中 中 國 國 瓜 瓜 菜 菜 2020 33 2 42 47 試驗研究 收 稿 日 期 2019 10 29 修 回 日 期 2019 12 11 基 金 項 目 貴 州 省 農(nóng) 科 院 專 項 黔 農(nóng) 科 院 院 專 項 2015 25 作 者 簡 介 牟 玉 梅 女 助 理 研 究 員 主 要 從 事 辣 椒 育 種 與 栽 培 研 究 工 作 E mail gzzymymei 通 信 作 者 范 高 領(lǐng) 男 助 理 研 究 員 主 要 從 事 園 藝 作 物 栽 培 與 育 種 研 究 E mail fan gaoling 辣 椒 種 子 拮 抗 青 枯 病 菌 內(nèi) 生 細(xì) 菌 的 分 離 鑒 定 牟 玉 梅 范 高 領(lǐng) 邢 丹 貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院辣椒研究所 貴陽 550006 摘 要 為 了 探 究 抗 青 枯 病 辣 椒 品 種 種 子 中 拮 抗 青 枯 病 菌 內(nèi) 生 細(xì) 菌 的 種 群 組 成 及 其 在 青 枯 病 防 治 中 可 能 發(fā) 揮 的 生 態(tài) 學(xué) 功 能 從 抗 青 枯 病 辣 椒 品 種 種 子 中 分 離 篩 選 出 拮 抗 青 枯 病 菌 的 內(nèi) 生 細(xì) 菌 對 其 進(jìn) 行 抑 菌 廣 譜 性 分 析 測 定 其 對 青 枯 病 的 生 防 效 果 結(jié) 果 表 明 從 抗 青 枯 病 辣 椒 品 種 種 子 中 分 離 出14 株 內(nèi) 生 細(xì) 菌 通 過 平 板 對 峙 篩 選 出6 株 拮 抗 青 枯 病 菌 的 內(nèi) 生 細(xì) 菌 初 步 鑒 定 它 們 分 別 為 假 單 胞 菌 Pseudomonas 蒼 白 桿 菌 Ochrobactrum 和 微 桿 菌 Microbac terium 對6 株 內(nèi) 生 細(xì) 菌 進(jìn) 行 抑 菌 廣 譜 性 研 究 所 有 內(nèi) 生 細(xì) 菌 均 至 少 對1 種 病 原 真 菌 有 拮 抗 作 用 將6 株 內(nèi) 生 細(xì) 菌 的 菌 懸 液 分 別 對 辣 椒 種 子 進(jìn) 行 浸 種 處 理 后 育 苗 辣 椒 苗 抗 青 枯 病 能 力 顯 著 提 升 辣 椒 種 子 中 拮 抗 青 枯 病 菌 的 內(nèi) 生 細(xì) 菌 具 有 多 樣 性 用 其 菌 懸 液 處 理 辣 椒 種 子 后 植 株 對 青 枯 病 具 有 較 好 的 抗 病 能 力 為 開 展 辣 椒 青 枯 病 微 生 物 防 治 提供了理論依據(jù)及菌種資源 關(guān)鍵詞 辣椒 種子 內(nèi)生細(xì)菌 拮抗作用 生物防治 中圖分類號 S641 3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1673 2871 2020 02 042 06 Isolation and identification of endophytic bacteria against bacterial wilt inpepperseeds MOUYumei FANGaoling XINGDan PepperResearchInstitute GuizhouAcademy of Agricultural Sciences Guizhou550006 Guiyang China Abstract This experiment is to investigate the population composition of antagonistic endophytic bacteria and its potential ecological function in the prevention and treatment of green dead pepper varieties To isolate and screen the endophytic bacteria that antagonize the green dead bacteria from the seeds of pepper varieties with anti green dead disease and to analyze their antimicrobial spectrum to determine their effect on the prevention of green dead disease Fourteen strains of endophytic bacteria were isolated from the seeds of capsicum varieties resistant to bacterial wilt Six