中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020 53 1 65 73 Scientia Agricultura Sinica doi 10 3864 j issn 0578 1752 2020 01 006 收稿日期 2019 07 10 接受日期 2019 08 21 基金項(xiàng)目 國(guó)家自然科學(xué)基金 31571960 陜西省重點(diǎn)產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新鏈項(xiàng)目 2019ZDLNY03 07 西 北 農(nóng) 林 科 技 大 學(xué) 試 驗(yàn) 示 范 站 基 地 科 技創(chuàng)新與 成果 轉(zhuǎn)化項(xiàng)目 2018 10 高等學(xué)校學(xué)科 創(chuàng)新引智計(jì)劃 B07049 聯(lián)系方式 馮嬋婧 E mail fcj413 通信作 者王陽(yáng) E mail wangyang2006 通信作者馬青 E mail maqing 開(kāi)放科學(xué) 資源服務(wù) 標(biāo)識(shí)碼 OSID 番茄ShARPC5抗白粉病功能分析 馮嬋婧 孫廣正 王陽(yáng) 馬青 西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院 旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 陜西楊凌 712100 摘要 目的 白粉病 powdery mildew 是番茄生產(chǎn)上的重要病害 嚴(yán)重影響番茄的產(chǎn)量 番茄基因組測(cè) 序工作的完成為抗病基因挖掘提供了重要的信息資源 ARP2 3 actin related protein 2 and 3 復(fù)合體是肌動(dòng) 蛋白微絲骨架動(dòng)力學(xué)的主要調(diào)控因子 能夠參與包括響應(yīng)外界脅迫等多種細(xì)胞學(xué)過(guò)程 本研究通過(guò)對(duì)番茄 ARPC5 actin related protein C5 進(jìn)行克隆和抗病功能驗(yàn)證 為番茄基因組信息完善 抗病機(jī)制解析和分子育種等 方面打下基礎(chǔ) 方法 從番茄LA1777 Solanum habrochaites cDNA中 PCR擴(kuò)增ShARPC5 使用DNAMAN 6 0進(jìn) 行多序列比對(duì) MEGA 6 0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù) 應(yīng)用在線工具ProtComp v 9 0進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè) 利用實(shí)時(shí)熒光 定量PCR qRT PCR 比較接種白粉菌 Oidium neolycopersici On Lz 后高感品種Moneymaker MM 和高抗品 種 LA1777 中番茄 ARPC5 的表達(dá)特征 分析白粉菌侵染與 ARPC5 表達(dá)的相關(guān)性 應(yīng)用病毒誘導(dǎo)的基因沉默 virus induced gene silencing VIGS 技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證該基因在番茄中的抗病功能 觀察沉默株和野生型株 系接種后表型變化 利用臺(tái)盼藍(lán)和 DAB 染色法檢測(cè)植株產(chǎn)生過(guò)敏性壞死和 H2O2的能力 并檢測(cè) ShARPC5 沉默后一 些與植物抗病相關(guān)標(biāo)記基因的表達(dá)變化 采用農(nóng)桿菌浸花法遺傳轉(zhuǎn)化擬南芥過(guò)表達(dá) ShARPC5 植株 觀察轉(zhuǎn)基因和 野生型株系接種后表型變化 并統(tǒng)計(jì)單病斑分生孢子數(shù) 結(jié)果 從番茄品種LA1777 中克隆到ShARPC5 編碼132 個(gè)氨基酸殘基 包含一個(gè)保守的P16 Arc結(jié)構(gòu)域 與番茄MM 白粉菌親和互作相比 非親和互作的番茄品種LA1777 在接種白粉菌后 ShARPC5顯著上調(diào)表達(dá) 尤其在接種后18 h 在番茄上沉默ShARPC5能夠增加植株對(duì)白粉菌On Lz 的敏感性 防衛(wèi)反應(yīng)基因 PR1b1 顯著下調(diào)表達(dá) 組織學(xué)觀察顯示與對(duì)照植株相比 ShARPC5 沉默植株接種后誘導(dǎo) 產(chǎn)生過(guò)敏性壞死和活性氧減少 在煙草上瞬時(shí)過(guò)表達(dá) ShARPC5 能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生壞死斑 相反 在擬南芥上過(guò)表達(dá) ShARPC5能夠增加植物的抗病性 結(jié)論 ShARPC5是番茄響應(yīng)白粉菌侵染的重要基因 