Cf 19 介導(dǎo)的抗番茄葉 霉病 Cladosporiumfulvum 免疫應(yīng)答 酵母雙雜交 cDNA 文庫構(gòu)建和鑒定 許向陽 1 2 裴 童 1 吳泰茹 1 王子玉 1 趙婷婷 1 李景富 1 楊歡歡 1 姜景彬 1 張 賀 1 1 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院 哈爾濱 150030 2 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 哈爾濱 150030 摘 要 番 茄 葉 霉 病 Cladosporium fulvum 是 番 茄 栽 培 生 產(chǎn) 中 最 嚴(yán) 重 的 病 害 之 一 造 成 嚴(yán) 重 經(jīng) 濟(jì) 損 失 Cf 19 基 因 是 目 前 已 知 抗 性 最 強(qiáng) 抗 性 范 圍 最 廣 的 葉 霉 病 抗 病 基 因 之 一 其 免 疫 應(yīng) 答 過 程 具 有 代 表 性 為 研 究 Cf 19 介 導(dǎo) 的 免 疫 應(yīng) 答 過 程 中 蛋 白 質(zhì) 互 作 機(jī) 制 采 用Gateway 技 術(shù) 構(gòu) 建 Cf 19 介 導(dǎo) 的 抗 番 茄 葉 霉 病 免 疫 應(yīng) 答 酵 母 雙 雜 交 cDNA 文 庫 結(jié) 果 表 明 酵 母cDNA 文 庫 滴 度 為5 0 10 7 CFU mL 1 重 組 率 為100 cDNA 文 庫 插 入 片 段 長(zhǎng) 度500 2000bp 插 入 片 段 平 均 長(zhǎng) 度1000bp 以 上 由 此 可 知 Cf 19 介 導(dǎo) 的 抗 番 茄 葉 霉 病 C fulvum 免 疫 應(yīng) 答 酵 母 雙 雜 交cDNA 文庫 可用于篩選互作蛋白 關(guān)鍵詞 番茄 葉霉病 cDNA 文庫 酵母雙雜交 中圖分類號(hào) S641 2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1005 9369 2020 05 0010 07 許 向 陽 裴 童 吳 泰 茹 等 Cf 19 介 導(dǎo) 的 抗 番 茄 葉 霉 病 Cladosporium fulvum 免 疫 應(yīng) 答 酵 母 雙 雜 交cDNA 文 庫 構(gòu) 建 和 鑒 定 J 東 北 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 學(xué) 報(bào) 2020 51 5 10 16 DOI 10 19720 ki issn 1005 9369 2020 05 0002 Xu Xiangyang Pei Tong Wu Tairu et al Construction and identification of yeast two hybrid cDNAlibrary for Cf 19 mediated resistance to Cladosporium fulvum infection in tomato J Journal of NortheastAgricultural University 2019 51 5 10 16 in Chinese with English abstract DOI 10 19720 ki issn 1005 9369 2020 05 0002 Construction and identification of yeast two hybrid cDNA library for C f 19 mediated resistance to C l a d o s p o r i u m f u l v u m infection in tomato XUXiangyang 1 2 PEITong 1 WUTairu 1 WANGZiyu 1 ZHAOTingting 1 LIJingfu 1 YANGHuanhuan 1 JING Jingbin 1 ZHANG He 1 1 School of Horticulture and Landscape Architecture Northeast Agricultural University Harbin 150030 China 2 Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement Horticultural Crops Northeast Region Ministry ofAgriculture and RuralAffairs Harbin 150030 China Abstract Cladosporium fulvum is one of the most serious diseases in tomato cultivation and production whicecancauseseriouseconomiclossestotomatoproduction Cf 19geneisoneofthe