中 中 國(guó) 國(guó) 瓜 瓜 菜 菜 2020 33 3 23 28 試驗(yàn)研究 收 稿 日 期 2020 02 13 修 回 日 期 2020 02 26 基 金 項(xiàng) 目 國(guó) 家 自 然 科 學(xué) 基 金 項(xiàng) 目 31460518 甘 肅 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 科 技 創(chuàng) 新 基 金 GAU XKJS 2018 156 作 者 簡(jiǎn) 介 李 金 峰 男 在 讀 碩 士 研 究 生 研 究 方 向 為 植 物 病 理 學(xué) E mail lijinfeng5323 通 信 作 者 徐 秉 良 男 教 授 主 要 從 事 植 物 病 理 學(xué) 研 究 E mail xubl 美 洲 南 瓜 Cucurbita pepo 屬 于 葫 蘆 科 南 瓜 屬 Cucurbita 別 名 為 西 葫 蘆 番 瓜 等 原 產(chǎn) 于 北 美 洲 南 部 地 區(qū) 因 其 含 有 多 種 營(yíng) 養(yǎng) 成 分 具 有 很 高 的 食 用 和 藥 用 價(jià) 值 在 我 國(guó) 大 部 分 地 區(qū) 普 遍 栽 培 1 甘 肅 省 武 威 市 是 美 洲 南 瓜 的 重 要 育 種 研 發(fā) 和 生 產(chǎn) 基 地 也是當(dāng)?shù)刂匾慕?jīng)濟(jì)作物之一 2 瓜 類(lèi) 枯 萎 病 是 瓜 類(lèi) 生 產(chǎn) 上 最 難 防 治 的 土 傳 性 病 害 之 一 3 其 中 以 西 瓜 發(fā) 病 最 重 南 瓜 次 之 一 般 可 導(dǎo) 致 減 產(chǎn)20 30 嚴(yán) 重 時(shí) 可 達(dá)50 60 其 中 連 作 地 的 發(fā) 病 情 況 最 為 嚴(yán) 重 常 可 導(dǎo) 致 全 田 無(wú) 收 加 之 近 年 來(lái) 枯 萎 病 對(duì) 美 洲 南 瓜 的 危 害 日 益 嚴(yán) 重 但 其 防 治 較 為 困 難 因 此 枯 萎 病 的 危 害 是 瓜 類(lèi) 生 產(chǎn) 上 急 需 解 決 的 重 要 問(wèn) 題 4 也 成 為 限 制 美 洲 南 瓜 生 產(chǎn)的重要因素之一 5 研 究 表 明 瓜 類(lèi) 枯 萎 病 的 病 原 菌 多 為 尖 孢 鐮 孢 菌 6 引 起 甜 瓜 枯 萎 病 的 病 原 菌 為 尖 孢 鐮 孢 菌 甜 瓜 專(zhuān) 化 型Fusariumoxysporumf sp melonls 7 徐 彥 剛 等 8 研 究 表 明 尖 孢 鐮 孢 菌 黃 瓜 專(zhuān) 化 型 F oxysporum f sp cucumerinum 是 造 成 黃 瓜 枯 萎 病 的 病 原 菌 呂 佩 珂 等 9 研 究 認(rèn) 為 尖 鐮 孢 菌 西 瓜 專(zhuān) 化 型 F oxysporum f sp niveum 為 侵 害 西 瓜 的 枯 萎 病 病 原 菌 但 是 關(guān) 于 近 幾 年 來(lái) 甘 肅 省 武 威 地 區(qū) 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 病 原 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 菌 分 離 鑒 定 及 其 生 物 學(xué) 特 性 李 金 峰 1 劉 佳 1 侯 敏 1 張 樹(shù) 武 1 沈 志 彥 1 徐 秉 良 1 陳 榮 賢 2 1 甘肅省農(nóng)作物病蟲(chóng)害生物防治工程實(shí)驗(yàn)室 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院 蘭州 730070 2 甘肅省武威金蘋(píng)果有限責(zé)任公司 甘肅武威 733000 摘 要 通 過(guò) 采 用 病 原 菌 形 態(tài) 學(xué) 觀 察 ITS 分 子 鑒 定 病 原 菌 生 物 學(xué) 特 性 測(cè) 定 明 確 甘 肅 省 武 威 地 區(qū) 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 的 病 原 菌 及 其 生 物 學(xué) 特 性 結(jié) 果 表 明 引 起 甘 肅 省 武 威 地 區(qū) 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 的 病 原 為 尖 孢 鐮 孢 菌 Fusarium oxysporum 該 病 原 菌 在 25 12 h 光 暗 交 替 pH 為 8 以 淀 粉 為 碳 源 時(shí) 生 長(zhǎng) 最 好 以 硝 酸 鈉 和 尿 素 為 氮 源 時(shí) 其 生 長(zhǎng) 速 率 最 快 以 牛 肉 浸 膏 為 氮 源 時(shí) 最 有 利 于 產(chǎn) 孢 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 的 病 原 菌 及 生 物 學(xué) 特 性 的 明 確 為 后 續(xù) 的 病害防治等方面提供了理論基礎(chǔ) 關(guān)鍵詞 美洲南瓜 枯萎病 分離鑒定 尖孢鐮孢菌 生物學(xué)特性 中圖分類(lèi)號(hào) S642 6 