可減輕番茄白粉病的發(fā)病 程度 在番茄抗白粉病機(jī)理研究方面具有較大的應(yīng)用價(jià)值 可作為番茄抗白粉病分子育種的一個(gè)候選基因 關(guān)鍵詞 番茄白粉病 抗病性 肌動(dòng)蛋白微絲骨架 ARP2 3復(fù)合體 ARPC5 Functional Analysis of Gene ShARPC5 Involved in Tomato Resistance to Powdery Mildew FENG ChanJing SUN GuangZheng WANG Yang MA Qing College of Plant Protection Northwest A F University State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas Yangling 712100 Shaanxi Abstract Objective Powdery mildew is an important disease in tomato production and seriously affects the yield of tomato Genome sequences of Solanum lycopersicum provide valuable information resources for disease resistant gene searching The actin related protein 2 and 3 complex ARP2 3 complex a key regulator of actin cytoskeletal dynamics has been linked to multiple 6 6 中 國(guó) 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 5 3 卷 cellular processes including those associated with response to stress In this study tomato ARPC5 encoding a subunit protein of the ARP2 3 complex was cloned and identified for disease resistance The results will lay a foundation for upgrading tomato genomic information further studying the resistance mechanism and molecular breeding Method ShARPC5 was annotated from the genomic databases and cloned from tomato LA1777 S habrochaites DNAMAN 6 0 was used for multiple sequence alignment and MEGA 6 0 was used for constructing phylogenetic tree The prediction of protein subcellular localization was performed using ProtComp v 9 0 The qRT PCR was used to compare the expression of ARPC5 in the high sensitive variety Moneymaker MM and high resistant variety LA1777 induced by Oidium neolycopersici On Lz The correlation between On Lz infection and ARPC5 expression was analyzed The function of ShARPC5 involving in tomato resistance to On Lz was further verified by the technology of virus induced gene silencing VIGS The phenotypic changes of ShARPC5 silenced and wild type lines were observed Hypersensitive response HR and H 2 O 2 production were detected by trypan blue and DAB staining respectively and the expression of some marker genes related to plant disease resistance was assayed in ShARPC5 silenced plants Additionally genetic transformation of Arabidopsis thaliana was conducted by Agrobacterium mediated floral dip method The phenotypic changes