strains of endophytic bacteria were screened out through plate confrontation They were identified as Pseudomonas Pallidobacterium and Microbacterium Six strains of endophytic bacteria were studied for broad spectrum bacteriostasis Allendophyticbacteriahadantagonisticeffectonatleastonekindofpathogenicfungi Sixstrainsofendophyticbacteria were soaked in pepper seeds and then cultured The ability of pepper seedlings to resist bacterial wilt was significantly improved Theendophyticbacteriathatantagonizegreenpepperbacteriainpepperseedsarediverse Aftertreatingpepper seeds with their suspension the plants have a good effect on green dead disease and provide theoretical basis and bacterialresourcesforthepreventionandtreatmentofpeppergreendeaddisease Keywords Pepper Seeds Endophyticbacteria Antagonisticeffect Biologicalcontrol 辣 椒 是 我 國 種 植 面 積 最 大 的 蔬 菜 作 物 1 辣 椒 青 枯 病 是 我 國 各 辣 椒 主 產(chǎn) 區(qū) 普 遍 發(fā) 生 的 一 種 毀 滅 性 土 傳 病 害 防 治 難 度 較 大 2 采 用 常 規(guī) 方 法 選 育 抗 病 品 種 存 在 選 育 周 期 長 抗 性 單 一 的 缺 點 采 用 分 子 育 種 技 術(shù) 其 過 程 非 常 復(fù) 雜 且 在 辣 椒 育 種 中 成 功 應(yīng) 用 的 還 不 多 3 采 用 化 學(xué) 藥 劑 又 涉 及 到 食 品 安 全 性 和 環(huán) 境 安 全 性 安 全 評 價 問 題 內(nèi) 生 菌 生 物 防 治 可 以 較 好 地 解 決 上 述 問 題 4 不 僅 可 以 促 進(jìn) 作 物 生 長 增 產(chǎn) 增 收 還 可 以 提 高 植 物 抗 病 性 改 善 品 質(zhì) 以 及 改 良 土 壤 國 內(nèi) 外 科 研 人 員 針 對 辣 椒 青 枯 病 生 物 防 治 做 了 不 少 研 究 篩 選 了 很 多 新 的 防 控 辣 椒 青 枯 病 的 生 防 菌 但 還 沒 有 發(fā) 現(xiàn) 一 個 成 功 應(yīng) 用 于 大 批 量 生 產(chǎn) 和 推 廣 且 能 較 好 防 治 辣 椒 青 枯 病 的 生 防菌 42 第2 期 等 辣椒種子拮抗青枯病菌內(nèi)生細(xì)菌的分離 鑒定 試驗研究 牟玉梅 內(nèi) 生 菌 是 一 類 生 活 在 植 物 體 內(nèi) 且 對 植 物 無 明 顯 不 利 影 響 的 微 生 物 的 總 稱 5 植 物 攜 帶 豐 富 的 內(nèi) 生 菌 資 源 這 些 微 生 物 對 植 物 的 生 長 發(fā) 育 代 謝 過 程 和 抗 逆 抗 病 等 性 狀 產(chǎn) 生 重 要 影 響 種 子 作 為 植 物 物 種 延 續(xù) 的 重 要 繁 殖 器 官 是 植 物 內(nèi) 生 菌 垂 直 傳 播 的 重 要 方 式 種 子 內(nèi) 生 菌 與 植 物 經(jīng) 過 長 期 穩(wěn) 定 的 進(jìn) 化 選 擇 相 比 于 從 其 他 植 物 器 官 中 分 離 的 內(nèi) 生 菌 更 易 長 期 定 殖 生 存 也 更 易 演 化 出 與 宿 主 互 惠 互 利 的 代 謝 途 徑 6 種 子 中 的 內(nèi) 生 菌 防 效 具 有 較 為 穩(wěn) 定 持 久 的 優(yōu) 點 可 作 為 拮 抗 菌 劑 的 菌 種 資 源 具 有 很好的應(yīng)用前景 因 此 筆 者 以 抗 青 枯 病 辣 椒 品 種 的 種 子 為 材 料 從 中 分 離 篩 選 出 對 辣 椒 青 枯 病 菌 有 較 強 拮 抗 作 用 的 內(nèi) 生 菌 株 并 鑒 定 其 分 類 地 位 開 展 抑 菌 廣 譜 性 研 究 以 期 豐 富 