geneswiththestrongestresistanceandthewidestrangeofresistancetoCladosporiumfulvum andits immuneresponseprocessiswellrepresented Inordertostudytheproteininteractionmechanisminthe immune response process mediated by Cf 19 Gateway technology was used to construct a Cf 19 mediatedyeasttwo hybridcDNAlibraryforimmuneresponse Thestudyshowedthatthetiterofyeast cDNAlibrarywas5 0 10 7 CFU mL 1 therecombinationratewasupto100 thelengthoftheinserted fragmentwas500 2000bp andtheaveragelengthoftheinsertedfragmentofcDNAlibrarywasmore 收稿日期 2020 05 02 基金項(xiàng)目 黑龍江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目 C2017024 中國博士后科學(xué)基金項(xiàng)目 2018M630333 作者簡(jiǎn)介 許 向 陽 1969 男 研 究 員 博 士 博 士 生 導(dǎo) 師 研 究 方 向 為 番 茄 分 子 遺 傳 育 種 E mail xxy709 JournalofNortheastAgriculturalUniversity 東 北 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 學(xué) 報(bào) 第51 卷 第5 期 51 5 10 16 2020 年5 月 May2020番 茄 葉 霉 病 是 番 茄 栽 培 生 產(chǎn) 中 常 見 病 害 多 發(fā) 于 高 溫 高 濕 環(huán) 境 番 茄 生 長(zhǎng) 發(fā) 育 時(shí) 期 均 可 發(fā) 病 1 葉 霉 病 發(fā) 病 初 期 植 株 下 端 老 葉 開 始 出 現(xiàn) 黃 色 斑 點(diǎn) 發(fā) 病 中 期 番 茄 葉 片 背 部 由 黃 色 病 斑 轉(zhuǎn) 為 白 色 霉 層 發(fā)病后期植株葉片出現(xiàn)黑 褐色霉層 最終整株 番 茄 葉 片 布 滿 黑 褐 色 霉 層 致 植 株 死 亡 對(duì) 番 茄 產(chǎn) 量 與 品 質(zhì) 影 響 極 大 2 番 茄 葉 霉 菌 Cladosporium fulvum C fulvum 是 一 種 褐 孢 霉 屬 真 菌 屬 于 絲 孢 目 暗 色 孢 科 3 該 病 菌 與 番 茄 植 株 發(fā) 生 親 和 作 用 真 菌 孢 子 在 葉 片 背 面 萌 發(fā) 菌 絲 從 氣 孔 中 產(chǎn) 生 并 繼 續(xù) 生 長(zhǎng) 和 繁 殖 最 后 受 感 染 細(xì) 胞 發(fā) 生 壞 死 4 研 究 表 明 Cf 基 因 家 族 可 賦 予 番 茄 植 株 對(duì) C fulvum 菌 的 抗 性 當(dāng) 菌 絲 進(jìn) 入 氣 孔 后 Cf 基 因 產(chǎn) 物 識(shí) 別 C fulvum 的Avr 產(chǎn) 物 使 番 茄 植 株 與 病 原 菌 之 間 發(fā) 生 非 親 和 互 作 使 菌 絲 進(jìn) 入 氣 孔 后 停 止 生 長(zhǎng) 4 Cf 基 因 對(duì) C fulvum 的 抗 性 過 程 復(fù) 雜 由 于 Cf 基 因 屬 于 典 型 的RLP 類 受 體 蛋 白 Cf 蛋 白 通 過 結(jié) 合 其 他 蛋 白 以 復(fù) 合 體 形 式 發(fā) 揮 調(diào) 控 功 能 因 此 其 互 作 蛋 白及下游調(diào)控途徑中重要 互作關(guān)系挖掘是解析抗病 應(yīng)答 機(jī)制 的關(guān) 鍵 目前 Cf 介導(dǎo) 的免 疫應(yīng) 答過 程研 究 主 要 集 中 在 Cf 4 和 Cf 9 上 其 進(jìn) 化 關(guān) 系 較 近 序 列 相 似 度 較 高 但 形 成 復(fù) 合 體 及 下 游 調(diào) 控 信 號(hào) 差 異 較 大 使 Cf 家 族 調(diào) 控 機(jī) 制 研 究 更 加 復(fù) 雜 5 Cf 19 基 因 作 為 Cf 基 因 家 族 典 型 成 員 對(duì) C fulvum 抗 性 較 強(qiáng) 攜 帶 該 基 因 的 番 茄 植 株 在 田 間 栽 培 中 表 現(xiàn) 顯 著 且 抗 性 穩(wěn) 定 Cf 19 蛋 白 與 植 物 細(xì) 胞 中 的 信 號(hào) 途 徑 和 蛋 白 互 作 網(wǎng) 絡(luò) 尚 不 清 楚 探 索 該 蛋 白 與 其 他 蛋 白 互 作 分 子 機(jī) 制 將 為 Cf 