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1673 2871 2020 03 023 06 Identificationandbiologicalcharacteristicsofthepathogencausing CucurbitapepoFusariumwilt LIJinfeng 1 LIUJia 1 HOUMin 1 ZHANGShuwu 1 SHENZhiyan 1 XUBingliang 1 CHENRongxian 2 1 Biocontrol Engineering Laboratory of Crop Diseases and Pests of Gansu Province College of Plant Protection Gansu Agricultural University Lanzhou730070 Gansu China 2 WuweiGoldenAppleCo Ltd Wuwei733000 Gansu China Abstact In this study morphological observation of pathogens molecular identification of ITS and determination of biological characteristics of pathogens were used to determine the pathogens and biological characteristics of Cucurbita pepo Fusarium wilt in Wuwei area of Gansu province The results showed that the pathogen causing Cucurbita pepo Fusarium wilt in Wuwei area of Gansu province was Fusarium oxysporum The fungi was alternated in light and dark at 25 12h pH 8 and grew best when starch was used as the carbon source When sodium nitrate and urea were used as nitrogensources thegrowthratewasfastest andwhenbeefextractwasusedasnitrogensource itwasmostconduciveto spore production The pathogens and biological characteristics of the Cucurbita pepo Fusarium wilt disease provide a theoreticalbasisforsubsequentdiseasecontrol Keywords Cucurbitapepo Fusariumwilt Isolationandidentification Fusariumoxysporum Biologicalcharacteristics 23 中 國(guó) 瓜 菜 第33 卷 試驗(yàn)研究 菌的相關(guān)報(bào)道相對(duì)較少 明 確 病 原 菌 的 種 類(lèi) 及 其 生 物 學(xué) 特 性 是 進(jìn) 行 病 害 防 治 的 基 礎(chǔ) 工 作 因 此 筆 者 對(duì) 甘 肅 省 武 威 地 區(qū) 的 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 病 原 菌 進(jìn) 行 分 離 鑒 定 并 對(duì) 其 生 物 學(xué) 特 性 進(jìn) 行 研 究 以 期 為 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 的 防 治 奠定基礎(chǔ) 1 材料與方法 1 1 材料 供 試 的 美 洲 南 瓜 品 種 金 蘋(píng) 果12 號(hào) 金 蘋(píng) 果9 號(hào) 三 星 四 星 P3 和 P13 均 由 甘 肅 省 武 威 市 金蘋(píng)果有限責(zé)任公司提供 1 2 方法 1 2 1 病 樣 采 集 2018 年 6 月 15 日 在 甘 肅 省 武 威 市 金 蘋(píng) 果 有 限 責(zé) 任 公 司 種 質(zhì) 資 源 試 驗(yàn) 基 地 隨 機(jī) 采 集 美 洲 南 瓜 金 蘋(píng) 果12 號(hào) 金 蘋(píng) 果9 號(hào) 三 星 和 四 星 品 種 的 枯 萎 病 發(fā) 病 植 株 共20 株 將 病 樣 帶 回 甘 肅 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 植 物 保 護(hù) 學(xué) 院 植 物 病 毒 與 分 子 學(xué)研究實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離鑒定 1 2 2 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 病 原 菌 分 離 與 純 化 供 試 培 養(yǎng) 基 PDA 培 養(yǎng) 基 馬 鈴 薯 200 g 葡 萄 糖 15 g 瓊 脂 粉 進(jìn) 口 10g 用 水 定 容 至1000mL 用 于 病 原 菌的分離純化培養(yǎng) CLA 培 