現(xiàn) 有 的 生 防 菌 種 資 源 為 辣 椒 種 子 內(nèi) 生 細(xì) 菌 及 其 生 物 防 治 的 研 究 提 供 一 定 的 理 論 基礎(chǔ) 1 材料與方法 1 1 材料 優(yōu) 質(zhì) 地 方 辣 椒 種 質(zhì) 資 源 18 份 由 貴 州 省 辣 椒 研 究 所 在 多 年 連 作 重 茬 的 辣 椒 地 自 然 誘 發(fā) 篩 選 出 的 具 有 較 好 綜 合 抗 病 性 的 辣 椒 種 質(zhì) 青 枯 病 菌 為 貴 州 省 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 院 辣 椒 研 究 所 保 存 的 茄 科 雷 爾 氏 菌 株 EP1 登 錄 號 CP015116 1 培 養(yǎng) 基 為 NA 固 體培養(yǎng)基 NA 液體培養(yǎng)基 固體LB 培養(yǎng)基 1 2 方法 1 2 1 辣 椒 抗 青 枯 病 品 種 篩 選 鑒 定 對18 份 地 方 優(yōu) 質(zhì) 辣 椒 種 質(zhì) 資 源 進(jìn) 行 苗 期 青 枯 病 抗 性 表 型 鑒 定 進(jìn) 一 步 確 認(rèn) 材 料 抗 性 水 平 2016 年10 月 在 貴 州 省 辣 椒 研 究 所 貴 陽 試 驗 基 地 進(jìn) 行 將 供 試 材 料 采 用 160 穴 漂 浮 育 苗 盤 進(jìn) 行 育 苗 每 個 品 種 育 苗160 株 待 幼 苗 長 至5 6 片 真 葉 時 選 擇 健 壯 的 植 株 移 栽 至 10cm 10cm 的 塑 料 杯 內(nèi) 數(shù) 量 在70 106 株 之 間 完 全 隨 機 排 列 置 于 26 2 人 工 氣 候 室 繼 續(xù) 生 長 正 常 肥 水 管 理 待 長 到 7 8 片 葉 期 采 用 傷 根 灌 根 接 種 法 接 種 青 枯 病 菌 進(jìn) 一 步 篩 選 高 抗 辣 椒 青 枯 病品種 青 枯 病 病 情 調(diào) 查 方 法 接 種 后 每 天 調(diào) 査 和 記 錄 辣 椒 植 株 的 發(fā) 病 情 況 待 病 情 穩(wěn) 定 后 按 病 情 分 級 標(biāo) 準(zhǔn) 統(tǒng) 計 發(fā) 病 情 況 計 算 發(fā) 病 率 和 病 情 指 數(shù) 參 試 各 種 質(zhì) 對 青 枯 病 的 抗 性 表 型 最 終 評 價 以 第30 天 的 發(fā) 病 率 和 病 情 為 準(zhǔn) 青 枯 病 病 情 分 級 標(biāo) 準(zhǔn) 參 照 劉 富 中 7 黨 峰 峰 8 等 對 青 枯 病 的 分 級 標(biāo) 準(zhǔn) 表1 2 發(fā) 病 率 發(fā) 病 株 數(shù) 接 種 株 數(shù) l00 病 情 指 數(shù) DI 病 級 該 病 級 株 數(shù) 最 髙 病 級 接 種 株數(shù) l00 1 2 2 辣 椒 種 子 內(nèi) 生 細(xì) 菌 的 分 離 純 化 保 存 種 子 消 毒 將 辣 椒 種 子 在 70 酒 精 中 浸 泡 5 min 0 1 升 汞 消 毒40s 然 后 轉(zhuǎn) 入 到 體 積 分 數(shù)2 5 的 次 氯 酸 鈉 溶 液 中 浸 泡5min 最 后 用 無 菌 水 沖 洗3 次 將 最 后 一 次 沖 洗 用 的 無 菌 水 涂 布 分 離 培 養(yǎng) 基 營 養(yǎng) 瓊脂平板 置于30 培養(yǎng)3d 驗證表面消毒情況 內(nèi) 生 細(xì) 菌 分 離 純 化 保 存 將 徹 底 消 毒 后 的 種 子置于無 菌研缽中 加入質(zhì)量 分?jǐn)?shù)0 85 的NaCl 溶 液 充 分 研 磨 后 吸 取1mL 上 清 液 進(jìn) 行 梯 度 稀 釋 營 養(yǎng) 瓊 脂 平 板 涂 布 30 培 養(yǎng) 箱 內(nèi) 培 養(yǎng)2d 挑 取 不 同 形 態(tài) 顏 色 大 小 的 菌 落 劃 線 純 化3 次 直 到 平 板 上 菌 落 的 顏 色 大 小 和 形 態(tài) 完 全 一 致 然 后 將 純 化 后 的 菌 株 保 存 在 含 有 20 甘 油 的 菌 種 保 藏 管 中 80 凍存 1 2 3 內(nèi) 生 細(xì) 菌 對 青 枯 病 菌 的 抑 制 作 用 測 定 采 用 紙 蝶 法 測 定 內(nèi) 生 細(xì) 菌 對 青 枯 病 菌 的 抑 制 作 用 篩 選 對 青 枯 病 菌 具 有 拮 抗 作 用 的 內(nèi) 生 細(xì) 菌 吸 取1mL 濃 度 為 5 l0 8 cfu mL 1 的 青 枯 病 菌 懸 浮 液 放 入 滅 菌 培養(yǎng)皿中 將45 NA 培養(yǎng)基倒入 