of transgenic and wild type lines were observed and the number of conidia per lesion was also counted Result The S habrochaites ARPC5 was identified and characterized ShARPC5 encodes a 132 amino acid protein possessing a conserved P16 Arc domain Compared with the compatible interaction between tomato MM Moneymaker and On Lz the expression of ShARPC5 was significantly up regulated in incompatible interaction between tomato LA1777 and On Lz especially at 18 hpi Silencing of ShARPC5 in tomato could increase the susceptibility to the powdery mildew pathogen On Lz The expression of PR1b1 a maker gene related to signal regulation was significantly down regulated after silencing of ShARPC5 The histological observation showed that the induction of hypersensitive cell death and the generation of reactive oxygen were reduced in silenced ShARPC5 tomato plants compared with wild types Transient over expression of ShARPC5 in tobacco could rapidly produce necrotic spots Conversely over expression of ShARPC5 in A thaliana followed by inoculation with On Lz showed enhanced resistance Conclusion ShARPC5 is an important gene which can reduce the incidence of tomato powdery mildew and has a great application value in the mechanism study of tomato resistance to powdery mildew At the same time it can be used as a candidate gene for molecular breeding of tomato powdery mildew resistance Key words tomato powdery mildew resistance actin cytoskeleton ARP2 3 complex ARPC5 0 引言 研究意 義 番茄白粉 菌 Oidium neolycopersici 是一種活體營(yíng)養(yǎng)寄生菌 能在番茄葉表面 背面 葉 柄和花萼上產(chǎn)生白粉病斑 但不侵染果實(shí) 它通過(guò)影 響植物的葉片使葉片失去生長(zhǎng)活力 能導(dǎo)致產(chǎn)量 果 實(shí) 損失 高 達(dá) 50 1 目 前 在溫 室和 大田中對(duì) 番茄 白粉病的控制主要依賴于化學(xué)農(nóng)藥 然而 化學(xué)藥劑 不僅增加病原菌抗藥性 也通過(guò)果實(shí)中農(nóng)藥的殘留對(duì) 環(huán)境和人體造成危害 2 大多數(shù)栽培番茄易受白粉菌 侵染 控制番茄白粉病的有效策略是培育抗性品種 前人研究進(jìn)展 目前 野生番茄品種中一些抗性基 因已經(jīng)被鑒定并轉(zhuǎn)入栽培番茄 包括 5 個(gè)顯性基因 Ol 1 Ol 3 Ol 4 Ol 5 Ol 6 1 個(gè) 隱性基 因 ol 2 和 3 個(gè)多 基 因抗性數(shù) 量性 狀基因座 quantitative trait locus QTLs 3 研 究發(fā) 現(xiàn)抗性基 因介 導(dǎo)的對(duì)番 茄白 粉病的抗 病性 與過(guò)敏性 壞死 hypersensitive response HR 有 關(guān) 3 當(dāng)細(xì)胞 產(chǎn) 生 HR 時(shí) 未 受感染的 鄰近 細(xì) 胞顯示肌動(dòng)蛋白微絲 actin filaments AFs 聚集現(xiàn) 象 4 AFs 是 形成肌動(dòng) 蛋白 細(xì)胞骨架 的主 要結(jié)構(gòu)元 件 既能將質(zhì)膜和細(xì)胞壁上的物質(zhì)通過(guò)囊泡的靶向輸送轉(zhuǎn) 