養(yǎng) 基 新 鮮 康 乃 馨 葉 片 小 塊 滅 菌 后 放 入 培 養(yǎng) 皿 中 每 皿5 10 片 瓊 脂 粉 進(jìn) 口 10g 加 水 定 容 至 1000mL 用于病原菌大小型分生孢子的觀察 培 養(yǎng) Czapek 培 養(yǎng) 基 1gKH2PO4 0 5gMgSO4 7H2O 0 01 g FeSO4 7H2O 30 g 蔗 糖 0 5 g KCl 2 g Na NO3 瓊 脂 粉 進(jìn) 口 10 g 用 水 定 容 至 1 000 mL 用 于不同碳氮源對(duì)美洲南瓜枯萎病菌的培養(yǎng) 組 織 分 離 法 用 無(wú) 菌 水 將 病 株 樣 品 莖 基 部 和 根 部 沖 洗 干 凈 用 無(wú) 菌 濾 紙 將 水 分 吸 干 在 超 凈 工 作 臺(tái) 中 將 發(fā) 病 莖 基 部 和 根 部 的 病 健 交 界 處 切 成 5 mm 5 mm 的 小 塊 將 處 理 好 的 小 塊 用 75 乙 醇 浸 潤(rùn)10s 再 用0 1 升 汞 溶 液 消 毒2 3min 然 后 用 無(wú) 菌 水 漂 洗3 次 用 無(wú) 菌 濾 紙 吸 干 殘 余 水 分 將 此 病 健 交 界 小 塊 采 用 五 點(diǎn) 法 接 于 PDA 平 板 上 然 后 將 其 放 入 恒 溫 培 養(yǎng) 箱 中 培 養(yǎng) 約 3 4 d 溫 度 25 16h 光 照 8h 黑 暗 及 時(shí) 挑 取 根 段 周 圍 長(zhǎng) 出 的 菌 落 接 種 于 新 的PDA 平 板 上 置 于25 培 養(yǎng) 箱 中 恒 溫 培 養(yǎng) 10 待 純 化 的 菌 落 生 長(zhǎng)5 10d 用 無(wú) 菌 水 沖 洗 菌 絲 表 面 收 集 孢 子 或 菌 絲 懸 浮 液 采 用 稀 釋 法 進(jìn) 行 單 孢 分 離 純 化 病 原 菌 待 PDA 平 板 上 長(zhǎng) 出 單 菌 落 用 接 種 針 挑 取 少 量 菌 絲 或 孢 子 至 新 的PDA 平 板 上 培養(yǎng) 即獲得單孢或單菌絲分離物 1 2 3 致 病 性 測(cè) 定 病 原 菌 孢 子 懸 浮 液 的 配 制 將 分 離 得 到 的 病 菌 在 PDA 平 板 上 培 養(yǎng) 7 d 后 用 0 025 的 吐 溫 80 溶 液 和 無(wú) 菌 水 洗 下 孢 子 用 無(wú) 菌 的 玻 棒 攪 拌 均 勻 血 球 計(jì) 數(shù) 板 觀 察 計(jì) 數(shù) 配 制 成 濃 度為1 10 5 個(gè) mL 1 孢子懸浮液備用 首 先 對(duì) 美 洲 南 瓜 種 子 進(jìn) 行 催 芽 處 理 然 后 移 入 育 種 盤(pán) 等 幼 苗 生 長(zhǎng) 7 d 后 在 其 根 部 和 莖 基 部 制 造 微 傷 口 在 傷 口 處 噴 灑 分 離 得 到 的 濃 度 為 1 10 5 個(gè) mL 1 的 病 菌 孢 子 懸 浮 液 后 在 恒 溫 培 養(yǎng) 箱 中 繼 續(xù) 培 養(yǎng) 溫 度 25 16 h 光 照 8 h 黑 暗 以 無(wú) 菌 水 處 理 為 對(duì) 照 觀 察 并 記 錄 10 待 發(fā) 病 后 取 莖 基 部 發(fā) 病 組 織 再 次 進(jìn) 行 病 原 菌 分 離 純 化 與 鑒 定 1 2 4 病 原 菌 的 形 態(tài) 學(xué) 鑒 定 將 病 原 菌 在PDA 平 板 上 純 化 后 用 直 徑 為5mm 打 孔 器 打 取 菌 餅 接 種 于 新 的PDA 平 板 和CLA 平 板 上 每 種 病 原 菌6 次 重 復(fù) 然 后 置 于 25 恒 溫 培 養(yǎng) 箱 培 養(yǎng) 7 d 后 觀 察 記 錄 培 養(yǎng) 于PDA 平 板 上 的 病 原 菌 菌 落 形 態(tài) 特 征 及 培 養(yǎng) 皿 背 面 著 色 情 況 15 d 后 挑 取 CLA 平 板 上 的 菌 絲 在 光 學(xué) 顯 微 鏡 下 觀 察 其 大 小 型 分 生 孢 子 等 并 進(jìn) 行 拍 照 參 照LeslieJ F 等 11 的 方 法 對(duì) 病 原 菌進(jìn)行鑒定 1 2 5 病 原 菌 的 分 子 生 物 學(xué) 鑒 定 參 照 OMEGA 公司 的HPPlantDNAKit 試劑 盒說(shuō) 明書(shū) 提取 病原 菌 DNA 利 用 真 核 生 物 基 因 組 中 的rDNA ITS 區(qū) 段 通 用 引 物ITS1 5 TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3 和ITS4 5 TCCTCCGCTTATTGATATGC 3 對(duì) 病 原 菌 基 因 組DNA 進(jìn) 行PCR 擴(kuò) 增 12 PCR 擴(kuò) 增 產(chǎn) 物 經(jīng)1 2 瓊 脂 糖 凝 膠 電 泳 檢 測(cè) 后 送 至 西 安 擎 科 生 物 科 技 有 限 公 司 測(cè) 序 將 測(cè) 序 結(jié) 果 在NCBI 網(wǎng) 站 的 數(shù) 據(jù) 庫(kù) 中 比 對(duì) 測(cè) 序 結(jié) 果 在 線(xiàn) 搜 索 同 源 性 較 高 的 已 知 序 列 將 序 列 信 息 導(dǎo) 入 MEGA7 軟 件 通 過(guò) 鄰 接 法 neighbor