培養(yǎng)皿中與 菌液 搖 勻 待 冷 卻 后 對 稱 放 置2 張5mm 滅 菌 濾 紙 片 距 離 培 養(yǎng) 皿 中 心 距 離 約 為25mm 每 張 濾 紙 片 上 滴 入 內(nèi) 生 細(xì) 菌5 L 每 處 理 重 復(fù)3 皿 以 無 菌 水 為 對 照 置 于 28 30 恒 溫 箱 中 培 養(yǎng) 48 h 觀 察 抑 菌 效 果 拮 抗 作 用 強 弱 以 表 示 表 示 拮 抗 活 性 很 強 抑 菌 帶 寬 度 大 于8 0mm 表 示 拮 抗 活 性 中 等 強 度 抑 菌 帶 寬 度 在3 0 8 0mm 之 間 表 示 拮 病情級別 0 1 2 3 4 5 植株地上部分癥狀 植株表現(xiàn)正常 植株有1 片葉出現(xiàn)萎蔫 植株有2 3 片葉出現(xiàn)萎蔫 除頂端1 2 片葉外 其他葉片全部萎蔫 除生長點外 其他葉片全部萎蔫 植株整株發(fā)生枯萎 或者植株死亡 表1 辣椒青枯病病情分級 表2 辣椒青枯病的抗性評價標(biāo)準(zhǔn) 病情指數(shù) 0 DI 15 15 DI 30 30 DI 45 45 DI 60 60 DI 100 抗性水平 高抗 HR 抗病 R 中抗 MR 感病 S 高感 HS 43 中 國 瓜 菜 第33 卷 試驗研究 抗 活 性 弱 或 無 活 性 抑 菌 帶 寬 度 小 于3 0mm 或 者 無抑菌帶 病菌正常生長 且可覆蓋內(nèi)生細(xì)菌 1 2 4 拮 抗 青 枯 病 菌 內(nèi) 生 細(xì) 菌 的 鑒 定 對 青 枯 病 菌 具 有 拮 抗 作 用 的 內(nèi) 生 細(xì) 菌 進(jìn) 行 形 態(tài) 學(xué) 和 分 子 生 物學(xué)鑒定 形 態(tài) 學(xué) 鑒 定 在 固 體 LB 培 養(yǎng) 基 上 劃 線 接 種 待 鑒 定 菌 株 28 恒 溫 培 養(yǎng)24h 記 錄 菌 落 的 顏 色 形 狀 透 明 度 以 及 表 面 邊 緣 隆 起 程 度 等 性 狀 對 細(xì) 菌 進(jìn) 行 革 蘭 氏 染 色 和 形 態(tài) 觀 察 對 種 屬 進(jìn) 行 初 步 鑒 定 分 子 生 物 學(xué) 鑒 定 對 菌 株 16S rDNA 序 列 進(jìn) 行 測 定 使 用 細(xì) 菌 基 因 提 取 試 劑 盒 進(jìn) 行 基 因 組DNA 提 取 以 提 取 的 待 鑒 定 菌 株 DNA 為 模 板 以 細(xì) 菌 的 16S 引 物 序 列 27f 1492 進(jìn) 行 內(nèi) 生 細(xì) 菌 的 16S rDNA 擴 增 PCR 以30 L 的 體 系 進(jìn) 行 體 系 如 下 H2O17 8 L Buffer3 L dNTP2 L Primer13 L Primer2 3 L DNA 模 板 1 L 酶 0 2 L PCR 反 應(yīng) 條 件 為 95 預(yù) 變 性3min 循 環(huán)1 次 95 變 性 30 s 55 退 火 30 s 72 延 伸 2 min 循 環(huán) 35 次 最 后 72 延 伸 10 min 用 1 的 瓊 脂 糖 凝 膠 電 泳 檢 測 PCR 擴 增 結(jié) 果 利 用 凝 膠 成 像 系 統(tǒng) 觀 察 PCR 擴 增 結(jié) 果 將 辣 椒 種 子 內(nèi) 生 細(xì) 菌PCR 擴 增 結(jié) 果 送 往 北 京 六 合 華 大 基 因 科 技 有 限 公 司 武 漢 分 公 司 進(jìn) 行 分 子 鑒 定 將 菌 株 的 測 序 結(jié) 果 與GenBank 數(shù) 據(jù) 庫 中的序列進(jìn)行比對 1 2 5 拮 抗 青 枯 病 菌 內(nèi) 生 細(xì) 菌 的 抑 菌 廣 譜 性 研 究 對 已 篩 選 出 的 拮 抗 內(nèi) 生 細(xì) 菌 采 用 平 板 對 峙 生 長 法 測 定 其 對 辣 椒 炭 疽 病 疫 病 立 枯 病 病 菌 的 拮 抗作用 將 內(nèi) 生 菌 株 劃 線 活 化 培 養(yǎng) 后 挑 取 單 菌 落 接 種 于 20 mLLB 培 養(yǎng) 液 中 置 于 30 搖 床 中 200 r min 1 振 蕩 培 養(yǎng) 過 夜 辣 椒 立 枯 炭 疽 疫 病 病 原 菌 接 種 到 PDA 培 養(yǎng) 基 平 板 上 于28 恒 溫 條 件 下 培 養(yǎng) 待 菌 絲長滿整個培養(yǎng)皿后 制成5mm 的菌餅備用 在 直 徑9cm 的PDA 平 板 中 央 接 入 直 徑5mm 的 病 原 菌 菌 餅 視 病 原 真 菌 生 長 速 度 選 擇 合 適 時 期 接 種 分 離 到 的 細(xì) 菌 炭 疽 和 立 枯 絲 核 菌 與 細(xì) 菌 同 時 接 