家 族 抗 病 應(yīng) 答 調(diào) 控機(jī)制的研究和創(chuàng)新提供新思路 6 7 酵 母 雙 雜 系 統(tǒng) 是 篩 選 蛋 白 質(zhì) 之 間 互 作 最 常 用 最 有 效 和 最 靈 敏 的 方 法 8 該 方 法 可 一 對(duì) 一 檢 測(cè) 兩 個(gè) 已知蛋白是否存在相互作 用 也可篩選與已知功能 蛋 白 相 關(guān) 功 能 代 謝 信 號(hào) 傳 導(dǎo) 途 徑 有 互 作 的cDNA 酵母文庫中未確定功能的 未知蛋白 是探索蛋白與 蛋 白 之 間 是 否 存 在 相 互 作 用 的 重 要 手 段 9 近 年 來 隨 酵 母 雙 雜 交 技 術(shù) 研 究 深 入 發(fā) 現(xiàn) 該 技 術(shù) 可 用 于 篩 選 大 量 新 蛋 白 及 蛋 白 質(zhì) 新 功 能 等 應(yīng) 用 10 酵 母 雙 雜交技術(shù)在各研究領(lǐng)域中 應(yīng)用廣泛 為探索未知蛋 白 分 子 機(jī) 理 提 供 可 能 隨 著 酵 母 雙 雜 交 技 術(shù) 的 不 斷 完 善 應(yīng) 用 于 各 種 作 物 領(lǐng) 域 如 在 水 稻 幼 苗 培 育 方 面 建 立 酵 母 雙 雜 交cDNA 文 庫 11 構(gòu) 建 外 源ABA 處 理 的 小 麥 與 玉 米 酵 母 雙 雜 交cDNA 文 庫 12 13 辣 椒 抗 疫 霉 菌 方 面 建 立 酵 母 雙 雜 交cDNA 文 庫 14 并 應(yīng) 用 于 花 生 等 栽 培 生 產(chǎn) 領(lǐng) 域 15 為 不 同 作 物 研 究 相 關(guān)調(diào)控機(jī)制發(fā)揮重要作用 本 研 究 試 驗(yàn) 材 料 為 番 茄 品 種CGN18423 經(jīng) 多 年 田 間 試 驗(yàn) 確 定 該 品 種 攜 帶 抗 番 茄 葉 霉 病 基 因 Cf 19 對(duì) 番 茄 植 株CGN18423 侵 染 葉 霉 病 菌 將 侵 染 后0 7 15d 番 茄 材 料 混 合 利 用Gateway 技 術(shù) 構(gòu) 建 Cf 19 介 導(dǎo) 的 抗 番 茄 葉 霉 病 免 疫 應(yīng) 答 酵 母 雙 雜 交cDNA 文 庫 以 期 為 深 入 研 究 Cf 19 下 游 調(diào) 控 機(jī)制奠定基礎(chǔ) 1 材料與方法 1 1 植物 材料與葉霉菌侵染 抗 病 材 料CGN18423 攜 帶 Cf 19 抗 性 基 因 由 中 國 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 院 蔬 菜 花 卉 研 究 所 提 供 葉 霉 病 病 原 菌 來 自 東 北 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 實(shí) 驗(yàn) 實(shí) 習(xí) 與 示 范 中 心 向 陽 基 地 保 存 于 東 北 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 園 藝 園 林 學(xué) 院 番 茄 課 題 組 試 驗(yàn) 于2019 年7 月 在 東 北 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 園 藝 實(shí) 驗(yàn) 站 育 苗 適 宜 溫 度 為25 28 夜 溫 不 低 于 12 濕 度75 當(dāng) 番 茄 長(zhǎng) 至4 5 葉 一 心 時(shí) 將 培 養(yǎng) 皿 中 葉 霉 病 菌 刮 下 制 作 孢 子 懸 浮 液 噴 灑 植 株 侵 染 葉 霉 病 病 原 菌 保 持 溫 度30 濕 度 85 侵 染 病 原 菌0 7 15d 后 選 取 番 茄 葉 片 凍 于 液 氮 中 儲(chǔ)存于 80 冰箱 1 2 試驗(yàn)試劑 cDNA 文 庫 主 要 試 劑 CloneMiner II cDNA Library Construction Kit FastTrack MAG mRNA isolationKit SuperScriptIIIFirst StrandSynthesis System for RT PCR PureLink TM HQ Mini Plasmid DNAPurificationKitand 等 均 購 自Invitrogen 公 司 Ammoniumacetatesolutionformolecularbiology 5M 試 劑 均 購 自SIGMA 公司 1 3 番茄葉片總 RNA 提取與 mRNA 分離 純化 1 3 1 Trizol 方法提取番茄葉片總RNA 采 取 葉 霉 病 原 菌 侵 染 后0 7 15d 番 茄 葉 片 采 用Trizol 方 法 提 取 Cf 19 介 導(dǎo) 的 抗 番 茄 葉 霉 than1000bp Thelibrarywasofgoodqualityandcould beusedforscreeningofinteractingproteins Key