joining 構(gòu) 建 系 統(tǒng) 聚 類(lèi) 樹(shù) 分 析 其 親 緣 關(guān) 系 根據(jù)比對(duì)結(jié)果 進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定 1 2 6 溫 度 對(duì) 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 菌 生 長(zhǎng) 和 產(chǎn) 孢 量 的 影 響 將 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 菌 接 種 于 PDA 培 養(yǎng) 基 上 分 別 置 于5 15 20 25 30 35 40 無(wú) 光 照 保 濕 培 養(yǎng)7d 每 處 理5 次 重 復(fù) 用 十 字 交 叉 法 每2d 測(cè) 量1 次 菌 落 的 直 徑 取 其 平 均 值 并 計(jì) 算 菌 絲 平 均 生 長(zhǎng) 速 度 在 培 養(yǎng) 7 d 后 用 無(wú) 菌 水 洗 下 孢 子 制 作 成 孢 子 懸 浮 液 并 將 體 積 定 容 到 10 mL 取 50 L 孢 子 懸浮液滴于血球計(jì)數(shù)板上進(jìn)行病原菌孢子計(jì)數(shù) 13 1 2 7 光 照 對(duì) 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 菌 生 長(zhǎng) 和 產(chǎn) 孢 量 的 影 響 將 已 接 種 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 菌 的PDA 培 養(yǎng) 基 24 第3 期 等 美洲南瓜枯萎病菌分離鑒定及其生物學(xué)特性 試驗(yàn)研究 分 為3 組 25 持 續(xù) 光 照 培 養(yǎng)96h 25 持 續(xù) 黑 暗 培 養(yǎng)96h 25 黑 暗12h 與 光 照12h 交 替 培 養(yǎng)96h 每 處 理 重 復(fù)5 次 按1 2 6 中 的 方 法 測(cè) 量 菌 絲 生 長(zhǎng) 和產(chǎn)孢量 1 2 8 碳 源 對(duì) 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 菌 生 長(zhǎng) 和 產(chǎn) 孢 量 的 影 響 采 用 查 彼 Czapek 培 養(yǎng) 基 14 作 為 基 礎(chǔ) 培 養(yǎng) 基 將 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 菌 分 別 接 入 以 相 同 質(zhì) 量 的 麥 芽 糖 葡 萄 糖 淀 粉 甘 露 醇 和 乳 糖 代 替 查 彼 培 養(yǎng) 基 中 的 蔗 糖 的 培 養(yǎng) 基 中 并 以 不 加 碳 源 的 培 養(yǎng) 基 作 為 對(duì) 照 室 溫 培 養(yǎng) 每 處 理 5 次 重 復(fù) 7 d 后 觀 察 菌 落 形 態(tài) 和 孢 子 形 成 情 況 并 按 照1 2 6 中 的 方 法 測(cè) 量 菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量 1 2 9 氮 源 對(duì) 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 菌 生 長(zhǎng) 和 產(chǎn) 孢 量 的 影 響 將 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 菌 分 別 接 入 以 相 同 質(zhì) 量 氮 的 硝 酸 銨 尿 素 氯 化 銨 硫 酸 銨 和 牛 肉 浸 膏 替 代 替 基 礎(chǔ) 培 養(yǎng) 基 中 的NaNO3 的 培 養(yǎng) 基 中 并 以 不 加 氮 源 的 培 養(yǎng) 基 為 對(duì) 照 室 溫 培 養(yǎng) 每 處 理 5 次 重 復(fù) 7 d 后 觀 察 菌 落 形 態(tài) 和 孢 子 形 成 情 況 并 按 照 1 2 6 中的方法測(cè)量菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量 1 2 10 pH 對(duì) 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 菌 生 長(zhǎng) 和 產(chǎn) 孢 量 的 影 響 將 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 菌 接 種 于 不 同 pH 的 PDA 培 養(yǎng) 基 上 設(shè) 置 5 個(gè) 處 理 pH 分 別 為 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 每 處 理 5 次 重 復(fù) 在 室 溫 下 培 養(yǎng) 按 1 2 6 中的方法測(cè)量菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量 2 結(jié)果與分析 2 1 美洲南瓜枯萎病田間發(fā)病癥狀 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 初 期 表 