運(yùn)到生長(zhǎng)位點(diǎn) 也能特異性的轉(zhuǎn)運(yùn)防衛(wèi)相關(guān)物質(zhì)形成 抵御病原 菌侵 入的屏障 5 6 肌動(dòng)蛋白 組成 的關(guān)鍵步 驟 是肌動(dòng)蛋白成核 而肌動(dòng)蛋白成核在很大程度上受 ARP2 3 actin related protein 2 and 3 復(fù)合 體的活性 調(diào) 節(jié) 這能 確保 AFs 正確形 成 7 ARP2 3 復(fù) 合 體包含 7 個(gè)亞基 分 別 為 ARP2 ARP3 ARPC1 ARPC5 該 復(fù) 合體是一種高度保守的肌動(dòng)蛋白調(diào)節(jié)劑 能核化與質(zhì)膜 區(qū)域相關(guān)的分支狀的肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò) 也能促進(jìn)特定細(xì)胞 器和細(xì)胞骨架的耦合 在核內(nèi)和細(xì)胞質(zhì)間提供某種形式 的物理連續(xù)性 8 ARP2 3 復(fù)合體不同亞基在發(fā)育過(guò)程 中起著不同的作用 例如 ARP2 對(duì)膜結(jié)合是必不可少 的 9 ARP3 在體內(nèi)定位于肌動(dòng)蛋白成核部位 10 ARPC1 或 ARPC2 的缺 失導(dǎo) 致釀酒酵 母的 致死性和 生 存能力嚴(yán) 重下 降 擬南 芥 Arabidopsis thaliana ARP3 或 ARPC5 的功能喪失導(dǎo)致根毛短小且彎曲 11 12 ARPC4 是控制 ARP2 3 復(fù)合體組裝和穩(wěn)定性的最關(guān) 鍵亞基 9 ARPC4 和 ARPC5 在介導(dǎo)與 ABA 和 H 2 O 2 誘導(dǎo)的保衛(wèi)細(xì)胞肌動(dòng)蛋白動(dòng)力學(xué)中起關(guān)鍵作用 13 本研究切入點(diǎn) ARP2 3 復(fù)合體的亞基除了能夠參 1 期 馮嬋婧等 番茄 ShARPC5 抗白粉病功能分析 67 與植物生長(zhǎng)發(fā)育和結(jié)構(gòu)組成 較少的研究證實(shí)其參 與植物的抗病性 14 西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué) 院 植 物 病害綜合治理團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)白粉菌 On Lz 與番 茄 Moneymaker MM Solanum lycopersicum 形 成 親和互作 而與番茄 LA1777 S habrochaites 非 親 和互作 在非親和互作體系中番茄 ARPC5 受白粉菌 誘導(dǎo)顯著上調(diào)表達(dá) 推測(cè)其可能參與抗白粉菌侵染 的過(guò)程 擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題 通過(guò)對(duì) ShARPC5 進(jìn) 行克隆 生物信息學(xué)分析 差異性誘導(dǎo)表達(dá) VIGS 分析 煙草瞬時(shí)表達(dá) 擬南芥過(guò)量表達(dá)以及酵母突 變體異源互補(bǔ)等方面的研究 為進(jìn)一步揭示其抗病 機(jī)制打下基礎(chǔ) 1 材料與方法 試驗(yàn)于 2016 2018 年在 西北農(nóng)林科技大學(xué)植物 保護(hù)學(xué)院 植物 病害綜合 治理 實(shí)驗(yàn)室完 成 1 1 試驗(yàn)材料 番茄白粉 菌菌 株 On Lz 采 自 甘肅省蘭 州市 分離 保存在栽 培番 茄 Moneymaker MM 上 生長(zhǎng)溫 度 20 3 相對(duì)濕度 70 5 16 h 光照 8 h 黑 暗 番茄 MM 和 On Lz 構(gòu)成親 和互作體 系 LA1777 和 On Lz 構(gòu) 成 非親和互 作體 系 番 茄種子 消毒后 在 25 95 相 對(duì)濕度 和 3 500 lx 光照 下生 長(zhǎng) 15 生態(tài) 型擬南 芥 Columbia 0 Col 0 購(gòu)自 擬南 芥生物資 源中 心 Ohio 按 照 WU 等 16 的方法對(duì) 擬 南芥種子 進(jìn)行 消毒和催 芽 發(fā)芽和生 長(zhǎng)分 別在 21 和 19 生 長(zhǎng)室 8 h 光照 16 h 黑暗 相 對(duì)濕 度為 70 1 2 生物信息學(xué)分析 以擬南 芥 ARPC5 序列號(hào) NP 567216 1 氨 基 酸序列作 為指 示查詢序 列在SGN Tomato Combined 數(shù) 據(jù)庫(kù) TBLASTN 程 序 GenBank 的 BLASTN http blast ncbi nlm nih gov blast cgi 程序搜索 同源 序列 利用 NCBI http www ncbi nlm nih gov gorf gorf html 的 BLAST 程序 和基因開(kāi) 放式 閱讀框 ORF 分 析 ShARPC5 的 cDNA 序列 使 用 DNAMAN6 