words tomato Cladosporiumfulvum cDNAlibrary yeasttwo hybrid 許向陽等 Cf 19 介導(dǎo)的抗番茄葉霉 病 Cladosporium fulvum 免疫應(yīng)答酵母雙雜交 cDNA 文庫構(gòu)建和鑒定 第5 期 11 病 免 疫 應(yīng) 答 酵 母 雙 雜 交 文 庫 總RNA 葉 霉 病 病 原 菌 侵 染 后0 7 15d 番 茄 幼 嫩 葉 片 各 取1g 研 磨 成 粉 末 向 管 中 加 入Trizol 與CH3Cl 后 混 勻 置 于4 離 心 機(jī) 中 離 心 吸 取 上 清 液 加 入 同 體 積 異 丙 醇 再 按 上 一 步 驟 離 心 收 集RNA 沉 淀 使 用 預(yù) 冷 乙 醇 溶 液 清 洗 管 底 部 白 色 沉 淀 中 殘 留 試 劑 雜 質(zhì) 重 復(fù)1 次 上 述 操 作 棄 除 上 清 液 于 無 菌 條 件 下 干 燥RNA 沉淀 溶解于適量DEPC 水中得到總RNA 1 3 2 番茄mRNA 分離與純化 根 據(jù)FastTrack MAG mRNA isolation Kit 與 OligotexmRNAMidiKit 說 明 書 分 離 與 純 化mRNA 向 總RNA 加 入 水 浴 后buffer OBB 和Oligotex suspension 溶 液 70 水 浴 后 離 心 收 取 沉 淀 向 沉 淀 中 加 入OW2 溶 液 再 次 離 心 離 心 后 加 入buffer OEB 懸 浮 沉 淀 離 心 后 收 集 離 心 液 檢 測(cè) 質(zhì) 量 加 入NH4OAC 無 水 乙 醇 與 糖 原 混 勻 靜 置 于 80 條 件 離 心 后 收 集 沉 淀 按 照1 3 1 方 法 使 用70 乙 醇 溶 液 清 洗mRNA 沉 淀 最 后 溶 解mRNA 沉 淀 將分 離純 化后mRNA 通過 電泳 觀察 檢測(cè) 目的 條帶 完 整性與片段長(zhǎng)度 用于文庫構(gòu)建 1 4 Cf 19 介導(dǎo)的抗番 茄葉霉病免 疫應(yīng)答酵母 雙雜 交初級(jí) cDNA 文庫構(gòu)建 1 4 1 cDNA 雙鏈合成 參 考Invitrogen 公 司cDNA 文 庫 構(gòu) 建 說 明 書 向 純 化 后mRNA 加 入DEPC 水 5 FirstStrandBuffer 等 相 應(yīng) 試 劑 合 成cDNA 首 鏈 cDNA 第 一 條 鏈 合 成 后 再 向 管 中 加 入DEPC treatedwater 5 SecondStrand Buffer E c o l iDNALigase E c o l iDNAPolymeraseI E coliRNaseH 與T4DNAPolymerase 等 試 劑 離 心 離 心 后 取 上 清 液 加 入Glycogen NH4OAc 100 ethano 于 80 條 件 下 靜 置 離 心 收 集 沉 淀 按 照 1 3 1 方 法 清 洗 沉 淀 中 多 余 試 劑 及 雜 質(zhì) 重 復(fù) 此 步 驟 在 室 溫 下 吹 干 加 入DEPC 水 獲 得 完 整 雙 鏈 cDNA 1 4 2 cDNA 重組接頭連接 分級(jí)分離與收集 將 合 成 的 雙 鏈cDNA 與 三 框attB1 重 組 接 頭 連 接 3 種 接 頭 分 別 各 連 接 一 份 將 連 接 后 的cDNA 與10 LigationBuffer T4DNALigase 加 入 柱 子 中 cDNA 分 級(jí) 分 離 收 集cDNA 分 級(jí) 分 離 后 產(chǎn) 物 添 加 Glycogen 5mol L 1 NH4OAc 100 ethanol 等 試 劑 按 照1 4 1 清 洗 沉 淀 的 方 法 溶 解cDNA 完 成cDNA 分級(jí)分離及收集 1 4 3 cDNABP 重組與電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH108 利 用BPClonase IIenzymemixp 將cDNA 片 段 與pDONR222 質(zhì) 粒 作BP 重 組 將 重 組 后cDNA pDONR222 載 體 電 轉(zhuǎn) 化DH10B 大 腸 桿 菌 加 入SOC 液 體 培 養(yǎng) 基 于 搖 床 中 復(fù) 蘇 細(xì) 菌45min 復(fù) 蘇 后 吸 取 50 L 經(jīng)10 倍 稀 釋 后 菌 液 涂 布 于 固 體LB 平 板 用 于 鑒 定 庫 容 量 儲(chǔ) 存 于 80 冰 箱 中 此 為 初 級(jí) cDNA 文庫菌液 1 5 Cf 19 介 導(dǎo) 的 抗 番 茄 葉 霉 病 C fulvum 免 疫 應(yīng)答酵母雙雜交次級(jí) cDNA 文庫構(gòu)建 將 構(gòu) 建 成 功 的 初 級(jí)cDNA 文 庫 用 液 體LB 培 養(yǎng) 基 在37 搖 床 上 培 養(yǎng)15h 提 取 質(zhì) 粒 按 照1 4 3 載 體 構(gòu) 建 方 法 將 同 濃 度 初 級(jí)cDNA 