第43 卷 第1 期 浙 江 師 范 大 學(xué) 學(xué) 報(bào) 自 然 科 學(xué) 版 Vol 43 No 1 2020 年2 月 JournalofZhejiangNormalUniversity Nat Sci Feb 2020 DOI 10 16218 j issn 1001 5051 2020 01 011 番 茄 灰 霉 菌 拮 抗 細(xì) 菌 的 篩 選 鑒 定 及 評(píng) 價(jià) 葉 濤 1 劉 敏 1 任 哲 昕 2 詹 旭 芳 2 金 一 禾 1 王 長(zhǎng) 春 1 1 浙 江 師 范 大 學(xué) 化 學(xué) 與 生 命 科 學(xué) 學(xué) 院 浙 江 金 華 321004 2 浙 江 師 范 大 學(xué) 行 知 學(xué) 院 浙 江 金 華 321004 摘 要 為 分 離 鑒 定 一 些 對(duì) 番 茄 灰 霉 菌 具 有 拮 抗 作 用 且 適 合 當(dāng) 地 生 境 的 生 防 細(xì) 菌 以 金 華 連 續(xù)10 年 的 番 茄 種 植 保 護(hù) 地 土 壤 為 材 料 分 離 細(xì) 菌 并 以 灰 霉 菌 為 靶 標(biāo) 菌 對(duì) 其 拮 抗 效 果 進(jìn) 行 檢 驗(yàn) 對(duì) 候 選 菌 株 進(jìn) 行 格 蘭 氏 染 色 將 其16SrDNA 序 列 與GenBank 中 已 知 標(biāo) 準(zhǔn) 菌 株 的16SrDNA 序 列 比 對(duì) 利 用Neighbor joining 方 法 構(gòu) 建 進(jìn) 化 樹 通 過(guò) 菌 株 發(fā) 酵 液 灌 根 番 茄 后48h 離 體 葉 片 挑 戰(zhàn) 接 種 番 茄 灰 霉 菌 以 及 溫 室 盆 栽 接 種 實(shí) 驗(yàn) 明 確 其 防 治 效 果 結(jié) 果 顯 示 分 離 獲 得5 株 疑 似 芽 孢 桿 菌 其 中1 株 JH 2 對(duì) 番 茄 灰 霉 病 菌 具 有 較 高 抗 性 鑒 定 為 芽 孢 桿 菌 屬 Bacillussp 與 標(biāo) 準(zhǔn) 菌 株AB735995 1 解 淀 粉 酶 芽 孢 桿 菌 Bacillusamyloliquefaciens 聚 于 同 一 分 支 同 源 性 高 達(dá)99 菌 株JH 2 發(fā) 酵 液 處 理 的 番 茄 葉 片 病 斑 面 積 為 對(duì) 照 處 理 的77 防 治 效 果 為22 3 菌 株JH 2 處 理 后 對(duì) 番 茄 灰 霉 的 防 治 效 果 為38 9 以 上 結(jié) 果 表 明 解 淀 粉 酶 芽 孢 桿 菌JH 2 灌 根 后 可 以 觸 發(fā) 番 茄 植 株 系 統(tǒng) 抗 病 性 增 強(qiáng) 植 株 免 疫 能 力 關(guān) 鍵 詞 分 離 芽 孢 桿 菌 番 茄 灰 霉 菌 防 治 效 果 中 圖 分 類 號(hào) S476 文 獻(xiàn) 標(biāo) 識(shí) 碼 A 文 章 編 號(hào) 1001 5051 2020 01 0060 06 Isolation identification screeningandevaluationofantagonistic bacteriumagainst B o t r y t i s c i n e r e a l YETao 1 LIUMin 1 RENZhexin 2 ZHANXunfang 2 JINGYihe 1 WANGChangchun 1 1 CollegeofChemistryandLifeSciences ZhejiangNormalUniversity Jinhua321004 China 2 XingzhiCollege ZhejiangNormalUniversity Jinhua321004 China Abstract InordertoisolateandidentifysomebiocontrolbacteriaantagonistictoBotrytiscinerealandsuitable forlocalhabitats thesoiloftomatoplantingprotectionareafor10consecutiveyearsinJinhuawasusedasma terialtoisolatebacteria TheantagonisticeffectofBotrytiscinerealwastested Thecandidatestrainswere stainedwithGram sstaining andtheir16SrDNAsequenceswerecomparedwiththoseoftheknownstandard strainsinGenBank Neighbor