現(xiàn) 為 植 株 下 層 葉 片 下 垂 或 萎 蔫 葉 片 顏 色 稍 有 加 深 向 主 葉 脈 輕 微 皺 縮 似 缺 水 狀 圖1 b 病 株 莖 基 部 維 管 束 莖 稈 表 皮 變 褐 腐 爛 圖1 c d 出 現(xiàn) 初 期 癥 狀 后3 4d 植 株 死 亡 2 2 美洲南瓜枯萎病病原菌的分離鑒定 2 2 1 病 原 菌 的 分 離 在 PDA 培 養(yǎng) 基 上 對(duì) 20 株 美 洲 南 瓜 病 株 全 部 進(jìn) 行 分 離 與 純 化 共 得 到 16 種 分 離 物 根 據(jù) 形 態(tài) 學(xué) 特 征 歸 為 Ng 6 Ng 7 和 Ng 8 三 個(gè) 不 同 的 類(lèi) 群 其 中Ng 6 包 含3 個(gè) 分 離 物 占 總 分 離 物 的 18 75 Ng 7 包 含 11 個(gè) 分 離 物 占 總 分 離 物 的68 75 Ng 8 包 含2 個(gè) 分 離 物 占 總 分 離 物 的 12 5 分 別 選 取 三 個(gè) 類(lèi) 群 中 最 具 代 表 性 的 Ng 6 1 Ng 7 1 和Ng 8 1 用于后續(xù)試驗(yàn) 2 2 2 致 病 性 測(cè) 定 從 2 2 1 分 離 得 到 的 Ng 6 1 Ng 7 1 和 Ng 8 1 進(jìn) 行 純 化 分 別 用 純 化 后 的 菌 株 回 接 到 美 洲 南 瓜 相 同 品 種 健 康 幼 苗 圖 2 其 中 Ng 7 1 的 處 理 組 美 洲 南 瓜 在7d 后 發(fā) 病 且 表 現(xiàn) 為 葉 片 和 莖 稈 萎 蔫 失 水 莖 基 部 變 褐 對(duì) 照 組 均 未 發(fā) 病 且 根 系 發(fā) 達(dá) 根 據(jù) 柯 赫 氏 法 則 對(duì) 接 種 病 原 菌 后 發(fā) 病 植 株 的 病 健 交 界 處 再 次 進(jìn) 行 組 織 分 離 和 純 化 得 到 的 病 原 菌 與 Ng 7 1 一 致 故 初 次 分 離 到 的 Ng 7 1 為美洲南瓜枯萎病的致病菌 2 2 3 病 原 菌 的 形 態(tài) 學(xué) 鑒 定 將 純 化 后 的 Ng 7 1 菌 株 在PDA 培 養(yǎng) 基 上 進(jìn) 行 培 養(yǎng) 在 培 養(yǎng)5 7d 后 可 形 成 邊 緣 較 整 齊 的 圓 形 單 菌 落 菌 落 正 面 為 白 色 或 紫 色 突 起 絮 狀 絨 毛 狀 菌 絲 體 纖 細(xì) 背 面 產(chǎn) 生 紫 色 色 素 圖 3 a b 在 CLA 培 養(yǎng) 基 上 進(jìn) 行 培 養(yǎng) 15d 后 觀 察 到 病 原 菌 菌 株 的 分 生 孢 子 有 兩 種 形 態(tài) 小 型 分 生 孢 子 數(shù) 量 居 多 呈 橢 圓 形 卵 形 多 為 單 孢 大 小 為 5 5 15 0 3 0 6 8 m 圖3 c 大 型 分 生 孢 子 數(shù) 量 較 少 呈 鐮 刀 形 中 間 略 彎 曲 兩 端 細(xì) 胞 稍 尖 多 數(shù) 為 3 隔 大 小 為 17 8 35 5 4 0 5 8 m 圖 3 c 根 據(jù) 菌 落 特 征 及 病 原 菌 分 生 孢 子 的 形 狀 初 步 鑒 定 分 離 純 化 的 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 的 病 原 為 尖孢鐮孢菌F oxysporum 注 a 健 康 植 株 b 萎 蔫 癥 狀 c 主 根 表 皮 腐 爛 d 莖 基 部 腐 爛癥狀 圖1 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 的 田 間 發(fā) 病 癥 狀 a b d c 注 a 對(duì)照 b 菌株Ng 7 1 接種 圖2 病 原 菌 對(duì) 美 洲 南 瓜 致 病 性 測(cè) 定 接 種7d 李金峰 a a b 25 中 國(guó) 瓜 菜 第33 卷 試驗(yàn)研究 2 2 4 分 子 生 物 學(xué) 鑒 定 將Ng 7 1 菌 株 的ITS 序 列 的 測(cè) 序 結(jié) 果 提 交 至 GenBank 獲 得 注 冊(cè) 號(hào) 為 MN814027 通 過(guò) 與NCBI 網(wǎng) 站 的 數(shù) 據(jù) 庫(kù) 進(jìn) 行 比 對(duì) 分 析 結(jié) 果 顯 示 該 序 列 與 尖 孢 鐮 孢 菌 F oxysporum 的 相 似 性 達(dá) 到 了99 建 立 系 統(tǒng) 發(fā) 育 樹(shù) 圖4 結(jié) 果 表 明 Ng 7 1 菌 株 與 尖 孢 鐮 孢 菌 聚 在 同 一 分 支 親 緣 關(guān) 系 最 近 從 而 確 定 從 甘 肅 省 武 威 地 區(qū) 采 集 的 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 病 株 的 病 原 菌 為 尖 孢 鐮 孢 菌F oxysporum a b c 注 a PDA 菌落正面 b PDA 菌落背面 c 大小型分生孢子 CLA 培養(yǎng)基 圖3 病 原 菌 形 態(tài) 學(xué) 鑒 定 2 3 溫 度 對(duì) 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 菌 生 長(zhǎng) 和 產(chǎn) 孢 量 的 