文 庫 質(zhì) 粒cDNA pDONR222 構(gòu) 建 至 次 級(jí)cDNA 文 庫 載 體pGADT7 DEST 將 構(gòu) 建 的 反 應(yīng) 產(chǎn) 物 按 照 上 述 相 同 方 法 電 轉(zhuǎn) 化 大 腸 桿 菌DH10B 復(fù) 蘇 菌 液 復(fù) 蘇 后 菌 液 按 照 1 4 3 方 法 涂 布 固 體LB 培 養(yǎng) 基 平 板 其 余 菌 液 儲(chǔ) 存 于 80 冰箱中 此為次級(jí)cDNA 文庫菌液 1 6 Cf 19 介導(dǎo)的抗番 茄葉霉病免 疫應(yīng)答酵母 雙雜 交各級(jí) cDNA 文庫質(zhì)量鑒定 1 6 1 初級(jí) 次級(jí)與酵母cDNA 文庫庫容量鑒定 取1 4 與1 5 轉(zhuǎn) 化 后 酵 母 雙 雜 交 初 級(jí)cDNA 文 庫 與 次 級(jí)cDNA 文 庫 原 菌 液10 倍 稀 釋 分 別 從 初 級(jí)cDNA 文 庫 與 次 級(jí)cDNA 文 庫 中 吸 取 菌 液 按 照1 4 3 方 法 涂 布 于 相 應(yīng) 抗 性 固 體LB 平 板 初 級(jí)cDNA 文 庫 抗 性 為Kanamycine 次 級(jí)cDNA 文 庫 抗 性 為Ampicillin 37 培 養(yǎng) 箱 中 培 養(yǎng)16h 長(zhǎng) 出 白 色 克 隆 初 級(jí)cDNA 次 級(jí)cDNA 文 庫 滴 度 CFU mL 1 平 板 全 部 克 隆 數(shù) 量 50 L 1 100 倍 1 10 3 L 文 庫 總 容 量 CFU 文 庫 滴 度 CFU mL 1 文 庫 菌 液 總 體 積 mL 目 的 酵 母 文 庫 滴 度 CFU mL 1 平 板 克 隆 數(shù)量 涂板體積 稀釋倍數(shù) 1 6 2 初 級(jí) 次 級(jí) 與 酵 母cDNA 文 庫 片 段 長(zhǎng) 度 與 重 組率鑒定 從 初 級(jí)cDNA 文 庫 次 級(jí)cDNA 文 庫 與 酵 母 cDNA 文 庫 培 養(yǎng) 基 中 各 隨 機(jī) 選 擇24 個(gè) 克 隆 作PCR 檢 測(cè) 各 級(jí) 文 庫 重 組 序 列 完 整 性 初 級(jí)cDNA 文 庫 PCR 引 物M13 與 次 級(jí)cDNA 文 庫 引 物pGADT7 DEST 均 由Invitrogen 公 司 設(shè) 計(jì) 提 供 PCR 反 應(yīng) 程 序 參 考 李 穎 波 等 方 法 9 cDNA 文 庫 片 段 長(zhǎng) 度 與 重 組 率 經(jīng)1 瓊 脂 凝 膠 電 泳 檢 測(cè) 鑒 定 重 組 率 重 組成功數(shù)量 克隆總數(shù) 100 東 北 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 學(xué) 報(bào) 12 第51 卷a 總RNA 電泳結(jié)果 b mRNA 電泳結(jié)果 c dscDNA 片段長(zhǎng)度 a GelelectrophoretogramresultsoftotalRNA b GelelectrophoretogramresultsofmRNA c dscDNAfragmentlength 圖 1 總 RNA mR NA 與 ds cDNA 電泳結(jié)果 Fig 1 Gel electrophoretogram results of total RNA mRNA and ds cDNA 2000bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp DL2000DNAMarker 2000bp 750bp 500bp 250bp 100bp 1000bp DL2000DNAMarker 28S 18S 1 7 Cf 19 介導(dǎo) 的抗 番茄 葉霉 病免 疫應(yīng) 答酵 母雙 雜 交目的文庫構(gòu)建與質(zhì)量鑒定 將 次 級(jí)cDNA 文 庫 菌 液 于 液 體 培 養(yǎng) 基 中 搖 菌 第 二 天 抽 提 質(zhì) 粒 將 酵 母 文 庫 質(zhì) 粒 轉(zhuǎn) 化Y187 酵 母 菌 株 向 預(yù) 冷 離 心 管 中 加 入 次 級(jí)cDNA 文 庫 質(zhì) 粒 感 受 態(tài) 細(xì) 胞 PEG LiAc 溶 液 與DMSO 溶 液 等 試 劑 通 過 冰 浴 水 浴 離 心 等 將cDNA 酵 母 文 庫 轉(zhuǎn) 入 酵 母 菌 株 用3YPDPlus 液 體 培 養(yǎng) 基 于30 搖 床 90min 復(fù) 蘇 酵 母 涂 布 于150mmSD Leu 平 板 上 每 個(gè) 平 板 鋪 展300 L 共 計(jì)100 皿 平 板 30 倒 置 平 板 約72 96h 克 隆 出 現(xiàn) 4 冷 卻 平 板3 4h 每 個(gè) 平 板 加 入5mL 冷 凍 培 養(yǎng) 基 按 照1 4 3 方 法 取 100 LcDNA 文 