joiningmethodwasusedtoconstructevolutionarytree 48hoursafterroottoma towasirrigatedwithstrainfermentationbroth thecontroleffectwasconfirmedbychallenginginoculationof graymoldfromisolatedleavesandpotcultureingreenhouse TheresultsshowedthatfivesuspectedBacillus strainswereisolatedandoneofthem JH 2 washighlyresistanttoBotrytiscinereal identifiedasBacillus 收 文 日 期 2018 12 19 修 訂 日 期 2019 03 04 基 金 項(xiàng) 目 浙 江 省 自 然 科 學(xué) 基 金 資 助 項(xiàng) 目 LY20C140002 國(guó) 家 自 然 科 學(xué) 基 金 資 助 項(xiàng) 目 31071643 作 者 簡(jiǎn) 介 葉 濤 1993 男 浙 江 金 華 人 碩 士 研 究 生 研 究 方 向 植 物 病 理 學(xué) 通 信 作 者 王 長(zhǎng) 春 E mail wcc sp andstandardbacteriaBacillusamyloliquefaciensstrainAB735995 1clusteredinthesamebranchwith 99 homology tomatoleaflesionareatreatedwithJH 2fermentationbrothwas77 ofthecontroltreatment andthecontroleffectwas22 3 ThecontroleffectofstrainJH 2ontomatograymoldwas38 9 There sultsshowedthatBacillusamyloliquefaciensJH 2couldtriggerafterrootirrigation improvetomatoplantsys temdiseaseresistance enhancetheimmunityofplants Keywords isolation Bacillus Botrytiscinereal controleffect 由 半 知 菌 亞 門 灰 葡 萄 孢 Botrytis cinerea Pers 引 起 的 灰 霉 病 是 一 種 世 界 性 病 害 病 菌 通 過(guò) 侵 染 果 蔬 的 根 莖 葉 花 和 果 實(shí) 形 成 軟 腐 倒 伏 花 腐 和 果 腐 等 病 害 每 年 造 成 近 十 億 歐 元 的 損 失 1 4 近 年 來(lái) 伴 隨 著 蔬 菜 種 植 面 積 的 不 斷 擴(kuò) 大 灰 霉 病 發(fā) 展 成 危 害 最 為 嚴(yán) 重 的 病 害 之 一 因 灰 霉 菌 變 異 快 容 易 對(duì) 很 多 殺 菌 劑 產(chǎn) 生 抗 藥 性 5 遼 寧 省 番 茄 灰 霉 病 菌 對(duì) 腐 霉 利 的 抗 藥 性 呈 現(xiàn) 加 重 的 趨 勢(shì) EC 50 值 平 均 為3 99mg L 抗 性 頻 率 達(dá) 到 83 48 6 北 京 地 區(qū) 番 茄 灰 霉 病 菌 對(duì) 多 菌 靈 乙 霉 威 腐 霉 利 與 異 菌 脲 產(chǎn) 生 抗 性 菌 株 的 頻 率 分 別 為98 80 97 59 91 57 和92 77 3 番 茄 灰 霉 病 的 防 治 主 要 靠 化 學(xué) 藥 劑 但 灰 霉 病 菌 生 理 小 種 變 異 頻 繁 而 新 型 殺 菌 劑 的 研 制 周 期 又 長(zhǎng) 實(shí) 際 生 產(chǎn) 過(guò) 程 中 只 有 通 過(guò) 加 大 藥 劑 用 量 和 縮 短 施 藥 周 期 來(lái) 進(jìn) 行 防 治 以 至 于 形 成 大 藥 量 到 高 抗 性 再 從 高 抗 性 到 大 藥 量 的 惡 性 循 環(huán) 對(duì) 環(huán) 境 造 成 嚴(yán) 重 污 染 6 生 物 防 治 特 別 是 生 防 細(xì) 菌 具 有 安 全 無(wú) 污 染 不 產(chǎn) 生 抗 藥 性 等 特 點(diǎn) 成 為 當(dāng) 今 病 害 防 治 的 新 星 木 霉 7 放 線 菌 8 和 芽 孢 桿 菌 等 對(duì) 番 茄 灰 霉 病 有 較 好 防 治 效 果 解 淀 粉 芽 孢 桿 菌fqhm 13 的 發(fā) 酵 上 清 液 對(duì) 番 茄 灰 霉 病 防 治 效 果 可 達(dá)78 1 9 解 淀 粉 芽 孢 桿 菌B15 菌 株 發(fā) 酵 液 中 的 抑 菌 混 合 物 質(zhì) 伊 枯 