L pMD 18T載體 1 L回收目的片段及3 L去離子 水 4 過(guò)夜連接 將10 L連接產(chǎn)物加入30 LJM109感受態(tài)細(xì) 胞中 冰上放置30min 42 熱激45s 冰浴1min 加入LB液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng) 經(jīng)藍(lán)白斑篩選 PCR 技術(shù)篩選陽(yáng)性克隆 之后對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行雙向 測(cè)序 使用DNAMAN軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列拼接 之后利用BLAST進(jìn)行序列比較 利用CLUSTAL 1 83進(jìn)行多序列比對(duì) 2 結(jié)果與分析 2 1 RT PCR 擴(kuò)增及測(cè)序 利用CTAB法分離辣椒葉片總RNA 利用擴(kuò)增 辣椒輕斑駁病毒基因組不同區(qū)域的引物對(duì) 經(jīng)過(guò)不 斷優(yōu)化RT PCR反應(yīng)條件 最終擴(kuò)增出了預(yù)期的辣 椒輕斑駁病毒基因組不同區(qū)域片段 圖1 利用膠 回收試劑盒 將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收純化 之后 進(jìn)行克隆 測(cè)序 獲得了辣椒輕斑駁病毒中國(guó)分離 物Hrb基因組不同區(qū)域片段的序列 2 2 基因組特點(diǎn)分析 經(jīng)序列拼接 獲得了6 290 nt的辣椒輕斑駁 病毒中國(guó)分離物Hrb基因組全序列 圖2 該序列 腺嘌呤 胸腺嘧啶 鳥(niǎo)嘌呤 胞嘧啶的比例為19 18 15 12 其核苷酸序列比GenBank中已報(bào)道的辣椒 輕斑駁病毒基因組序列 GenBank登陸號(hào) NC 003630 在700 768 nt處缺少69個(gè)核苷酸 序列缺 表1 擴(kuò) 增 辣 椒 輕 斑 駁 病 毒 基 因 組 不 同 區(qū) 域 的 引 物 對(duì) 引物名稱(chēng) A11 B11 C11 D11 E11 F11 A22 B22 C22 D22 E22 F22 引物序列 5 3 GTAAATTTTTCACAATTTAA GCGTCACAATGCTCAAAAGG CGTTTGAGAGGCCTACCG GTCTAGGCATACAAGGTCGATC CCTTCTCTGGAATTTTGAAGCC GTGTGTCAGAAGGAGGACCCG GGTTGCAATGCAAGTGCGAC GGTTGCAATGCAAGTGCGAC CTCACACACTCCAGATCTC GCACATCACAAAGAGAGGTCC TCTGTCAGCCATTGGAACTG TGGGCCGCTACCCGCGGTT 注 M DL2000 Marker 1 6 6個(gè)辣椒輕斑駁病毒基因組不同 片段 引物組合分別為A11 A22 B11 B22 C11 C22 D11 D22 E11 E22 F11 F22 圖1 利 用RT PCR 技 術(shù) 擴(kuò) 增 辣 椒 輕 斑 駁 病 毒 中 國(guó) 分 離 物 Hrb 基 因 組 不 同 區(qū) 域 片 段 2000bp 1000bp 2000bp 1000bp 13 中 國(guó) 瓜 菜 第33卷 試驗(yàn)研究 失其并未造成移碼突變 在GenBank中未見(jiàn)類(lèi)似缺 失核苷酸的辣椒輕斑駁病毒分離物 獲得的基因組序列包含 4個(gè)開(kāi)放閱讀框 ORF ORF1 70 4 842 nt ORF2 70 3 357 nt ORF3 4 843 5 616 nt ORF4 5 619 6 092 nt 分別 編碼183 KDa蛋白 126 KDa蛋白 運(yùn)動(dòng)蛋白 28 KDa 外殼蛋白 17KDa 3 非編碼區(qū) 5 非編碼 區(qū)分別為198nt 69nt 圖2 辣椒輕斑駁病毒中國(guó)分離物Hrb基因組序列與 GenBank中已報(bào)道的其他辣椒輕斑駁病毒基因組 序列同源性為94 0 99 6 中國(guó)分離物Hrb的 ORF1 ORF2 ORF3 