庫 按 照 1 100 1 1000 和1 10000 稀 釋 在SD Trp 平 板 上 在30 培 養(yǎng) 箱 中 培 養(yǎng)48 72h 長(zhǎng) 出 克 隆 挑 取 單 克 隆 30 250r min 1 搖 床 培 養(yǎng)16 18h 于10000r min 1 離 心2min 去 除 上 清 液 SDS 重 懸 菌 液 離 心 后 作 菌 落PCR PCR 反 應(yīng) 程 序 同1 6 2 從 各 管 中 分 別 取5 L 經(jīng) 瓊 脂 糖 凝 膠電泳檢測(cè)cDNA 文庫片段長(zhǎng)度與重組率 2 結(jié)果與分析 2 1 番 茄 葉 片 總 RNA 提 取 mRNA 純 化 與 ds cDNA 合成 提 取 被 葉 霉 菌 侵 染 后0 7 和15d 番 茄 葉 片 總 RNA 1 瓊 脂 糖 凝 膠 觀 察 結(jié) 果 見 圖1a 主 帶 清 晰 無 明 顯Smear OD260 OD280 為2 16 OD260 OD280 為 2 17 濃 度 為1 7089 g L 1 表 明RNA 完 整 性 較 好 無 降 解 發(fā) 生 可 用 于cDNA 文 庫 構(gòu) 建 由 圖1b 可 知 mRNA 凝 膠 電 泳 結(jié) 果 顯 示mRNA 條 帶 為 一 條 均 勻 集 中 的 彌 散 條 帶 條 帶 分 布 范 圍500 2000bp mRNA 質(zhì) 量 良 好 無 降 解 現(xiàn) 象 dscDNA 經(jīng)mRNA 反 轉(zhuǎn) 錄 的 凝 膠 電 泳 結(jié) 果 顯 示 見 圖1c dscDNA 呈 彌 散性條帶 表明dscDNA 分布較完整 2 2 初級(jí) cDNA 文庫構(gòu)建與鑒定 取10 LcDNA 初 級(jí) 文 庫 原 液 稀 釋100 倍 稀 釋 后 原 液50 L 涂 布 含Kanamycine 抗 性 固 體 培 養(yǎng) 基 平 板 中 培 養(yǎng) 該 平 板 長(zhǎng) 出1800 個(gè) 克 隆 見 圖2a 按 照cDNA 文 庫 滴 度 與 文 庫 總 容 量 公 式 計(jì) 算cDNA 初 級(jí) 文 庫 滴 度3 6 10 6 CFU mL 1 cDNA 初 級(jí) 文 庫 總 容 量1 44 10 7 CFU 為 檢 測(cè) 該cDNA 初 級(jí) 文 庫 重 組 序 列 完 整 性 從LB 培 養(yǎng) 基 中 蘸 取24 個(gè) 單 克 隆PCR 檢 測(cè) 由 圖2b 可 知 24 個(gè) 克 隆 全 部 為 陽 性 克 隆 重 組 率100 可 降 低 試 驗(yàn) 假 陽 性 出 現(xiàn) 概 率 其 中24 個(gè) 克 隆 插 入 片 段 長(zhǎng) 度500 2000bp 22 個(gè) 克 隆 片 段 均 在1000 2000bp 2 個(gè) 克 隆 片 段 在500 750bp 插 入 片 段 平 均 長(zhǎng) 度 為1000bp 以 上 所 有 數(shù) 據(jù) 符 合 構(gòu)建cDNA 初級(jí)文庫標(biāo)準(zhǔn) 2 3 次級(jí) cDNA 文庫構(gòu)建與鑒定 吸 取50 L 經(jīng)10 倍 稀 釋 的 次 級(jí)cDNA 文 庫 菌 液 涂 布 于 固 體 培 養(yǎng) 基 平 板 Ampicillin 該 平 板 長(zhǎng) 出 克 隆1500 個(gè) 見 圖3a 計(jì) 算cDNA 次 級(jí) 文 庫 滴 度 3 0 10 6 CFU mL 1 cDNA 次 級(jí) 文 庫 總 容 量1 2 10 7 CFU 為 檢 測(cè) 該cDNA 次 級(jí) 文 庫 重 組 序 列 完 整 性 作 克 隆PCR 檢 測(cè) 由 圖3b 可 知 24 個(gè) 克 隆 全 部 為 陽 性 克 隆 重 組 率 仍 為100 表 明 降 低 次 級(jí)cDNA 文 庫 假 陽 性 出 現(xiàn) 概 率 其 中 全 部 單 克 隆 插 入 片 段 長(zhǎng) 度 均 在500 2000bp 23 個(gè) 克 隆 片 段 長(zhǎng) 度 1000 2000bp 1 個(gè) 克 隆 片 段 長(zhǎng) 度500 750bp 插 入 片 段 平 均 長(zhǎng) 度1000bp 以 上 所 有 數(shù) 據(jù) 符 合 構(gòu) 建 cDNA 次級(jí)文庫標(biāo)準(zhǔn) 許向陽等 Cf 19 介導(dǎo)的抗番茄葉霉 病 Cladosporium fulvum 免疫應(yīng)答酵母雙雜交 cDNA 文庫構(gòu)建和鑒定 第5 期 13 圖 3 次級(jí) cDNA 文庫容量與重 組率 插入 片段檢測(cè) F i g 3 C o l o n y n u m b e r w a s c o u n t e d a n d d e t e c t i o n r e s u l t s o f r e c o m b i n a n t r a t e a n d i n s e r t e