草 菌 素A iturinA 和 芬 芥 素 fengycin 通 過(guò) 誘 導(dǎo) 灰 霉 菌 絲 發(fā) 生 細(xì) 胞 凋 亡 的 形 式 來(lái) 抑 制 灰 葡 萄 孢 菌 絲 的 生 長(zhǎng) 10 枯 草 芽 孢 桿 菌PTS 394 通 過(guò) 激 活 一 系 列 防 衛(wèi) 相 關(guān) 基 因 來(lái) 誘 導(dǎo) 番 茄 產(chǎn) 生 對(duì) 灰 霉 病 的 系 統(tǒng) 抗 性 11 貝 萊 斯 芽 孢 桿 菌5YN8 可 以 抑 制 灰 霉 孢 子 萌 發(fā) 和 菌 絲 生 長(zhǎng) 并 在 植 物 體 內(nèi) 誘 導(dǎo) 基 礎(chǔ) 免 疫 反 應(yīng) 12 盡 管 有 許 多 利 用 芽 孢 桿 菌 防 治 番 茄 灰 霉 病 的 報(bào) 道 且 防 治 機(jī) 理 研 究 也 取 得 重 要 進(jìn) 展 但 在 實(shí) 際 應(yīng) 用 過(guò) 程 中 生 防 菌 會(huì) 受 環(huán) 境 因 素 等 多 方 面 影 響 導(dǎo) 致 防 治 效 率 普 遍 不 高 因 此 開(kāi) 展 生 防 菌 分 離 擴(kuò) 大 菌 質(zhì) 資 源 尋 找 適 合 當(dāng) 地 生 境 的 生 防 菌 依 然 是 目 前 生 物 防 治 工 作 的 重 點(diǎn) 研 究 以 番 茄 灰 霉 病 菌 為 靶 標(biāo) 菌 采 用 平 板 對(duì) 峙 法 對(duì) 特 定 生 境 土 壤 中 分 離 出 的 細(xì) 菌 進(jìn) 行 拮 抗 實(shí) 驗(yàn) 篩 選 出 對(duì) 灰 霉 病 菌 具 有 良 好 拮 抗 作 用 的 細(xì) 菌 通 過(guò) 形 態(tài) 特 征 分 析 革 蘭 氏 染 色 16SrDNA 序 列 分 析 方 法 對(duì) 細(xì) 菌 進(jìn) 行 初 步 的 鑒 定 并 檢 測(cè) 其 防 治 效 果 以 期 豐 富 生 物 防 治 番 茄 灰 霉 病 的 生 物 資 源 為 開(kāi) 發(fā) 新 型 農(nóng) 用 殺 菌 劑 提 供 材 料 1 材 料 與 方 法 1 1 實(shí) 驗(yàn) 菌 株 及 培 養(yǎng) 基 供 試 病 原 菌 灰 葡 萄 孢 菌 Botrytis cinereal Pers 從 金 華 番 茄 種 植 保 護(hù) 地 中 番 茄 病 株 上 分 離 獲 得 由 浙 江 師 范 大 學(xué) 化 學(xué) 與 生 命 科 學(xué) 學(xué) 院 植 物 學(xué) 實(shí) 驗(yàn) 室 保 藏 供 試 細(xì) 菌 菌 株 分 離 自 金 華 地 區(qū) 連 續(xù) 多 年 種 植 番 茄 的 保 護(hù) 地 土 壤 由 浙 江 師 范 大 學(xué) 化 學(xué) 與 生 命 科 學(xué) 學(xué) 院 植 物 學(xué) 實(shí) 驗(yàn) 室 保 藏 配 制 PDA 培 養(yǎng) 基 LB 培 養(yǎng) 基 肉 汁 胨 培 養(yǎng) 基 備 用 13 1 2 菌 株 的 活 化 及 發(fā) 酵 液 的 制 備 將 供 試 細(xì) 菌 及 番 茄 灰 霉 菌 分 別 接 種 至 肉 汁 胨 培 養(yǎng) 基 與PDA 培 養(yǎng) 基 斜 面 上 經(jīng) 復(fù) 壯 及 重 新 分 離 后 供 試 細(xì) 菌 分 別 接 種 于 裝 有50mLLB 液 體 培 養(yǎng) 基 的 三 角 瓶 中 28 200r min 振 蕩 培 養(yǎng)36h 收 集 培 養(yǎng) 液 離 心 10000r min 4 上 清 液 用 0 22 m 微 孔 濾 膜 過(guò) 濾 除 菌 制 成 發(fā) 酵 液 后 備 用 1 3 菌 株 的 篩 選 在 超 凈 工 作 臺(tái) 中 將 番 茄 灰 霉 孢 子 懸 浮 液 10 6 個(gè) mL 加 入 到 冷 卻 至50 左 右 的PDA 培 養(yǎng) 基 中 V 懸 浮 液 V 培 養(yǎng) 基 1 30 將 混 有 灰 霉 孢 子 的PDA 培 養(yǎng) 基 搖 晃 均 勻 后 倒 入 培 養(yǎng) 皿 中 用 鑷 子 夾 取 滅 過(guò) 菌 的 圓 形 濾 紙 片 直 徑5mm 放 置 在 培 養(yǎng) 皿 的 正 中 央 將 供 試 菌 株 的 發(fā) 酵 液 0 22 m 微 孔 濾 膜 過(guò) 濾 后 滴 加 到 濾 紙 片 上 晾 干 后 繼 續(xù) 滴 加 發(fā) 酵 液 反 復(fù)3 次 空 白 對(duì) 照 滴 加 等 量PD 培 養(yǎng) 基 將 上 述 培 養(yǎng) 皿 放 置 