影響 不 同 的 溫 度 對(duì) 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 菌 的 菌 株 生 長(zhǎng) 和 產(chǎn) 孢 量 具 有 一 定 的 影 響 表 1 菌 株 在 10 35 范 圍 內(nèi) 均 能 生 長(zhǎng) 產(chǎn) 孢 在20 30 的 溫 度 范 圍 內(nèi) 菌 絲 生 長(zhǎng) 較 好 其 中 生 長(zhǎng) 最 快 產(chǎn) 孢 量 也 最 多 的 溫 度 為25 該 菌 在 溫 度 低 于5 或 高 于40 的 條 件 下不生長(zhǎng)也不產(chǎn)生分生孢子 2 4 光 照 對(duì) 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 菌 生 長(zhǎng) 和 產(chǎn) 孢 量 的 影響 該 菌 在25 條 件 培 養(yǎng)24h 后 進(jìn) 行 不 同 光 照 處 理 后 菌 絲 生 長(zhǎng) 和 產(chǎn) 孢 量 呈 現(xiàn) 出 一 定 的 差 異 表2 其 中 12 h 光 暗 交 替 培 養(yǎng) 96 h 的 菌 絲 生 長(zhǎng) 速 率 最 快 產(chǎn) 孢 量 最 多 持 續(xù) 黑 暗 菌 絲 生 長(zhǎng) 速 率 最 慢 持 續(xù)光照產(chǎn)孢量最少 2 5 不 同 碳 源 對(duì) 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 菌 生 長(zhǎng) 和 產(chǎn) 孢 量 的影響 該 病 原 菌 在 不 同 的 碳 源 培 養(yǎng) 基 上 均 能 生 長(zhǎng) 并 且 都 與 對(duì) 照 差 異 顯 著 表 3 其 中 最 適 碳 源 為 淀 圖4 基 于ITS 序 列 建 立 菌 株Ng 7 1 系 統(tǒng) 發(fā) 育 樹(shù) 注 同列不同小寫(xiě)字母表示在0 05 水平差異顯著 下同 表1 溫 度 對(duì) 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 菌 菌 絲 生 長(zhǎng) 及 產(chǎn) 孢 量 的 影 響 溫度 5 15 20 25 30 35 40 菌絲生長(zhǎng)速率 cm d 1 0 00f 0 69e 0 84d 1 15a 0 94c 0 63f 0 00f 產(chǎn)孢量 10 6 個(gè) mL 1 0 00d 4 83c 4 98c 13 50a 6 58b 6 55b 0 00d 26 第3 期 等 美洲南瓜枯萎病菌分離鑒定及其生物學(xué)特性 試驗(yàn)研究 粉 病 原 菌 生 長(zhǎng) 速 率 最 快 產(chǎn) 孢 量 最 多 而 該 菌 在 葡 萄 糖 培 養(yǎng) 基 上 生 長(zhǎng) 速 率 最 慢 且 產(chǎn) 孢 量 最 少 在 對(duì) 照培養(yǎng)基上菌絲幾乎不生長(zhǎng) 2 6 不 同 氮 源 對(duì) 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 菌 生 長(zhǎng) 和 產(chǎn) 孢 量 的影響 該 病 原 菌 在 不 同 的 氮 源 培 養(yǎng) 基 上 均 能 生 長(zhǎng) 產(chǎn) 孢 但 不 同 氮 源 之 間 存 在 一 定 的 差 異 表 4 其 中 在 硝 酸 鈉 和 尿 素 培 養(yǎng) 基 上 菌 絲 生 長(zhǎng) 速 率 較 快 且 無(wú) 顯 著 性 差 異 在 硫 酸 銨 培 養(yǎng) 基 上 菌 絲 生 長(zhǎng) 最 慢 在 牛 肉 浸 膏 培 養(yǎng) 基 上 產(chǎn) 孢 量 最 多 與 其 他 氮 源 差 異 顯 著 在 硫 酸 銨 尿 素 和 硝 酸 銨 培 養(yǎng) 基 上 產(chǎn) 孢 量 較 少 且 無(wú) 明 顯 差 異 缺 氮 時(shí) 菌 絲 生 長(zhǎng) 較 快 但 只 是 稀 疏 的氣生菌絲 幾乎不產(chǎn)孢 2 7 pH 對(duì)美洲南瓜枯萎病菌生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響 該 病 原 菌 在pH 為5 0 9 0 范 圍 內(nèi) 均 能 生 長(zhǎng) 產(chǎn) 孢 表5 其 中pH 為8 0 時(shí) 菌 絲 生 長(zhǎng) 最 快 產(chǎn) 孢 量 最 多 而pH 為5 0 時(shí) 菌 絲 生 長(zhǎng) 速 率 最 慢 產(chǎn) 孢 量 最 少 說(shuō) 明 該 菌 在 中 性 及 偏 堿 性 條 件 下 生 長(zhǎng) 快 容 易 產(chǎn) 孢 3 討 論 研 究 表 明 瓜 類(lèi) 香 蕉 茄 子 向 日 葵 等 植 物 的 枯 萎 病 均 由 尖 孢 鐮 孢 菌 侵 染 所 致 15 16 該 病 菌 具 有 不 同 的 專(zhuān) 化 型 17 據(jù) 報(bào) 道 引 起 瓜 類(lèi) 枯 萎 病 的 致 病 菌 至 少 存 在8 個(gè) 專(zhuān) 化 型 18 筆 者 對(duì) 采 集 到 的 甘 肅 省 武 威 地 區(qū) 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 