0 進(jìn)行多序 列比 對(duì) 用 MEGA 6 0 軟 件的鄰 近法進(jìn)行 系統(tǒng) 發(fā)育分析 蛋 白質(zhì)結(jié)構(gòu) 域預(yù) 測(cè)使用 RCSB PDB 蛋白 質(zhì) 數(shù)據(jù)庫(kù) https www rcsb org 利用 ProtComp 程序 v 9 0 http linux1 softberry com berry phtml 預(yù)測(cè) ShARPC5 蛋 白亞 細(xì)胞定位 1 3 煙草瞬時(shí)過(guò)表達(dá) 利用 ShARPC5 TF 5 AGCATCGATTCCCGGG TCGACATGGCTGAGATTGTCGAAGCAGATA 3 下劃線為 載體 同源臂 和 ShARPC5 TR 5 AACCGT TCATCGGCGGTCGACTCACACAGTATTCACAGT GTCAGCA 3 下劃 線為載 體同源臂 擴(kuò) 增 ShARPC5 的 ORF 將 擴(kuò)增產(chǎn)物 同源 重組到 PGR106 載體的 SalI 酶切位點(diǎn) 由 CaMV35S 啟動(dòng)子驅(qū) 動(dòng) 參照 LU 等 17 的方法將 重組 質(zhì)粒 pGR106 ShARPC5 或 pGR106 GFP 陰性對(duì) 照 電轉(zhuǎn)至根 癌農(nóng) 桿菌 GV3101 中 將轉(zhuǎn) 化 子處理后 在黑 暗中培 養(yǎng) 2 3 h 然后 注射 到煙草葉 片 接種后 5 7 d 對(duì) 表型進(jìn) 行 觀察 1 4 病毒誘導(dǎo)基因沉默 利用 ShARPC5 VF 5 AGAAGGCCTCCATGGG GATCCCGAAGGCATAATCACAAGAATCG 3 下劃 線為載體 同源 臂 和 ShARPC5 VR 5 CGTGAGCTC GGTACCGGATCCCAGCAAGACAACGCAGTATGC A 3 下劃線 為載體同 源臂 擴(kuò)增 ShARPC5 基 因片段 重組 TRV2 ShARPC5 質(zhì)粒 參照 LIU 等 18 的方法 將 TRV1 和 TRV2 ShARPC5 農(nóng) 桿菌混合 菌液 注射到番 茄 LA1777 植 株 葉片 TRV2 ShPDS ShPDS 序列登錄 號(hào) NM 001247166 作 為陽(yáng)性 對(duì)照 接 種病 毒 30 d 觀 察 沉默 ShPDS 植株的光 漂白 癥狀 在葉片 上接種 On Lz 7 dpi days post inoculation 觀察 葉片侵 染表型 參照 SUN 等 19 的 方法在 7 14 dpi 統(tǒng)計(jì) 病害 嚴(yán)重度 計(jì)算 病情指數(shù) DI 病情指 數(shù) DI 某一病害嚴(yán) 重度的發(fā) 病植 物葉片數(shù) 病 害嚴(yán)重度 調(diào)查總植 株 葉片數(shù) 最高病級(jí) 100 利用 THORDAL CHRISTENSEN 等 20 的方法 對(duì)植物葉 片進(jìn) 行 3 3 二氨 基聯(lián)苯胺 DAB 和臺(tái) 盼 藍(lán)染色 分別 于 6 18 24 48 72 hpi hours post inoculation 在 分 生孢子侵 染點(diǎn) 處檢測(cè)植 物產(chǎn) 生 HR 和 H 2 O 2 的形成率 形成率 HR 或 H 2 O 2 在侵 染點(diǎn)處形 成個(gè) 數(shù) 總侵染點(diǎn) 數(shù) 100 1 5 擬南芥過(guò)量表達(dá) 利用 ShARPC5 AF 5 GTCCATGGTACCCGGG GATCCATGGCTGAGATTGTCGAAGCA 3 下劃線 為載體同 源臂 和 ShARPC5 AR 5 ACGGGGGACT CTAGAGGATCCTCACACAGTATTCACAGTGTCA GCA 3 下劃 線為載體 同源 臂 擴(kuò)增 ShARPC5 的 ORF 區(qū)段 重 組到 雙元載 體 pCAMBIA3301 的 BamHI 限制 酶 Promega 位點(diǎn) 由 CaMV35S 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng) 將 pCAMBIA3301 ShARPC5 轉(zhuǎn)化到農(nóng) 桿 菌 GV3101 然 后通過(guò)浸 花法 將其導(dǎo)入 Col 0 野生 型擬南 芥中 21 轉(zhuǎn) 基因 T 1 代 植 株用含卡 那霉 素 25 g mL 1 的 0 5 MS 培養(yǎng)基 1 瓊 脂進(jìn)行陽(yáng) 性篩 選 催芽 2 周后 將 抗卡 6 8 中 國(guó) 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 5 3 卷 那霉素幼 苗移 栽到土壤 中 從自交 的 T 1 株系中獲 得卡 那霉素抗 性 的 T 2 代 植株 T 2 代植 株生 長(zhǎng) 90 d 每個(gè) 處 理 3 4 株 然后 測(cè)定轉(zhuǎn) 基因株系 