于37 培 養(yǎng) 箱 中 培 養(yǎng)4 5d 測(cè) 量 抑 菌 圈 直 徑 并 記 錄 1 6 第1 期 葉 濤 等 番 茄 灰 霉 菌 拮 抗 細(xì) 菌 的 篩 選 鑒 定 及 評(píng) 價(jià) 1 4 鑒 定 1 4 1 形 態(tài) 鑒 定 與 格 蘭 氏 染 色 鑒 定 菌 落 形 態(tài) 將 待 鑒 定 菌 株 接 種 于LB 固 體 培 養(yǎng) 基 培 養(yǎng)24h 觀 察 其 菌 落 形 態(tài) 菌 株 利 用 革 蘭 氏 染 色 進(jìn) 行 初 步 鑒 定 14 15 1 4 2 16SrDNA 基 因 擴(kuò) 增 及 序 列 分 析 根 據(jù) 細(xì) 菌 基 因 組 提 取 方 法 16 提 取 候 選 菌 株 基 因 組DNA PCR 反 應(yīng) 體 系 為20 L 其 中 包 括 2 Primer STAR Max Premix 混 合 反 應(yīng) 緩 沖 液 10 L 購(gòu) 自TaKaRa 公 司 上 下 游 引 物 為 細(xì) 菌 通 用 引 物27F 和1495R 各1 L DNA 模 板 為1 L 無(wú) 菌 水7 L 擴(kuò) 增 程 序 設(shè) 定 94 下 預(yù) 變 性 4min 94 變 性1min 56 退 火1min 72 延 伸1min 經(jīng) 過(guò)30 個(gè) 循 環(huán) 72 延 伸5min 95 滅 活10min 16 3min 結(jié) 束 后 在PCR 產(chǎn) 物 中 加0 3 L 的2 TaqMasterMix 購(gòu) 自TaKaRa 公 司 給 擴(kuò) 增 片 段 兩 頭 加A 堿 基 以 連 接T 載 體 反 應(yīng) 條 件 為 72 加A10min 結(jié) 束 后 用1 瓊 脂 糖 電 泳 檢 測(cè)PCR 擴(kuò) 增 產(chǎn) 物 用DNA 純 化 試 劑 盒 購(gòu) 自Anxgell 回 收 目 標(biāo) 片 段 與pGEM TEasy 載 體 購(gòu) 自Promega 公 司 連 接 經(jīng) 篩 選 得 到 的 陽(yáng) 性 克 隆 送 杭 州 擎 科 梓 熙 生 物 技 術(shù) 有 限 公 司 測(cè) 序 將PCR 產(chǎn) 物 核 苷 酸 序 列 通 過(guò)GenBank 中 的 Bankit 界 面 提 交 至GenBank 數(shù) 據(jù) 庫(kù) Blast 進(jìn) 行 序 列 比 對(duì) 以 搜 索 得 到 的 同 源 序 列 為 依 據(jù) 下 載 其 同 屬 近 緣 菌 種 的16SrDNA 序 列 運(yùn) 用MEGA6 程 序 構(gòu) 建 系 統(tǒng) 發(fā) 育 樹 采 用 鄰 接 法 Neighbor Joining 系 統(tǒng) 樹 的 檢 驗(yàn) 用Bootstrap 1000 次 重 復(fù) 1 5 JH 2 菌 株 發(fā) 酵 液 對(duì) 番 茄 灰 霉 病 的 防 治 效 果 利 用 實(shí) 驗(yàn) 檢 測(cè) 方 法 11 對(duì) 番 茄 離 體 葉 片 灰 霉 病 菌 致 病 性 及 盆 栽 防 治 效 果 分 析 實(shí) 驗(yàn) 受 試 番 茄 品 種 為Heinz1706 接 種 后 培 養(yǎng)3d 觀 察 記 錄 結(jié) 果 以 葉 片 上 最 長(zhǎng) 的 病 斑 為 長(zhǎng) mm 最 寬 的 病 斑 為 寬 mm 病 斑 面 積 及 發(fā) 病 程 度 計(jì) 算 公 式 如 下 病 斑 面 積 長(zhǎng) 寬 4 發(fā) 病 程 度 病 斑 面 積 整 個(gè) 葉 面 積 100 病 情 指 數(shù) 分 級(jí) 標(biāo) 準(zhǔn) 0 級(jí) 無(wú) 病 斑 1 級(jí) 病 斑 占 整 個(gè) 葉 面 積 的5 以 下 3 級(jí) 病 斑 占 整 個(gè) 葉 面 積 的 5 15 5 級(jí) 病 斑 占 整 個(gè) 葉 面 積 的 15 25 7 級(jí) 病 斑 占 整 個(gè) 葉 面 積 的 25 50 9 級(jí) 病 斑 占 整 個(gè) 葉 面 積 的50 及 以 上 病 情 指 數(shù) 及 相 對(duì) 防 治 效 果 計(jì) 算 公 式 如 下 病 情 指 數(shù) 各 級(jí) 病 葉 數(shù) 該 病 級(jí) 數(shù) 調(diào) 查 總 葉 數(shù) 最 高 級(jí) 數(shù) 100 相 對(duì) 防 治 效 果 對(duì) 照 病 情 指 數(shù) 處 理 病 情 指 數(shù) 對(duì) 照 病 情 指 數(shù) 100 2 結(jié) 