ORF4所編碼蛋白分別與其他 分離物氨基酸序列同源性為96 2 97 7 95 4 96 8 96 5 99 6 94 3 98 1 表2 中國(guó)分 離物Hrb非編碼區(qū)序列與其他分離物同源性分別為 95 7 98 6 97 5 100 將得到的辣椒輕斑駁病毒中國(guó)分離物Hrb基因 組序列與煙草花葉病毒屬內(nèi)其他病毒進(jìn)行了序列 注 下劃線標(biāo)記區(qū)為非編碼區(qū)序列 圖2 辣 椒 輕 斑 駁 病 毒 中 國(guó) 分 離 物Hrb 的 基 因 組 序 列 14 第6期 等 基因組測(cè)序及分析 試驗(yàn)研究 李麗麗 等 一個(gè)辣椒輕斑駁病毒中國(guó)分離物的基因組測(cè)序及分析 比較 此分離物與番茄花葉病毒 Tomato mosaic virus ToMV 親緣關(guān)系最近 核苷酸序列相似性為 68 5 與郁金香脈明病毒 Turnip vein clearing virus TVCV 親緣關(guān)系最遠(yuǎn) ORF1 ORF2 ORF4 的核苷酸序列相似性 氨基酸序列相似性均與番茄 花葉病毒相似性最高 其次為煙草花葉病毒 Tobacco mosaic virus TMV 與郁金香脈明病毒 Turnip veinclearingvirus TVCV 相似性最低 基于辣椒輕斑駁病毒基因組運(yùn)動(dòng)蛋白及外殼 蛋白序列 對(duì)不同辣椒輕斑駁病毒分離物進(jìn)行了系 統(tǒng)進(jìn)化分析 獲得的分離物與日本分離物 PM MoV J C 1421 Pa18 TPO 2 19 親緣關(guān)系較近 并 聚集在一起形成一個(gè)小的進(jìn)化枝 圖3 與西班牙 分離物Ia親緣關(guān)系較遠(yuǎn) 表2 中 國(guó) 分 離 物Hrb 不 同ORF 與 與 其 他 分 離 物 氨 基 酸 序 列 的 同 源 性 GenBank登陸號(hào) ALT54482 AKL59778 AND76923 BAJ19100 AQN78275 BAD90600 AIC77170 AVP80828 BAE92304 BAS32797 CCJ27723 ORF1 97 5 97 7 97 7 97 7 97 7 97 1 97 5 97 3 97 2 96 2 ORF2 96 8 96 8 96 7 96 7 96 7 96 3 96 4 96 6 96 4 95 4 ORF3 98 1 99 6 99 2 98 8 98 4 97 7 98 8 98 4 97 7 96 5 ORF4 98 1 98 1 98 1 98 1 98 1 98 1 98 1 98 1 98 1 96 2 94 3 分離物起源 加拿大 中國(guó) 委內(nèi)瑞拉 巴西 韓國(guó) 韓國(guó) 印度 美國(guó) 日本 韓國(guó) 土耳其 注 表示無(wú)該序列信息 注 不同分離物的 GenBank登陸號(hào)如下 PMMoV J AB000709 C 1421 AB069853 S M81413 Pa18 AB113116 TPO 2 19 AB113117 PMMoV CN AY859497 BR DF01 AB550911 P AB084456 Kr AB126003 L4BV AB276030 Iw AB254821 Ia AJ308228 圖3 基 于 辣 椒 輕 斑 駁 病 毒 基 因 組 運(yùn) 動(dòng) 蛋 白 及 外 殼 蛋 白 的 系 統(tǒng) 進(jìn) 化 樹(shù) 3 討論與結(jié)論 我國(guó)自1994年首次報(bào)道了辣椒輕斑駁病毒后 已有較多關(guān)于辣椒輕斑駁病毒危害辣椒的報(bào) 道 1 3 4 9 然而 當(dāng)前尚未引起辣椒生產(chǎn)及科研人員 的廣泛重視 辣椒種子可攜帶辣椒輕斑駁病毒 因 而利于其快速傳播 此外 人類(lèi)糞便中的辣椒輕斑 駁病毒也具有侵染性 即使常規(guī)堆肥也難以徹底殺 滅植物殘?bào)w 糞便中的辣椒輕斑駁病毒 5 因而 當(dāng) 前我國(guó)辣椒輕斑駁病毒的危害范圍可能遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò) 現(xiàn)有報(bào)道中的分布范圍 