d f r a g m e n t s o f s e c o n d a r y c D N A l i b r a r y a 次級(jí)cDNA 文庫 容量 b 次級(jí)cDNA 文庫重組率 插入片段檢 測(cè)結(jié)果 a ColonynumberwascountedforsecondarycDNAlibrary b DetectionresultsofrecombinationrateandinsertedfragmentinsecondarycDNAlibrary DL2000DNAMarker a b 2 4 cDNA 文庫構(gòu)建與質(zhì)量鑒定 次 級(jí)cDNA 文 庫 菌 液 轉(zhuǎn) 化 酵 母 菌 株 后 涂 布 于 SD Trp 培 養(yǎng) 基 取100 LcDNA 酵 母 文 庫 按 照 1 100 1 1000 和1 10000 稀 釋 涂 布 并 鑒 定 圖 2 初級(jí) cDNA 文庫容量與重組率 插入片段檢測(cè)結(jié)果 F i g 2 C o l o n y n u m b e r w a s c o u n t e d a n d d e t e c t i o n r e s u l t s o f r e c o m b i n a n t r a t e a n d i n s e r t e d f r a g m e n t s o f p r i m a r y c D N A l i b r a r y a 初級(jí)cDNA 文庫 容量 b 初級(jí)cDNA 文庫重組率 插入 片段檢測(cè)結(jié)果 a ThecolonynumberwascountedforprimarycDNAlibrary b DetectionresultsofrecombinationrateandinsertedfragmentinprimarycDNAlibrary DL2000DNAMarker a b 東 北 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 學(xué) 報(bào) 14 第51 卷 2000bp 750bp 500bp 250bp 100bp 1000bp 2000bp 750bp 500bp 250bp 100bp 1000bp1 10000 稀 釋 度 庫 容 量 與 文 庫 滴 度 最 終 得 到 cDNA 文 庫 酵 母 文 庫 平 板 上 有500 個(gè) 單 克 隆 見 圖 4a 滴 度 為5 0 10 7 CFU mL 1 檢 測(cè) 構(gòu) 建 的 酵 母 文 庫 完 整 性 由 圖4b 可 知 24 個(gè) 單 克 隆 全 部 為 陽 性 克 隆 重 組 率100 此 結(jié) 果 降 低 酵 母cDNA 文 庫 假陽 性出 現(xiàn)概 率 其中 所有 單克 隆插 入片 段長(zhǎng) 度均 在500 2000bp 23 個(gè) 克 隆 片 段 長(zhǎng) 度1000 2000bp 僅1 個(gè) 克 隆 片 段 長(zhǎng) 度500 750bp 插 入 片 段 平 均 長(zhǎng) 度1000bp 以 上 所 有 數(shù) 據(jù) 均 符 合 構(gòu) 建 目 的 酵 母 文 庫標(biāo)準(zhǔn) 3 討論與結(jié)論 酵 母 雙 雜 交 系 統(tǒng) 是 一 種 研 究 蛋 白 質(zhì) 相 互 作 用 結(jié) 構(gòu) 與 功 能 有 效 的 生 物 技 術(shù) 方 法 16 該 技 術(shù) 為 構(gòu) 建 Cf 19 介 導(dǎo) 的 抗 番 茄 葉 霉 病 酵 母 雙 雜 交cDNA 文 庫 提 供 支 持 cDNA 文 庫 質(zhì) 量 主 要 通 過 兩 項(xiàng) 指 標(biāo) 鑒 定 一 是 庫 容 量 另 一 個(gè) 是 重 組 序 列 完 整 性 17 庫 容 量 指cDNA 文 庫 中 所 有 單 獨(dú) 克 隆 數(shù) 量 其 中 文 庫 滴 定 濃 度 為1 0 10 6 CFU mL 1 滿 足 低 豐 度 mRNA 最 低 篩 選 要 求 18 本 試 驗(yàn) 得 到 初 級(jí) 酵 母 cDNA 文 庫 滴 定 濃 度 為3 6 10 6 CFU mL 1 次 級(jí) 酵 母cDNA 文 庫 滴 定 濃 度 為3 0 10 6 CFU mL 1 目 的 酵 母cDNA 文 庫 滴 定 濃 度 為5 0 10 7 CFU mL 1 朱 佳 慧 等 構(gòu) 建 水 稻 幼 苗 酵 母 雙 雜 交cDNA 文 庫 滴 度 為 4 5 10 7 CFU mL 1 11 王 玉 姣 等 構(gòu) 建 辣 椒 疫 霉 菌 誘 導(dǎo) 辣 椒 酵 母 雙 雜 交cDNA 文 庫 滴 度 為1 13 10 6 CFU mL 1 14 相 比 之 下 本 研 究 構(gòu) 建 Cf 19 介 導(dǎo) 的 抗 番 茄 葉 霉 病 酵 母 雙 雜 交cDNA 文 庫 基 因 種 類 更 為 豐富 重 組 序 列 完 整 性 通 過 重 組 率 與 插 