果 與 分 析 2 1 拮 抗 菌 株 的 篩 選 進(jìn) 一 步 對(duì) 實(shí) 驗(yàn) 室 前 期 得 到 的5 株 細(xì) 菌 進(jìn) 行 拮 抗 篩 選 發(fā) 現(xiàn) 其 對(duì) 番 茄 灰 霉 菌 都 具 有 較 強(qiáng) 的 拮 抗 活 性 抑 菌 圈 直 徑 均 大 于14mm 其 中JH 2 菌 株 抑 菌 圈 直 徑 最 大 為16mm 見(jiàn) 圖1 a 灰 霉 孢 子 培 養(yǎng) 基 b 發(fā) 酵 液 與 灰 霉 對(duì) 峙 模 式 圖 PD 為 馬 鈴 薯 液 體 培 養(yǎng) 基 c JH 1 與 灰 霉 對(duì) 峙 培 養(yǎng) 基 d JH 4 與 灰 霉 對(duì) 峙 培 養(yǎng) 基 e HQ 3 與 灰 霉 對(duì) 峙 培 養(yǎng) 基 f HQ 2 與 灰 霉 對(duì) 峙 培 養(yǎng) 基 g JH 2 與 灰 霉 對(duì) 峙 培 養(yǎng) 基 圖1 菌 株 發(fā) 酵 液 對(duì) 番 茄 灰 霉 的 拮 抗 作 用 2 6 浙 江 師 范 大 學(xué) 學(xué) 報(bào) 自 然 科 學(xué) 版 2020 年 2 2 拮 抗 細(xì) 菌JH 2 菌 株 的 鑒 定 2 2 1 形 態(tài) 及 格 蘭 氏 染 色 菌 株 在PDA 平 板 上 生 長(zhǎng) 菌 落 呈 花 瓣 形 不 透 明 表 面 褶 皺 乳 白 邊 緣 整 齊 見(jiàn) 圖2a 格 蘭 氏 染 色 結(jié) 果 表 明 該 菌 為 格 蘭 氏 陽(yáng) 性 見(jiàn) 圖2b 綜 合JH 2 菌 株 的 形 態(tài) 特 征 和 格 蘭 氏 染 色 初 步 鑒 定 為 芽 孢 桿 菌 屬 14 圖2 JH 2 形 態(tài) 特 征 及 革 蘭 氏 染 色 圖3 JH 2PCR 擴(kuò) 增 電 泳 圖 2 2 2 拮 抗 細(xì) 菌 的16SrDNA 的 序 列 分 析 JH 2 菌 株 的16S rDNA 經(jīng) 測(cè) 序 后 序 列 長(zhǎng) 1460bp 見(jiàn) 圖3 通 過(guò)GenBank 得 到 序 列 登 錄 號(hào) 為MK203823 在NCBI 中Blast 比 對(duì) 分 析 下 載 同 源 性 高 的 同 屬 菌 種 利 用MEGA6 程 序 構(gòu) 建 系 統(tǒng) 發(fā) 育 樹 見(jiàn) 圖4 采 用 鄰 接 法 Neighbor Join ing 系 統(tǒng) 樹 的 檢 驗(yàn) 用Bootstrap1000 次 重 復(fù) 發(fā) 現(xiàn) 菌 株JH 2 與 來(lái) 源 于 一 個(gè) 玉 米 種 植 田 的 解 淀 粉 芽 孢 桿 菌 AB735995 1 同 源 性 幾 乎 完 全 相 同 確 證JH 2 為 解 淀 粉 芽 孢 桿 菌 圖4 JH 2 菌 株16SrDNA 序 列 的 系 統(tǒng) 發(fā) 育 樹 2 3 拮 抗 細(xì) 菌JH 2 灌 根 后 對(duì) 番 茄 灰 霉 病 防 治 效 果 接 種3d 后 對(duì) 照 葉 片 出 現(xiàn) 大 面 積 的 壞 死 病 斑 而 菌 株JH 2 處 理 后 的 葉 片 呈 現(xiàn) 較 少 的 壞 死 區(qū) 域 見(jiàn) 圖5a 菌 株JH 2 處 理 的 番 茄 葉 片 病 斑 面 積 為 對(duì) 照 處 理 的77 病 斑 占 葉 片 面 積 比 例 為 64 38 無(wú) 菌 水 對(duì) 照 葉 片 病 斑 占 葉 面 積 的 比 例 為 83 17 見(jiàn) 圖5b 通 過(guò) 計(jì) 算 得 出 菌 株JH 2 誘 發(fā) 的 番 茄 抗 病 性 對(duì) 灰 霉 的 防 治 效 果 達(dá)22 3 根 據(jù) 病 情 指 數(shù) 分 級(jí) 標(biāo) 準(zhǔn) 見(jiàn) 圖6 盆 栽 番 茄 灰 霉 病 發(fā) 病 指 數(shù) 調(diào) 查 顯 示 見(jiàn) 表1 無(wú) 菌 水 對(duì) 照 處 理 番 茄 灰 霉 病 病 情 指 數(shù) 為37 8 而 菌 株JH 2 處 理 的 發(fā) 病 指 數(shù) 為23 1 菌 株JH 2 處 理 的 防 治 效 果 為38 9 實(shí) 驗(yàn) 表 明 菌 株JH 2 通 過(guò) 灌 根 處 理 也 可 誘 導(dǎo) 番 茄 對(duì) 灰 霉 病 的 抗 性 表1 不 同 處 理 下 病 情 指 數(shù) 統(tǒng) 計(jì) 表 葉 片 數(shù)0 級(jí) 1 級(jí) 3 級(jí) 5 級(jí) 7 級(jí) 9 