進(jìn) 行 病 原 菌 的 分 離 純 化 和 鑒 定 結(jié) 合 菌 落 形 態(tài) 特 征 顯 微 特 征 及ITS 分 子 鑒 定 結(jié) 果 對(duì) 病 原 菌 進(jìn) 行 鑒 定 確 定 引 起 甘 肅 省 武 威 地 區(qū) 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 的 病 原 為 尖 孢 鐮 孢 菌 F oxysporum 病 原 菌 的 生 物 學(xué) 特 性 研 究 是 病 原 菌 的 基 礎(chǔ) 研 究 尤 其 為 抗 病 育 種 和 生 物 防 治 研 究 提 供 理 論 依 據(jù) 本 研 究 結(jié) 果 表 明 該 菌 在10 35 范 圍 內(nèi) 均 能 生 長(zhǎng) 產(chǎn) 孢 25 為 最 適 生 長(zhǎng) 溫 度 菌 絲 生 長(zhǎng) 最 佳 的 光 照 條 件 為12h 光 暗 交 替 最 適 碳 源 為 淀 粉 這 與 沈 文 淵 19 報(bào) 道 的 尖 孢 鐮 孢 菌 黃 瓜 專(zhuān) 化 型 尖 孢 鐮 孢 菌 冬 瓜 專(zhuān) 化 型 尖 孢 鐮 孢 菌 西 瓜 專(zhuān) 化 型 尖 孢 鐮 孢 菌 苦 瓜 專(zhuān) 化 型 的 最 適 溫 度 光 照 和 碳 源 的 研 究 結(jié) 果 相 似 根 據(jù) 肖 昌 華 等 20 的 報(bào) 道 苦 瓜 枯 萎 病 病 原 菌 的 生 長(zhǎng) 最 適 pH 為 6 3 產(chǎn) 孢 最 適 pH 為 6 3 8 5 而 本 試 驗(yàn) 中 病 原 菌 菌 絲 生 長(zhǎng) 及 產(chǎn) 孢 最 適 pH 為 8 分 析 原 因 可 能 是 因 為 不 同 的 專(zhuān) 化 型 菌 對(duì) 生 長(zhǎng) 所 需 的 酸 堿 度 不 同 以 及 病 原 菌 分 離 地 的 土 壤 酸 堿 度 有 關(guān) 但 在 總 體 上 來(lái) 看 尖 孢 鐮 孢 菌 適 合 在 中 性 及 偏 堿 性 條 件 下 生 長(zhǎng) 在 沈 文 淵 19 的 報(bào) 道 中4 種 尖 孢 鐮 孢 菌 專(zhuān) 化 型 的 最 適 氮 源 都 為 蛋 白 胨 而 本 試 驗(yàn) 中 病 原 菌 生 產(chǎn) 速 率 最 好 的 氮 源 為 硝 酸 鈉 和 尿 素 產(chǎn) 孢 量 最 多 的 是 牛 肉 浸 膏 分 析 原 因 可 能 是 因 為 不 同 專(zhuān) 化 型 菌 之 間 存 在 著 對(duì) 氮 源 的 利 用 有 一 定 的 差 異 同 時(shí) 說(shuō) 明 該 菌 在 菌 絲 的 生 長(zhǎng) 和 產(chǎn) 孢 過(guò) 程 中 不 同 的 氮 源 起 著不同的作用 筆 者 鑒 定 了 甘 肅 省 武 威 地 區(qū) 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 的 病 原 菌 為 尖 孢 鐮 孢 菌 F oxysporum 并 對(duì) 其 生 物 學(xué) 特 性 進(jìn) 行 了 測(cè) 定 但 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 病 原 菌 是 否 存 在 專(zhuān) 化 型 以 及 該 病 原 菌 的 傳 播 途 徑 等 問(wèn) 題 有 待 于進(jìn)一步研究 表2 光 照 對(duì) 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 菌 菌 絲 生 長(zhǎng) 及 產(chǎn) 孢 量 的 影 響 光照條件 持續(xù)光照 持續(xù)黑暗 12h 光暗交替 菌絲生長(zhǎng)速率 cm d 1 1 53b 1 16c 1 59a 產(chǎn)孢量 10 6 個(gè) mL 1 4 51c 7 15b 9 62a 表5 不 同pH 對(duì) 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 菌 菌 絲 生 長(zhǎng) 及 產(chǎn) 孢 量 的 影 響 pH 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 菌絲生長(zhǎng)速率 cm d 1 0 59c 0 64b 0 78b 0 81a 0 66b 產(chǎn)孢量 10 6 個(gè) mL 1 1 28d 1 55c 1 90b 2 56a 1 55c 李金峰 表3 不 同 碳 源 對(duì) 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 菌 菌 絲 生 長(zhǎng) 及 產(chǎn) 孢 量 的 影 響 碳源 CK 蔗糖 葡萄糖 麥芽糖 淀粉 乳糖 甘露醇 菌絲生長(zhǎng)速率 cm d 1 0 55f 0 94d 0 72e 1 06cd 1 21a 1 10ab 1 09bc 產(chǎn)孢量 10 6 個(gè) mL 1 0 45c 2 80b 2 75b 3 00b 3 70a 3 15ab 3 00b 表4 不 同 氮 源 對(duì) 美 洲 南 瓜 枯 萎 病 菌 菌 絲 生 長(zhǎng) 及 產(chǎn) 孢 量 的 影 響 氮源 CK 尿素 硫酸銨 硝酸銨 氯化銨 牛肉浸膏 