種 疫 霉 待 菌 絲 擴 增 1 cm 后 再 接 種 待 測 細(xì) 菌 在 距 中 央 25 mm 處 對 稱 放 置 2 張 5 mm 滅 菌 濾 紙 片 每 張 濾 紙 片 上 滴 入 活 化 培 養(yǎng) 的 分 離 菌 株 菌 液5 L 28 左 右 繼 續(xù) 黑 暗 培 養(yǎng) 設(shè) 不 接 種 分 離 菌 株 的 處 理 為 對 照 每 個 菌 株 重 復(fù) 處 理3 皿 待 對 照 皿 中 真 菌 菌 絲 即 將 長 滿 皿 時 測 量 抑 菌 圈 大 小 計 算 抑 菌 率 抑 菌 率 1 處理菌落直徑 對照菌落直徑 100 9 1 2 6 內(nèi) 生 細(xì) 菌 對 辣 椒 青 枯 病 生 物 防 治 效 果 的 測 定 將 辣 椒 種 子 置 于 濃 度 為10 9 cfu mL 1 內(nèi) 生 細(xì) 菌 菌 懸 液 中 浸 泡 4 h 無 菌 水 沖 洗 3 次 后 進(jìn) 行 漂 浮 育 苗 待 幼 苗 長 至 5 6 片 真 葉 從 育 苗 盤 中 選 取 健 壯 植 株 拔 出 洗 凈 根 部 分 別 浸 泡 在 對 應(yīng) 的 菌 株 菌 懸 液 中20min 以LB 培 養(yǎng) 液 替 代 菌 懸 液 浸 泡 作 為 對 照 每 處 理6 8 株 3 次 重 復(fù) 采 用 傷 根 灌 根 接 種 法 接 種 青 枯 病 菌 觀 察 記 錄 發(fā) 病 情 況 計 算 相 對 防 效 相 對 防 效 BE CK 的 病 情 指 數(shù) 試 驗 處 理 的病情指數(shù) CK 病情指數(shù) 100 1 3 數(shù)據(jù)分析 利 用 軟 件 DPS 7 05 進(jìn) 行 方 差 分 析 利 用 Excel 2007 進(jìn)行常規(guī)數(shù)據(jù)及表格處理 2 結(jié)果與分析 2 1 抗青枯病辣椒種子樣品的篩選 通 過 苗 期 青 枯 病 抗 性 鑒 定 從 抗 性 表 現(xiàn) 良 好 的 18 份 辣 椒 種 質(zhì) 資 源 中 篩 選 出 對 青 枯 病 抗 性 最 好 最 穩(wěn) 定 的 辣 椒 種 質(zhì) 資 源 2 份 試 驗 序 號 為 7 號 8 號 將其種子作為本次試驗的樣品材料 表3 2 2 辣椒種子內(nèi)生細(xì)菌的分離純化 將 上 述 抗 性 最 佳 的 2 份 抗 青 枯 病 辣 椒 種 子 經(jīng) 外 表 消 毒 殺 菌 后 混 合 研 磨 成 漿 在 培 養(yǎng) 基 中 進(jìn) 行 培 養(yǎng) 分 離 純 化 獲 得 14 株 內(nèi) 生 細(xì) 菌 編 號 為 gz1 gz14 編號 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 接種 株數(shù) 90 90 74 94 72 82 70 80 74 90 92 80 94 106 84 90 82 88 發(fā)病率 22 22 57 78 24 32 72 34 22 22 34 15 17 14 10 00 21 62 33 33 60 87 30 00 57 45 69 81 35 71 31 11 36 59 25 00 枯死率 20 00 44 44 18 92 55 32 22 22 26 83 11 43 2 50 8 11 22 22 54 35 15 00 44 68 54 72 28 57 22 22 21 95 15 91 褐變率 28 57 53 33 24 32 65 96 22 22 34 15 14 29 10 00 13 51 33 33 54 35 25 00 51 06 64 15 35 71 31 11 29 27 25 00 病情指數(shù) 21 67 53 33 22 97 65 96 22 22 32 32 15 00 8 13 16 22 30 56 57 61 25 00 52 13 64 62 33 93 28 89 31 10 22 73 抗性 評價 R S R HS R MR HR HR R MR S R S HS MR R MR R 表3 辣椒種質(zhì)對青枯病苗期抗性表型 44 第2 期 等 辣椒種子拮抗青枯病菌內(nèi)生細(xì)菌的分離 鑒定 試驗研究 牟玉梅 2 3 拮抗青枯病菌內(nèi)生細(xì)菌的篩選 將 獲 取 的14 株 內(nèi) 生 細(xì) 菌 與 青 枯 病 菌 進(jìn) 行 平 板 對 峙 6 株 內(nèi) 生 細(xì) 菌 gz1 gz6 gz7 gz11 gz13 gz14 對 青 枯 病 菌 有 拮 抗 作 用 表 4 其 中 菌 株 gz6 gz7 gz11 gz13 對 辣 椒 青 枯 病 菌 的 抑 菌 圈 直 徑 25 mm 抑 菌 帶 寬 度 8mm 表 現(xiàn) 