級(jí) 病 情 指 數(shù) JH 2 灌 根 50 20 16 4 2 3 5 23 1 無(wú) 菌 水 灌 根 50 20 9 1 3 5 12 37 8 3 6 第1 期 葉 濤 等 番 茄 灰 霉 菌 拮 抗 細(xì) 菌 的 篩 選 鑒 定 及 評(píng) 價(jià) 圖5 JH 2 對(duì) 番 茄 灰 霉 的 離 體 葉 片 防 效 圖6 病 情 指 數(shù) 分 級(jí) 標(biāo) 準(zhǔn) 3 討 論 隨 著 人 們 對(duì) 食 品 安 全 認(rèn) 識(shí) 的 提 高 和 對(duì) 健 康 的 關(guān) 注 生 物 農(nóng) 藥 越 來(lái) 越 受 到 重 視 從 不 同 生 境 和 作 物 中 分 離 潛 在 的 微 生 物 種 質(zhì) 資 源 是 開(kāi) 發(fā) 生 物 農(nóng) 藥 的 主 要 手 段 研 究 表 明 從 寄 主 與 病 原 菌 共 存 的 土 壤 中 篩 選 到 理 想 生 防 菌 株 的 可 能 性 較 大 推 測(cè) 拮 抗 菌 株 與 病 原 菌 之 間 除 具 有 競(jìng) 爭(zhēng) 拮 抗 關(guān) 系 外 還 具 有 共 存 相 隨 關(guān) 系 17 芽 孢 桿 菌 是 非 常 重 要 的 一 類 生 防 菌 應(yīng) 用 十 分 廣 泛 部 分 菌 株 在 國(guó) 內(nèi) 外 均 有 商 品 化 的 制 劑 用 于 防 治 多 種 植 物 病 害 及 作 為 飼 料 添 加 劑 增 加 動(dòng) 物 免 疫 能 力 18 19 芽 孢 桿 菌 可 以 分 泌 抗 菌 肽 19 脂 肽 類 20 和 水 解 酶 類 物 質(zhì) 21 等 物 質(zhì) 來(lái) 抑 制 病 原 物 生 長(zhǎng) 也 可 以 通 過(guò) 產(chǎn) 生 活 性 小 分 子 物 質(zhì) 激 活 水 楊 酸 信 號(hào) 通 路 而 引 起 系 統(tǒng) 獲 得 抗 性 SAR 22 其 中 解 淀 粉 芽 孢 桿 菌 能 夠 通 過(guò) 非 核 糖 體 途 徑 合 成 具 有 抗 真 菌 活 性 的 環(huán) 狀 脂 肽 芽 孢 菌 霉 素 bacillomycinD 和fengycin 23 也 能 通 過(guò) 聚 酮 合 酶 合 成 具 有 抗 白 葉 枯 菌 活 性 的 聚 酮 化 合 物 地 非 西 丁 Difficidin 和 芽 孢 菌 溶 素 bacilysin 24 本 研 究 從 番 茄 多 年 種 植 保 護(hù) 地 土 壤 中 分 離 得 到 了 一 株 對(duì) 番 茄 灰 霉 菌 具 有 較 強(qiáng) 拮 抗 作 用 的 菌 株JH 2 經(jīng) 形 態(tài) 學(xué) 生 化 與 分 子 手 段 鑒 定 明 確 該 菌 株 為 解 淀 粉 芽 孢 桿 菌 在 對(duì) 峙 實(shí) 驗(yàn) 中 JH 2 發(fā) 酵 液 對(duì) 番 茄 灰 霉 菌 有 較 強(qiáng) 的 抑 制 效 果 由 于2 種 微 生 物 沒(méi) 有 直 接 接 觸 說(shuō) 明 分 離 菌 株 可 能 分 泌 了 抗 菌 肽 脂 肽 類 或 其 他 揮 發(fā) 性 物 質(zhì) 對(duì) 灰 霉 菌 產(chǎn) 孢 孢 子 萌 發(fā) 與 菌 絲 的 生 長(zhǎng) 產(chǎn) 生 抑 制 作 用 已 有 研 究 表 明 一 些 芽 孢 桿 菌 產(chǎn) 生 的 揮 發(fā) 物 可 以 使 菌 絲 細(xì) 胞 內(nèi) 發(fā) 生 較 為 強(qiáng) 烈 的 程 序 性 細(xì) 胞 壞 死 與 活 性 氧 的 積 累 導(dǎo) 致 菌 絲 生 長(zhǎng) 受 到 抑 制 10 揮 發(fā) 物 也 可 以 使 菌 絲 的 形 態(tài) 結(jié) 構(gòu) 發(fā) 生 改 變 菌 絲 消 融 細(xì) 胞 膜 破 裂 與 原 生 質(zhì) 體 滲 漏 最 終 產(chǎn) 孢 結(jié) 構(gòu) 異 常 而 導(dǎo) 致 孢 子 產(chǎn) 生 受 到 抑 制 25 因 此 需 要 在 今 后 進(jìn) 一 步 明 確JH 2 是 通 過(guò) 何 種 方 式 抑 制 灰 霉 菌 生 長(zhǎng) 此 外 在 番 茄 上 施 加 發(fā) 酵 上 清 液 后 增 強(qiáng) 了 番 茄 對(duì) 灰 霉 病 的 抗 性 表 明JH 2 除 了 可 以 產(chǎn) 生 直 接 抑 制 真 菌 生 長(zhǎng) 的 物 質(zhì) 外 可 能 還 會(huì) 分 泌 一 些 具 有 誘 導(dǎo) 抗 性 的 活 性 物 質(zhì) 誘 導(dǎo) 抗 性 主 要 