對(duì) On Lz 的抗 性 同時(shí) 上述 T 2 代植株通 過(guò)使 用特異性 引物 LP CGGTT CTCCAAATGAAGACTT RP AATTGAGACTTTTC AAAGGTAATA PCR 檢 測(cè)確認(rèn)為 轉(zhuǎn)基 因植株 為 了 量化病原 菌生 長(zhǎng)狀況 在 7 dpi 統(tǒng)計(jì) 每個(gè)病 斑的分生 孢 子數(shù) 1 6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR qRT PCR 分析 為了評(píng)估 在番 茄 MM 和 LA1777 上接 種病菌后 ARPC5 表達(dá) 量的變化 在 0 12 18 24 36 48 72 和 96 hpi 采樣 提 取 RNA 反 轉(zhuǎn) 為 cDNA 然 后 進(jìn) 行 qRT PCR VIGS 試 驗(yàn) 中 在 0 24 48 和 72 hpi 檢測(cè)沉默效率以及 PR1b1 PR1 和 Glucanase A PR2 Chitinase 3 PR3 表 達(dá)量 GAPDH 作為 內(nèi)參基因 擬南芥轉(zhuǎn)基因植物在 0 24 48 72 hpi 取樣進(jìn) 行 qRT PCR 以 UBQ10 為 內(nèi) 參基因 表 1 使用 Biozol 總 RNA 提取 試劑盒提 取 總 RNA Qubit 2 0 Fluorometer 計(jì)算 RNA 濃度 使 用單鏈 cDNA 合成試劑 盒 和 oligo dT 18 引物將總 RNA 1 g 用 于 第一鏈 cDNA 合成 采用 IQ TM 5 real time PCR 系統(tǒng) 進(jìn) 行 qRT PCR 擴(kuò)增 在 qRT PCR 反應(yīng)中 將 2 L 總 cDNA 添 加到含 有 10 L 2 SYBR 混合 液的 20 L PCR 反 應(yīng) 液中 上 下 游 引物各 0 4 L 10 mol L 1 dH 2 O 7 2 L qRT PCR 反應(yīng)條件 在 95 預(yù) 變性 10 min 隨后在 95 變 性 15 s 40 個(gè)周 期 55 退 火 30 s 72 延 伸 30 s 定 量 結(jié)果通 過(guò) 2 CT 法計(jì)算 試 驗(yàn) 進(jìn)行 3 次 生物 學(xué)重復(fù) 表1 qRT PCR 反應(yīng)中的基因及引物 Table 1 Genes and primers in qRT PCR reaction 引物序列 Primer sequence 基因 Gene 正向引物 Forward primer sequence 5 3 反向引物 Reverse primer sequence 5 3 ShARPC5 SlARPC5 CGAAGGCATAATCACAAGA CAGCAAGACAACGCAGTA PR1b1 CATCCCGAGCACAAAAC TGAAGTCACCACCACCCT Glucanase A CTTTTACTTGTTGGGCTTCT ACTTCCTTTGAGGGCATT Chitinase 3 ACGCCATCCCCTAAAGA TGGACCCATCCCACATT GAPDH Control CTGGTGCTGACTTCGTTGTTG GCTCTGGCTTGTATTCATTCTCG AtARPC5 CGGAATGCTCAATGCTCT CGGTCCCCAGTAGAAAGTC UBQ10 Control AGAAGTTCAATGTTTCGTTTCATGTAA TTACGAATCCGAGGGAGCCATTG 1 7 數(shù)據(jù)分析 采用 SPSS 19 0 軟件對(duì) 數(shù)據(jù) 進(jìn)行統(tǒng)計(jì) 分析 應(yīng)用 Duncan 氏 新復(fù)極 差法進(jìn)行差異 顯著性檢驗(yàn) P 0 05 表示兩組 處理 間差異顯 著 2 結(jié)果 2 1 番茄ARPC5鑒定和序列分析 利用擬南芥 ARPC5 作為探索基因 從番茄 LA1777 中克 隆到 767 個(gè)核 苷酸的基 因片 段 ShARPC5 Solyc01g090450 3 的開(kāi) 放閱讀框 399 bp 編碼 132 個(gè)氨基酸 分 子量約 為 15 kD ShARPC5 與 AtARPC5 和 NtARPC5 具有高度 的序 列相似性 圖 1 其同 源 性分別為 86 36 和 97 73 SMART 和 RCSB PDB 程序分析顯示 ShARPC5 具有保守的 Pfam P16 Arc 結(jié)構(gòu)域 氨基酸 2 131 其遺傳關(guān)系與 AtARPC5 和 NtARPC5 密切相關(guān) ProtComp 9 0 程序預(yù)測(cè) ShARPC5 蛋 白具有不 同的 細(xì)胞定位 包 括質(zhì)膜 胞外 細(xì)胞質(zhì) 線粒體 內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 過(guò)氧化物酶體 高爾基體 和葉綠體 2 2 ARPC5 差異性誘導(dǎo)表達(dá) 為了確定 