拮 抗 活 性 很 強 抑 菌 作 用 強 度 為 菌 株 gz13 對 辣 椒 青 枯 病 菌 的 抑 菌 圈 直 徑 達(dá) 到 42 22 mm 抑 菌 帶 寬 度 達(dá) 到 15 60 mm 對 辣 椒 青 枯 病 菌 表 現(xiàn) 出 很 強 的 拮 抗 活 性 圖1 2 4 拮抗青枯病菌內(nèi)生細(xì)菌的鑒定 對 篩 選 出 的 對 青 枯 病 菌 具 有 拮 抗 作 用 的 6 株 內(nèi)生細(xì)菌 進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法鑒定 形 態(tài) 學(xué) 鑒 定 gz1 菌 落 呈 圓 形 光 滑 微 凸 邊 緣 整 齊 濕 潤 菌 落 顏 色 為 無 色 革 蘭 氏 染 色 結(jié) 果 為 陰 性 菌 體 呈 桿 狀 gz6 菌 落 邊 緣 光 滑 凸 起 呈 膿 液 狀 菌 落 顏 色 為 淺 灰 綠 色 革 蘭 氏 染 色 結(jié) 果 為 陰 性 菌 體 呈 球 桿 狀 gz7 菌 落 邊 緣 光 滑 微 凸 呈 膿 液 狀 菌 落 顏 色 為 綠 色 革 蘭 氏 染 色 結(jié) 果 為 陰 性 菌 體 呈 桿 狀 或 長 絲 狀 圖1 A gz11 菌 落 多 呈 圓 形 邊 緣 光 滑 整 齊 微 凸 濕 潤 菌 落 顏 色 為 無 色 革 蘭 氏 染 色 結(jié) 果 為 陰 性 菌 體 呈 桿 狀 或 絲 狀 gz13 菌 落 表 面 光 滑 半 透 明 邊 緣 整 齊 有 光 澤 菌 落 顏 色 為 淡 黃 色 革 蘭 氏 染 色 結(jié) 果 為 陽 性 細(xì) 胞 呈 球 狀 或 細(xì) 長 不規(guī)則的桿 狀 圖1 B gz14 菌落邊緣光 滑 微凸 呈 膿 液 狀 菌 落 顏 色 為 淺 綠 色 革 蘭 氏 染 色 結(jié) 果 為 陰性 菌體呈球桿狀 分 子 生 物 學(xué) 鑒 定 6 株 內(nèi) 生 細(xì) 菌 的 16S rDNA PCR 產(chǎn) 物 均 在750bp 左 右 條 帶 清 晰 將6 株 內(nèi) 生 細(xì) 菌 的 16S rDNA 序 列 與 GenBank 數(shù) 據(jù) 庫 中 的 序 列 進(jìn) 行 比 對 找 到 了 同 源 性 高 的 相 似 菌 株 序 列 結(jié) 果 為 3 株 屬 于 或 與 黏 液 型 銅 綠 假 單 胞 菌 最 相 似 屬 于 變 形 菌 門 變 形 菌 綱 假 單 胞 菌 目 假 單 胞 菌 科 假 單 胞 菌 屬 2 株 屬 于 或 與 蒼 白 桿 菌 最 相 似 屬 于 變 形 菌 門 變 形 菌 綱 根 瘤 菌 目 布 魯 氏 菌 科 蒼 白 桿 菌 屬 1 株 屬 于 或 與 微 桿 菌 最 相 似 屬 于 放 線 菌 門 微桿菌科 微桿菌屬 表5 結(jié) 合 形 態(tài) 學(xué) 和 16S rDNA 序 列 同 源 性 分 析 將 菌 株 gz6 gz7 gz14 鑒 定 為 黏 液 型 銅 綠 假 單 胞 菌 Pseudomonas aeruginosa 菌 株 gz1 gz11 鑒 定 為 蒼 白 桿 菌 Ochrobactrum 菌 株gz13 鑒 定 為 微 桿 菌 Microbacterium 2 5 內(nèi)生細(xì)菌抑菌廣譜性測定 由 表 6 可 知 6 株 內(nèi) 生 細(xì) 菌 均 至 少 對 其 中 一 種 病 原 真 菌 有 拮 抗 作 用 其 中 有3 株 內(nèi) 生 細(xì) 菌 gz6 gz7 gz14 對3 種 植 物 病 原 真 菌 均 有 拮 抗 作 用 有2 株 內(nèi) 生 細(xì) 菌 gz11 gz13 對2 種 植 物 病 原 菌 有 抑 制 作用 有1 株內(nèi)生細(xì) 菌 gz1 只對1 種植物病 原菌有 抑 制 作 用 總 體 而 言 大 部 分 內(nèi) 生 細(xì) 菌 對 立 枯 絲 核 病 菌 辣 椒 炭 疽 病 菌 拮 抗 作 用 強 gz6 gz7 gz14 對 辣 椒 疫 霉 菌 立 枯 絲 核 病 菌 炭 疽 病 菌 均 有 較 好 抑 制 作 用 且 對 辣 椒 青 枯 病 菌 也 有 很 明 顯 的 抑 制 作 菌株 gz1 gz6 gz7 gz11 gz13 gz14 抑菌圈直徑 mm 16 79 0 38d 32 55 1 17b 28 59 6 13bc 29 94 0 36bc 42 22 2 74a 25 63 2 76c 抑菌帶寬度 mm 3 70 0 38d 10 30 0 42b 8 39 1 29c 9 00 0 67bc 15 60 0 92a 7 91 0 79c 抑菌作用強度 B 表4 辣椒種子內(nèi)生細(xì)菌對青枯病菌的抑制作用 注 A gz7 B gz13 圖1 拮抗菌對辣椒青枯病菌的抑制作用 