分 為 ISR 與SAR2 種 前 者 是 由 茉 莉 酸 JA 途 徑 介 導(dǎo) 后 者 則 依 賴 于 水 楊 酸 SA 信 號(hào) 途 徑 芽 孢 桿 菌 可 以 產(chǎn) 生 某 種 或 某 些 揮 發(fā) 性 物 質(zhì) 誘 導(dǎo) 其 產(chǎn) 生 ISR 26 它 的 代 謝 產(chǎn) 物 也 會(huì) 使 一 些SA 信 號(hào) 途 徑 中 的 關(guān) 鍵 酶 活 性 提 高 和 誘 導(dǎo)PR1a 和NPR1 的 表 達(dá) 說(shuō) 明 具 有 激 活SAR 抗 性 的 能 力 11 貝 萊 斯 芽 孢 桿 菌5YN8 除 了 具 有 誘 導(dǎo)SAR 抗 性 能 力 外 還 具 有 誘 導(dǎo) 系 統(tǒng) 性 抗 性 的 能 力 12 這 表 明 不 同 生 防 菌 的 抗 性 機(jī) 制 具 有 多 樣 性 和 部 分 重 疊 性 因 此 將 不 同 抗 性 機(jī) 制 的 生 防 菌 混 合 使 用 可 能 對(duì) 提 高 抗 性 具 有 重 要 作 用 JH 2 在 番 茄 上 的 這 種 誘 導(dǎo) 抗 性 究 竟 屬 于ISR 或SAR 需 要 通 過(guò) 分 子 生 物 學(xué) 的 方 法 進(jìn) 一 步 鑒 定 此 外 也 需 要 對(duì)JH 2 分 泌 4 6 浙 江 師 范 大 學(xué) 學(xué) 報(bào) 自 然 科 學(xué) 版 2020 年 的 活 性 物 質(zhì) 進(jìn) 行 分 離 與 純 化 以 進(jìn) 一 步 明 確 該 菌 株 的 誘 導(dǎo) 抗 性 機(jī) 制 總 之 實(shí) 驗(yàn) 中 分 離 獲 得 的 一 株 解 淀 粉 芽 孢 桿 菌 具 有 直 接 抑 制 番 茄 灰 霉 菌 生 長(zhǎng) 的 作 用 同 時(shí) 也 具 有 誘 導(dǎo) 植 物 產(chǎn) 生 系 統(tǒng) 性 抗 性 的 能 力 參 考 文 獻(xiàn) 1 趙 楊 苗 則 彥 李 穎 等 番 茄 灰 霉 病 防 治 研 究 進(jìn) 展 J 中 國(guó) 植 保 導(dǎo) 刊 2014 34 7 21 29 2 紀(jì) 軍 建 張 小 風(fēng) 王 文 橋 等 番 茄 灰 霉 病 防 治 研 究 進(jìn) 展 J 中 國(guó) 農(nóng) 學(xué) 通 報(bào) 2012 28 31 109 113 3 喬 廣 行 嚴(yán) 紅 么 奕 清 等 北 京 地 區(qū) 番 茄 灰 霉 病 菌 的 多 重 抗 藥 性 檢 測(cè) J 植 物 保 護(hù) 2011 37 5 176 180 4 RALPHD JANAL VANK etal Thetop10fungalpathogensinmolecularplantpathology J MolPlantPathol 2012 doi 10 1111 j 1364 3703 2012 00822 x 5 OLIVEIRAMS AMIRIA ZUNIGAAI etal SourcesofprimaryinoculumofBotrytiscinereaandtheirimpactonfungicideresistancedevelop mentincommercialstrawberryfields J PlantDis 2017 101 10 1761 1768 6 杜 穎 付 丹 妮 鄒 益 澤 等 2017 年 遼 寧 省 番 茄 灰 霉 病 菌 對(duì) 腐 霉 利 的 抗 藥 性 現(xiàn) 狀 及 機(jī) 制 研 究 J 中 國(guó) 蔬 菜 2018 1 58 65 7 ELADY BiocontrolTrichodemaharzianumT39preparationforbiocontrolofplantdiseasescontrolofBotrytiscsclerotiorumandCladosporium fulvum J BiocontrolSciTechn 2000 10 4 499 507 8 石 玉 瑩 宋 海 慧 苗 爽 等 番 茄 灰 霉 病 和 葉 霉 病 拮 抗 細(xì) 菌WXCDD51 的 篩 選 鑒 定 及 其 生 防 促 生 作 用 J 園 藝 學(xué) 報(bào) 2017 44 10 1925 1936 9 王 亞 杰 高 宇 陳 曉 萌 等 解 淀 粉 芽 胞 桿 菌 防 治 番 茄 果 實(shí) 灰 霉 病 及 其 抑 菌 物 質(zhì) 分 析 J 園 藝 學(xué) 報(bào) 2018 45 7 1296 1304 10 潘 虹 余 金 瑋 鋆 張 曉 蒙 等 解 淀 粉 芽 孢 桿 菌B15 抑 菌 物 質(zhì) 對(duì) 葡 萄 灰 霉 病 灰 葡 萄 孢 的 抑 菌 