硝酸鈉 菌絲生長(zhǎng)速率 cm d 1 0 88b 1 09a 0 40e 0 69d 0 56e 0 77c 1 07a 產(chǎn)孢量 10 6 個(gè) mL 1 0 00e 1 32d 1 37d 1 36d 3 75b 6 63a 1 90c 27 中 國(guó) 瓜 菜 第33 卷 試驗(yàn)研究 參考文獻(xiàn) 1 TEPPNER H Cucurbita pepo Cucurbitaceae history seed coat types thin coated seeds and their genetics J PHYTON AnnalesReiBotanicae 2000 40 1 1 42 2 鄒 伶 威 李 柱 剛 韓 俊 巖 等 裸 仁 南 瓜 研 究 進(jìn) 展 概 述 J 中 國(guó)瓜菜 2012 25 6 42 44 3 BEZOLDTN MATHEWS D LOYB J et al Molecular anal ysis of the hull less seed trait in pumpkin expression profiles of genes related to seed coat development J Seed Science Research 2005 15 205 217 4 王 拱 辰 葉 琪 銘 鐮 刀 菌 在 生 物 防 治 中 的 作 用 J 生 物 防 治 通報(bào) 1990 6 2 80 84 5 王 萍 肖 艷 曾 敬 富 等 瓜 類(lèi) 枯 萎 病 的 識(shí) 別 與 診 斷 及 綜 合 防 控技術(shù)初報(bào) J 現(xiàn)代園藝 2010 2 46 48 6 南 宇 航 朱 子 成 王 學(xué) 征 等 甜 瓜 種 質(zhì) 資 源 苗 期 對(duì) 枯 萎 病 和 白粉病的抗性評(píng)價(jià) J 中國(guó)蔬菜 2016 35 1 37 44 7 周 小 林 陳 功 友 邵 元 建 等 甜 瓜 枯 萎 病 菌 Fusarium oxysporum 專(zhuān) 化 型 的 初 步 研 究 J 植 物 保 護(hù) 2008 34 6 80 84 8 徐 彥 剛 賀 振 李 瑞 等 黃 瓜 枯 萎 病 研 究 進(jìn) 展 J 中 國(guó) 瓜 菜 2018 31 6 1 6 9 呂 佩 珂 李 明 遠(yuǎn) 吳 鉅 文 等 中 國(guó) 蔬 菜 病 蟲(chóng) 原 色 圖 譜 M 北 京 農(nóng)業(yè)出版社 1992 10 董 鮮 馬 曉 惠 陳 傳 嬌 等 三 七 根 腐 病 尖 孢 鐮 刀 菌 分 離 鑒 定 及致病作用研究 J 中藥材 2018 41 1 8 12 11 LESLIE J F SUMMERELL B A The Fusarium laboratory manual M Ames IA USA BlackwellPub 2006 12 郭 煒 西 北 地 區(qū) 冬 小 麥 普 通 根 腐 病 和 莖 基 腐 病 病 原 鑒 定 及 種 質(zhì)資源抗性篩選 D 蘭州 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 2018 13 周 慧 敏 謝 學(xué) 文 石 延 霞 等 大 白 菜 褐 腐 病 莖 基 腐 病 的 病 原菌鑒定 J 中國(guó)蔬菜 2012 31 22 70 74 14 楊 克 澤 南 瓜 葉 枯 病 病 原 菌 鑒 定 及 品 種 抗 病 性 研 究 論 文 D 蘭州 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 2009 15 MUSHTAQ M Pathogenecity and transmission studies of seed borne Fusarium species sec Liseola and Sporo trich iella in sunflower J Pakistan Journal of Botany 2006 38 2 487 492 16 張 宏 宇 陳 霞 左 洪 波 等 中 國(guó) 現(xiàn) 行 推 廣 黃 瓜 品 種 及 種 質(zhì) 資 源 對(duì) 枯 萎 病 的 抗 病 性 評(píng) 價(jià) J 東 北 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 學(xué) 報(bào) 2010 41 5 36 41 17 胡 海 嬌 魏 慶 鎮(zhèn) 王 五 宏 等 茄 子 枯 萎 病 研 究 進(jìn) 展 J 分 子 植物育種 2018 16 8 2630 2637 18 符 冬 妹 陳 漢 清 郭 素 霞 等 香 蕉 枯 萎 鐮 刀 菌 致 病 性 快 速 測(cè) 定 方 法 的 建 立 J 基 因 組 學(xué) 與 應(yīng) 用 生 物 學(xué) 2015 34 2 408 416 19 沈 文 淵 瓜 類(lèi) 枯 萎 病 菌 四 種 專(zhuān) 化 型 的 生 物 學(xué) 特 性 及 瓜 類(lèi) 枯 萎 病生物防治研究 D 成都 四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 2012 20 肖 昌 華 余 席 茂 何 玉 英 等 苦 瓜 枯 萎 病 的 生 物 學(xué) 特 性 研 究 J 植物保護(hù) 2008 34 2 83 85 28