A 45 中 國 瓜 菜 第33 卷 試驗研究 圖2 內(nèi)生細(xì)菌菌株抑菌帶寬與溫室辣椒青枯病防效的關(guān)系 用 具 有 廣 譜 抑 菌 性 可 作 為 有 應(yīng) 用 前 景 的 生 物 資 源加以研究 2 6 內(nèi)生細(xì)菌對辣椒青枯病的生防效果 對 6 株 內(nèi) 生 細(xì) 菌 進(jìn) 行 辣 椒 青 枯 病 的 溫 室 控 病 試 驗 表 7 結(jié) 果 表 明 均 具 有 不 同 程 度 的 生 防 效 果 6 株 內(nèi) 生 細(xì) 菌 菌 株 處 理 后 的 辣 椒 植 株 發(fā) 病 率 病 情 指 數(shù) 均 低 于 對 照 接 種28d 時 仍 有5 株 株 菌 具 有 較 明 顯 的 相 對 防 效 其 中 相 對 防 效 大 于 60 的 有 3 株 分 別 是 gz7 gz11 gz14 相 對 防 效 介 于 30 60 的 有2 株 從 大 到 小 依 次 為gz13 gz6 且 有5 株株菌能使辣椒推遲發(fā)病 將 內(nèi) 生 細(xì) 菌 對 青 枯 病 菌 的 抑 菌 帶 寬 與 它 們 對 表5 基于16SrDNA 基因序列分析的辣椒種子內(nèi)生菌鑒定結(jié)果 序號 1 2 3 4 5 6 菌株 gz1 gz6 gz7 gz11 gz13 gz14 NCBI 數(shù)據(jù)庫中最相似的菌種及中文名 蒼白桿菌Ochrobactrumsp strainSZ036 黏液型銅綠假單胞菌PseudomonasaeruginosastrainCAU342A 黏液型銅綠假單胞菌PseudomonasaeruginosastrainD 1 蒼白桿菌Ochrobactrumsp CRRI29 微桿菌Microbacteriumsp HBUM178620 黏液型銅綠假單胞菌PseudomonasaeruginosastrainWZ029 分類鑒定 蒼白桿菌 假單胞菌 假單胞菌 蒼白桿菌 微桿菌 假單胞菌 菌株 gz1 gz6 gz7 gz11 gz13 gz14 疫霉病菌 病菌直徑 mm 28 75 1 16a 26 18 1 85b 29 99 2 61a 抑菌率 67 70 1 30b 70 59 2 08a 66 30 2 94b 立枯絲核病菌 病菌直徑 mm 51 01 5 02a 16 08 2 00c 14 55 3 38c 14 39 7 47c 26 33 5 88b 10 92 2 63c 抑菌率 42 69 5 64c 81 94 2 24a 83 66 3 80a 83 83 8 33a 70 42 6 61b 87 74 2 95a 炭疽病菌 病菌直徑 mm 14 33 1 77ab 11 60 2 32bc 10 00 4 43c 17 17 1 67a 18 33 3 94a 抑菌率 83 90 1 99bc 86 97 2 61ab 88 76 4 98a 80 71 1 88c 79 40 4 43c 表6 內(nèi)生菌對辣椒疫霉菌 立枯絲核病菌 炭疽病菌的拮抗作用 表7 溫室盆栽試驗辣椒青枯病初測結(jié)果 菌株 gz1 gz6 gz7 gz11 gz13 gz14 CK 初始發(fā) 病時間 d 6 4 10 10 7 12 5 發(fā)病率 7d 25 00 8 09b 10 00 7 36bc 0 00 0 00c 0 00 0 00c 5 00 7 86c 0 00 0 00c 80 00 13 47a 15d 70 00 14 68ab 50 00 23 19bc 9 52 13 47d 20 00 13 47cd 35 00 27 58bcd 12 50 16 84cd 100 00 0 00a 25d 95 00 6 73ab 65 00 24 28abc 28 57 0 00c 25 00 5 61c 50 00 35 63bc 50 00 26 94abc 100 00 0 00a 病情指數(shù) 7d 8 00 2 50b 9 00 6 52b 0 00 0 00b 0 00 0 00b 1 00 1 57b 0 00 0 00b 31 00 8 67a 15d 51 00 7 50b 34 00 17 51bc 4 76 6 73c 13 00 9 43c 20 00 15 37bc 7 50 22 93c 80 00 5 06a 25d 83 00 8 44a 53 00 24 92ab 20 95 5 39b 24 00 7 18b 43 00 35 62ab 28 75 34 29ab 90 00 6 73a 相對防效 7d 74 19 0 79b 70 97 20 79b 100 00 0 00a 100 00 0 00a 96 77 5 89a 100 00 0 00a 15d 36 25 6 01b 57 50 25 56ab 94 05 9 18a 83 75 11 