機(jī) 理 J 微 生 物 學(xué) 報(bào) 2018 58 7 1245 1254 11 喬 俊 卿 張 心 寧 梁 雪 杰 等 枯 草 芽 孢 桿 菌PTS 394 誘 導(dǎo) 番 茄 對(duì) 灰 霉 病 的 系 統(tǒng) 抗 性 J 中 國(guó) 生 物 防 治 學(xué) 報(bào) 2017 33 2 219 225 12 JIANGCH LIAOMJ WANGHK etal Bacillusvelezensis apotentialandefficientbiocontrolagentincontrolofpeppergraymoldcaused byBotrytiscinerea J BiolControl 2018 126 147 157 13 方 中 達(dá) 植 病 研 究 方 法 M 3 版 北 京 中 國(guó) 農(nóng) 業(yè) 出 版 社 1998 14 東 秀 珠 蔡 妙 英 常 見(jiàn) 細(xì) 菌 系 統(tǒng) 鑒 定 手 冊(cè) M 北 京 科 學(xué) 出 版 社 2001 15 HOLTJG KRIEGNR SNEATHPHA etal Bergey smanualofdeterminativebacteriology M 9thed Philadelphia LippincottWilliams andWilkins 1994 16 張 飛 鵬 枯 草 芽 孢 桿 菌X2 菌 株 的 篩 選 與 應(yīng) 用 D 哈 爾 濱 黑 龍 江 八 一 農(nóng) 墾 大 學(xué) 2011 17 張 斌 喬 俊 卿 梁 雪 杰 等 番 茄 枯 萎 病 菌 和 青 枯 病 菌 拮 抗 細(xì) 菌 的 評(píng) 價(jià) J 植 物 保 護(hù) 學(xué) 報(bào) 2015 42 3 353 361 18 石 水 琴 蔣 雯 袁 林 等 4 株 芽 孢 桿 菌 的 分 離 鑒 定 與 生 物 學(xué) 特 性 分 析 J 江 蘇 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 2018 46 2 112 115 19 趙 新 林 趙 思 峰 枯 草 芽 孢 桿 菌 對(duì) 植 物 病 害 生 物 防 治 的 作 用 機(jī) 理 J 湖 北 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 2011 50 15 167 172 20 薛 鵬 琦 劉 芳 喬 俊 卿 等 油 菜 菌 核 病 生 防 芽 孢 桿 菌 的 分 離 鑒 定 及 其 脂 肽 化 合 物 分 析 J 植 物 保 護(hù) 學(xué) 報(bào) 2011 38 2 127 132 21 林 福 呈 李 德 葆 枯 草 芽 孢 桿 菌 Bacillussubtilis S9 對(duì) 植 物 病 原 真 菌 的 溶 菌 作 用 J 植 物 病 理 學(xué) 報(bào) 2003 33 2 174 177 22 姜 莉 莉 陳 彥 闖 辛 明 秀 枯 草 芽 孢 桿 菌 在 防 治 植 物 病 害 上 的 應(yīng) 用 及 研 究 進(jìn) 展 J 安 徽 農(nóng) 學(xué) 通 報(bào) 2009 15 7 37 39 23 KOUMOUTSIA CHENXH HENNEA etal Structuralandfunctionalcharacterizationofgeneclustersdirectingnonribosomalsynthesisof bioactivecycliclipopeptidesinBacillusamyloliquefaciensstrainFZB42 J JBacteriol 2004 186 4 1084 1096 24 WUL WUH CHENL etal DifficidinandbacilysinfromBacillusamyloliquefaciensFZB42haveantibacterialactivityagainstXanthomonas oryzaericepathogens J SciRep UK 2015 5 5 1 9 25 鄧 建 良 劉 紅 彥 劉 玉 霞 等 解 淀 粉 芽 孢 桿 菌YN 1 抑 制 植 物 病 原 真 菌 活 性 物 質(zhì) 鑒 定 J 植 物 病 理 學(xué) 報(bào) 2010 40 2 202 209 26 RYUCM FARAGMA HUCH etal BacterialvolatilespromotegrowthinArabidopsis J PNAS 2003 100 8 4927 4932 責(zé) 任 編 輯 徐 玲 玲 5 6 第1 期 葉 濤 等 番 茄 灰 霉 菌 拮 抗 細(xì) 菌 的 篩 選 鑒 定 及 評(píng) 價(jià)