入 基 因 片 段 長(zhǎng) 度 兩 項(xiàng) 指 標(biāo) 評(píng) 價(jià) 19 插 入 片 段 需 滿 足 長(zhǎng) 度 各 異 長(zhǎng) 度 500bp 與 平 均 插 入 基 因 片 段 1000bp 等 要 求 方 滿 足 構(gòu) 建cDNA 文 庫 要 求 cDNA 片 段 越 長(zhǎng) 從 文 庫 中 獲 得 完 整 目 的 基 因 序 列 可 能 性 越 大 20 重 組 率 是 反 映cDNA 片 段 與 初 級(jí) 次 級(jí)cDNA 文 庫 載 體 重 組 效 率 重 要 指 標(biāo) 本 試 驗(yàn) 中 各 級(jí) 文 庫 片 段 長(zhǎng) 度 均 在 500bp 以 上 平 均 插 入 基 因 片 段 均 達(dá) 到1000bp 以 上 各 級(jí) 文 庫 重 組 率 均 為100 以 上 指 標(biāo) 均 達(dá) 到 構(gòu) 建cDNA 文 庫 標(biāo) 準(zhǔn) 蘇 玲 等 構(gòu) 建 金 柑 花 蕾 酵 母 雙 雜 交cDNA 文 庫 平 均 插 入 片 段 長(zhǎng) 度 大 于1000bp 重 組 率 為97 91 21 李 穎 波 等 構(gòu) 建 鹽 脅 迫 下 大 麥 酵 母 雙 雜 交 文 庫 平 均 插 入 片 段 長(zhǎng) 度 大 于1000bp 重 圖 4 cDNA 文庫容量與重 組率 插入片 段檢測(cè)結(jié)果 Fig 4 The Colony number was counted and detection results of recombinant rate and inserted fragments of destination cDNA library a 目的文庫容量 圖 b 目的文庫 重組率 插入 片段檢測(cè)結(jié)果 a Colonynumberwascountedfordestinationlibrary b Detectionresultsofrecombinationrateandinsertedfragmentindestinationlibrary DL2000DNAMarker a b 許向陽等 Cf 19 介導(dǎo)的抗番茄葉霉 病 Cladosporium fulvum 免疫應(yīng)答酵母雙雜交 cDNA 文庫構(gòu)建和鑒定 第5 期 15 2000bp 750bp 500bp 250bp 100bp 1000bp組 率 為95 8 9 可 見 本 文 庫 重 組 率 極 高 一 定 程 度上降低文庫中假陽性出現(xiàn)概率 本 研 究 利 用Gateway 技 術(shù) 成 功 構(gòu) 建 Cf 19 介 導(dǎo) 的 抗 番 茄 葉 霉 病 免 疫 應(yīng) 答 酵 母 雙 雜 交cDNA 文 庫 結(jié) 果 表 明 初 級(jí)cDNA 文 庫 滴 度 為3 6 10 6 CFU mL 1 文 庫 總 容 量 為1 44 10 7 CFU 次 級(jí)cDNA 文 庫 滴 度 為 3 0 10 6 CFU mL 1 文 庫 總 容 量 為1 2 10 7 CFU Cf 19 介 導(dǎo) 的 抗 番 茄 葉 霉 病 免 疫 應(yīng) 答 酵 母 雙 雜 交 cDNA 文 庫 滴 度 為5 0 10 7 CFU mL 1 其 中 各 級(jí) 文 庫 重 組 率 全 部 高 達(dá)100 初 級(jí) 次 級(jí) 與 目 的 酵 母 文 庫 插 入 片 段 長(zhǎng) 度 全 部 為500 2000bp 其 中 各 級(jí) 文 庫 多 數(shù) 克 隆 插 入 片 段 均 為1000 2000bp 僅 個(gè) 別 為500 750bp 經(jīng) 計(jì) 算 各 級(jí) 文 庫 插 入 片 段 平 均 長(zhǎng) 度 均 為1000bp 以 上 該 文 庫 質(zhì) 量 良 好 可 用 于 互 作 蛋 白 篩 選 分 析 為 探 索 Cf 19 介 導(dǎo) 的 抗 番 茄 葉 霉 病 免 疫 應(yīng) 答 中 蛋 白 質(zhì) 互 作 分 子 機(jī) 制 奠 定 基 礎(chǔ) 參 考 文 獻(xiàn) 1 周 勇 番 茄 葉 霉 病 的 發(fā) 生 規(guī) 律 與 防 治 現(xiàn) 狀 J 北 京 農(nóng) 業(yè) 2015 33 62 64 2 劉 冠 趙 婷 婷 李 寧 等 番 茄 與 葉 霉 菌 互 作 機(jī) 制 研 究 進(jìn) 展 J 東 北 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 學(xué) 報(bào) 2016 47 9 91 99 3 KerrEA BaileyDL Resistanceto Cladosprium fulvumCook obtained from wild species of tomato J Can J Bot 1964 42 1541 1554 4 Hammond Kosack K E Jones J D Incomp