72a 75 00 20 69ab 90 63 31 39ab 25d 7 78 15 00b 41 11 34 46a 76 72 5 12a 73 33 6 43a 52 22 35 07a 68 06 30 16a 抑 菌 圈 直 徑 mm 相 對 防 效 菌 株 編 號 50 00 40 00 30 00 20 00 10 0 0 00 100 00 80 00 60 00 40 00 20 00 0 00 相 對 防 效 抑 菌 圈 直 徑 mm gz1 gz6 gz7 gz11 gz13 gz14 46 第2 期 等 辣椒種子拮抗青枯病菌內(nèi)生細(xì)菌的分離 鑒定 試驗研究 牟玉梅 辣 椒 青 枯 病 的 溫 室 控 病 效 果 相 比 較 從 圖2 可 以 看 出 隨 著 抑 菌 帶 寬 度 的 增 加 相 對 防 病 效 果 并 沒 有 完 全 呈 現(xiàn) 增 加 趨 勢 可 能 是 因 為 種 子 浸 種 后 部 分 內(nèi) 生 菌 株 的 定 殖 效 果 不 好 或 者 菌 株 生 長 環(huán) 境 的 變 化 導(dǎo) 致 其 不 能 正 常 發(fā) 揮 抑 菌 功 效 因 此 在 應(yīng) 用 這 些菌株前 仍然需要進(jìn)行大量的驗證試驗 3 討論與結(jié)論 在 已 有 拮 抗 青 枯 病 菌 內(nèi) 生 細(xì) 菌 的 篩 選 及 其 對 青 枯 病 生 物 防 治 的 研 究 報 道 中 拮 抗 內(nèi) 生 細(xì) 菌 大 部 分 是 從 植 株 根 莖 葉 等 部 位 分 離 的 從 種 子 中 分 離 內(nèi) 生 細(xì) 菌 的 研 究 較 少 且 分 離 的 對 青 枯 病 菌 具 有 抗 性 和 生 物 防 效 的 內(nèi) 生 細(xì) 菌 多 為 芽 孢 桿 菌 如 劉 杰 鳳 等 10 從 番 茄 辣 椒 和 茄 子3 種 茄 科 果 蔬 中 篩 選 出 的 14 株 對 青 枯 病 菌 有 強 拮 抗 性 的 內(nèi) 生 細(xì) 菌 分 屬 為 芽 孢 桿 菌 屬 埃 希 氏 菌 屬 克 雷 伯 氏 菌 屬 土 壤 單 胞 菌 屬 歐 文 氏 菌 屬 短 小 桿 菌 屬 其 中 芽 孢 桿 菌 為 優(yōu) 勢 種 群 而 且 芽 孢 桿 菌 屬 菌 株 對 青 枯 病 菌 的 拮 抗 作 用 最 強 蔡 長 平 11 從 多 年 連 作 重 茬 的 辣 椒 地 健 康 植 株 根 系 中 分 離 的1 株 內(nèi) 生 拮 抗 細(xì) 菌PEB 99 對 辣 椒 青 枯 雷 爾 氏 菌 辣 椒 疫 霉 菌 辣 椒 炭 疽 病 菌 辣 椒 鐮 刀 枯 萎 病 菌 都 有 顯 著 抑 制 效 果 屬 于 貝 萊 斯 芽 孢 桿 菌 江 歡 歡 等 12 從 辣 椒 根 際 土 壤 中 分 離 篩 選 出1 株 對 青 枯 病 菌 具 有 較 強 拮 抗 作 用 的 菌 株4S 鑒 定 為 枯 草 芽 孢 桿 菌 孔 凡 玉 等 13 在 福 建 廣 東 貴 州 等 地 感 染 青 枯 病 的 煙 株 根 部 及 番 茄 根 部 分 離 出 的 對 青 枯 病 具 有 拮 抗 作 用 的 內(nèi) 生 細(xì) 菌 3 個 屬 于 芽 孢 桿 菌 屬 2 個屬于假單胞桿菌 筆 者 從 抗 青 枯 病 辣 椒 種 子 中 分 離 出14 株 內(nèi) 生 細(xì) 菌 其 中6 株 內(nèi) 生 細(xì) 菌 對 青 枯 病 菌 有 較 好 的 拮 抗 作 用 結(jié) 合 形 態(tài) 學(xué) 和16SrDNA 序 列 同 源 性 分 析 對6 株 內(nèi) 生 細(xì) 菌 進(jìn) 行 鑒 定 發(fā) 現(xiàn)3 株 屬 于 黏 液 型 銅 綠 假 單 胞 菌 2 株 屬 于 蒼 白 桿 菌 1 株 屬 于 微 桿 菌 6 株 菌 株 均 具 有 生 防 效 果 其 中 菌 株gz7 gz11 gz14 對 辣 椒 青 枯 病 的 生 防 效 果 最 佳 具 有 防 治 疫 病 炭 疽 病 立 枯 病 等 多 種 病 害 的 潛 力 是 一 種 潛 在 的 有 效 的 生 防 菌 株 但 未 對 其 進(jìn) 行 田 間 生 物 防 效 試 驗 需 要 在 后 續(xù) 研 究 中 繼 續(xù) 完 成 試 驗 還 發(fā) 現(xiàn) 隨 著 抑 菌 帶 寬 度 的 增 加 內(nèi) 生 細(xì) 菌 對 辣 椒 青 枯 病 的 控 病 效 果 并 沒 有 完 全 呈 現(xiàn) 增 加 趨 勢 可 能 是 因 為 種 子 浸 種 后 部 分 內(nèi) 生 菌 株 的 定 殖 效 果 不 好 或 者 菌 株 生 長 環(huán) 境 的 變 化 導(dǎo) 致 其 不 能 正 常 發(fā) 揮 抑 菌 功 效 因 此 在 應(yīng)用這些菌株前