目前已有的辣椒輕斑駁病毒的報(bào)道主要集中 于華北 華東等地 1 4 9 其他地域的相關(guān)報(bào)道較少 且 該病毒中國(guó)分離物的分子變異特點(diǎn)也尚不明晰 東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物病原微生物課題 組前期研究中已獲得了一個(gè)辣椒輕斑駁病毒中國(guó) 分離物 筆者獲得了其基因組序列并分析了其分子 變異特點(diǎn) 當(dāng)前我國(guó)已報(bào)道的辣椒輕斑駁病毒分 離物較少 有必要通過(guò)大規(guī)模篩選分離 獲得更多 辣椒輕斑駁病毒中國(guó)分離物 并進(jìn)一步分析當(dāng)前主 要抗辣椒輕斑駁病毒基因?qū)Σ煌《痉蛛x物的有 效性 15 中 國(guó) 瓜 菜 第33卷 試驗(yàn)研究 經(jīng)RT PCR 克隆 測(cè)序 獲得了6290nt的辣椒 輕斑駁病毒中國(guó)分離物Hrb基因組全序列 該序列 與GenBank中已報(bào)道的其他辣椒輕斑駁病毒基因 組的序列同源性為94 0 99 6 系統(tǒng)進(jìn)化分析顯 示辣椒輕斑駁病毒中國(guó)分離物Hrb與日本分離物親 緣關(guān)系較近 與西班牙分離物Ia親緣關(guān)系較遠(yuǎn) 參考文獻(xiàn) 1 王亞南 趙緒生 袁文龍 等 辣椒輕斑駁病毒研究現(xiàn)狀 J 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2010 38 14 7401 7402 2 ANTIGNUS Y LACHMAN O PEARLSMAN M et al A new pathotype of Pepper mild mottle virus PMMoV over comes the L 4 resistance genotype of pepper cultivars J Plant Disease 2008 92 1033 1037 3 向本春 謝浩 崔星明 等 新疆辣椒輕微斑駁病毒的分離鑒 定 J 病毒學(xué)報(bào) 1994 10 3 240 245 4 陳青 余芳平 林石明 等 進(jìn)境辣椒種子中檢測(cè)出辣椒輕斑 駁病毒 J 植物檢疫 2005 19 5 295 296 5 COLSONP RICHETH DESNUESC etal Pepper mild mot tlevirus aplantvirusassociatedwithspecificimmuneresponses fever abdominal pains and pruritus in humans J PLOS ONE 2010 5 4 10041 6 TENLLADO F GARCIA LUQUE I SERRA M T et al Pepper resistance breaking tobamoviruses Can they co exist in single pepper plant J European Journal of Plant Pathology 1997 103 3 235 243 7 HIROYUKIH REIKOT YASUYAI etal Cooperativeeffect of two amino acid mutations in the coat protein of Pepper mild mottle virus overcomes L3 mediated resistance in Capsicum plants J VirusGenes 2007 34 2 205 214 8 KAZUHIRAT YASUFUMI H SHIGEHARU T et al Epide miological aspects of the Japanese tobamovirus strain Pepper mild mottle virus infecting the L2 resistance of green pepper J Scientific Reports of the Faculty of Agriculture Okayama University 2004 93 19 27 9 鄭敏 辣椒輕斑駁病毒的鑒定及基因組分析 D 哈爾濱 東 北林業(yè)大學(xué) 2013 16