ARPC5 的 表 達(dá)量 用 qRT PCR 檢測(cè)番 茄與病原 菌互 作時(shí) ARPC5 的 mRNA 表 達(dá)量 在 非親 和互作中 與 0 hpi 相比 ARPC5 在 18 36 hpi 顯著 上調(diào)表達(dá) P 0 05 在 18 hpi 的表達(dá) 量達(dá)到峰 值 圖 2 為對(duì)照 的 6 倍 此 外 在親和互作中 ARPC5 表達(dá)量 在 18 hpi 顯著 高于對(duì) 照 0 hpi 12 hpi 以及 36 96 hpi 表 達(dá)量顯著 低于 對(duì)照 P 0 05 2 3 沉默 ShARPC5 對(duì)番茄抗病性的影響 為了確 定 ShARPC5 在病原 菌侵染番 茄中 的作用 利用煙草 脆裂 病毒 Tobacco rattle virus TRV 誘 導(dǎo) 沉默 ShARPC5 驗(yàn)證基 因功 能 接種 TRV2 ShPDS 的 葉片在接 種 后 30 d 出現(xiàn) 光漂白的 表型 圖 3 A 證 1 期 馮嬋婧等 番茄 ShARPC5 抗白粉病功能分析 69 Nicotiana sylvestris XM 009773667 NsARPC4 Arabidopsis thaliana AT4G14147 AtARPC4 Saccharomyces cerevisiae NM 001179579 ScARC19 Arabidopsis thaliana AT2G33385 AtARPC2 Solanum habrochaites Solyc09g090550 ShARPC2 Nicotiana sylvestris XM 009791646 NsARPC2 Solanum habrochaites Solyc05g006470 ShARPC1 Arabidopsis thaliana AT2G30910 AtARPC1 Saccharomyces cerevisiae NM 001178582 ScARC40 Arabidopsis thaliana AT4G01710 AtARPC5 Solanum habrochaites Solyc01g090450 ShARPC5 Nicotiana sylvestris XM 009765961 NsARPC5 Saccharomyces cerevisiae NM 001182259 ScARC18 Saccharomyces cerevisiae NM 001179412 ScARC15 Saccharomyces cerevisiae NM 001183212 ScARC35 Solanum habrochaites Solyc07g007630 ShARPC3 Nicotiana tomentosiformis XM 009610279 NtARPC3 Arabidopsis thaliana AT1G60430 AtARPC3 Arabidopsis thaliana AT3G27000 AtARP2 Saccharomyces cerevisiae NM 001180088 ScARP2 Saccharomyces cerevisiae NM 001181723 ScARP3 78 83 100 79 100 99 100 45 100 88 98 44 73 96 71 55 25 24 26 0 2 Solanum habrochaites Solyc12g098430 ShARPC4 B 66 66 66 66 66 66 66 66 131 131 131 131 131 131 131 131 ShARPCS AtARPCS StARPCS NtARPCS CaARPCS DhARPCS CaARPCS SiARPCS ShARPCS AtARPCS StARPCS NtARPCS CaARPCS DhARPCS CaARPCS SiARPCS Consensus Consensus Pfam P16 Arc domain amino acids 2 131 A A ShARPC5 的多重氨基酸序列比對(duì)以及氨基酸序列的特征 氨基酸序列中黑色部分表示同源性達(dá)到 100 粉色表示同源性 75 青色表示同源 性 50 Multiple protein sequence alignment of ShARPC5 and characterized members of ARPC5 proteins Black boxes indicate regions of 100 homology pink boxes indicate 75 homology level and cyan boxes highlight 50 homology level B ShARPC5 系統(tǒng)進(jìn) 化分析 在不同的基因名稱后顯示各基 因登錄號(hào) Evolutionary analysis of ShARPC5 Accession numbers are shown after the gene names 圖1 番茄ARP2 3復(fù)合體亞基ShARPC5的序列分析 Fig 1 Sequence analysis of tomato actin related protein 2 and 3 ARP2 3 complex subunit 5 ShARPC5 0 1 2 3 4 5 6 7 01 21 82 43 64 87 29 6 時(shí)間 Time hpi 相對(duì)表 達(dá)量 Relative expression 親和 互作Compatible interaction 非親 和互作Incompatible interaction 圖2 qRT PCR 分析番茄葉片ARPC5表達(dá)量 Fig 2 ARPC5 expression in tomato leaves analyzed by qRT PCR 7 0 中 國(guó) 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 5 3 卷 TRV2 ShPDS TRV2 ShARPC5 CK A 0 2 4 6 8 10 12 14 16 71 4 時(shí)間 Time dpi 病 情指數(shù) Disease index CK TRV2 ShARPC5 0 0 2 0 4 0 6 0 8 1 2 1 4 CK ShARPC5 PR1b1 Glucanase A Chitinase 3 相對(duì) 表達(dá)量 Relative expression 1 0 BC A 不同處理 對(duì)照株 沉默 ShPDS 植株 沉默 ShARPC5 植株 接種 白粉菌 7 d 后的表型觀察 Infection phenotypes of CK TRV2 TRV2 ShPDS TRV2 ShARPC5 tomato leaves at 7 dpi B 對(duì)照株和沉默 ShARPC5 植株在接種白粉菌后 7 和 14 d 的病情指 數(shù) Disease indexes of CK and TRV2 ShARPC5 plants at 7 and 14 dpi respectively C 對(duì)照株和沉默株接種白粉菌后 24 h ShARPC5 和 PRs 基 因表達(dá)量變化 Relative mRNA transcript levels of ShARPC5 and PRs at 24 hpi determined by qRT PCR 圖3 在番茄上沉默ShARPC5 對(duì)On Lz菌株侵染能力的影響 Fig 3 Effect of silencing of ShARPC5 in tomato LA1777 plants on the infection ability of On Lz strain 實(shí) TRV VIGS 沉默系統(tǒng)的穩(wěn)定性 與對(duì)照相比 沉 默 ShARPC5 植株顯示出明顯的白粉病病斑 沉默株 的病情指數(shù)更高 在 7 和 14 dpi 分別達(dá)到 6 0 和 13 1 圖 3 B 在 24 hpi ShARPC5 的沉默效率達(dá)到 78 圖 3 C 且沉默株中 PR1b1 顯著下調(diào)表達(dá) P 0 05 2 4 沉默 ShARPC5 對(duì)番茄防衛(wèi)反應(yīng)的影響 通過(guò)顯微觀察病原菌侵染番茄葉片后植物上產(chǎn)生 的 HR 和 H 2 O 2 變化進(jìn)一步 研究 ShARPC5 如何 參與番 茄抗病性 在 48 和72 hpi 沉默 ShARPC5 的植 株上 HR 形成率顯著低于對(duì)照 分別為 26 和 36 圖 4 A 在 72 hpi 沉默株 上的 H 2 O 2 形 成率顯著 低于 對(duì)照 P 0 05 僅為 34 圖 4 B 2 5 煙草瞬時(shí)表達(dá)ShARPC5 分析 為了進(jìn)一 步檢 測(cè) ShARPC5 的功能 基 于 PVX 瞬 時(shí)植物表 達(dá)系 統(tǒng) 使 用本氏 煙 Nicotiana benthamiana 評(píng)估 ShARPC5 是否誘導(dǎo)植物細(xì)胞壞死 用表達(dá) PGR106 GFP 的農(nóng)桿菌 侵染 煙草葉片 不能 誘導(dǎo)產(chǎn)生 細(xì) 胞壞死 但是 用轉(zhuǎn) PGR106 ShARPC5 的 農(nóng)桿菌侵 染煙 草葉片產(chǎn)生明顯的細(xì)胞壞死 圖 5 同 樣 用表達(dá) PGR106 BAX 的農(nóng)桿菌 侵染 葉片也能 產(chǎn)生 壞死 2 6 過(guò)表達(dá) ShARPC5 對(duì)擬南芥抗病性的影響 為了檢 測(cè) ARPC5 在擬南芥上的抗病性 分別在野 生型 Col 0 擬南芥和野生型 Col 0 轉(zhuǎn)化 pCAMBIA3301 ShARPC5 植 株上接 種 On Lz 過(guò)表 達(dá) over expression OE ShARPC5 擬南芥植株抗病性增強(qiáng) 植株葉片上 幾乎未發(fā) 現(xiàn)白 粉病病斑 圖 6 A 顯 微觀察發(fā) 現(xiàn) 與對(duì)照相比 在野生型 Col 0 轉(zhuǎn)化 pCAMBIA3301 ShARPC5 植株上單個(gè)病斑分生孢子數(shù)顯著減少 圖 6 B P 0 05 3 討論 通過(guò)核苷 酸和 氨基酸序 列比 對(duì) 表明番 茄 ARPC5 與擬