山 東 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 20 19 51 12 7 8 8 1 Sha n d o ng A g r i c ul t u r a l S c i e nc e s D O I 1 0 1 4 0 8 3 j i s s n 1 0 0 1 4 9 4 2 2 0 1 9 1 2 0 1 6 收 稿 日 期 2 0 1 9 0 9 0 7 基 金 項(xiàng) 目 山 東 省 現(xiàn) 代 農(nóng) 業(yè) 產(chǎn) 業(yè) 技 術(shù) 體 系 項(xiàng) 目 S D A I T 0 5 0 2 山 東 省 自 然 科 學(xué) 基 金 項(xiàng) 目 Z R 2 0 1 4 C Q 0 3 4 山 東 省 農(nóng) 業(yè) 良 種 工 程 項(xiàng) 目 2 0 1 7 L Z G C 0 1 3 青 島 市 民 生 科 技 計 劃 項(xiàng) 目 1 8 6 1 1 1 4 n s h 作 者 簡 介 張 秀 1 9 9 4 女 山 西 昔 陽 人 碩 士 主 要 從 事 蔬 菜 遺 傳 育 種 及 生 物 技 術(shù) 研 究 E m a i l z h a g n x i u q w e r 1 2 3 4 1 6 3 c o m 通 訊 作 者 王 富 1 9 6 6 男 黑 龍 江 明 水 人 博 士 教 授 研 究 方 向 為 蔬 菜 遺 傳 育 種 及 生 物 技 術(shù) E m a i l w a n g f u a b c d 1 6 3 c o m 山 東 省 番 茄 尖 孢 鐮 刀 菌 的 分 離 及 鑒 定 張 秀 劉 蕾 王 輝 李 文 麗 王 富 青 島 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 園 藝 學(xué) 院 青 島 市 遺 傳 改 良 與 育 種 重 點(diǎn) 實(shí) 驗(yàn) 室 山 東 青 島 2 6 6 1 0 9 摘 要 本 研 究 以 山 東 省 單 縣 番 茄 枯 萎 病 及 臨 淄 壽 光 膠 州 即 墨 海 陽 萊 陽 等 地 區(qū) 的 番 茄 頸 腐 根 腐 病 發(fā) 病 植 株 為 主 要 試 驗(yàn) 材 料 對 病 原 菌 進(jìn) 行 分 離 純 化 及 培 養(yǎng) 并 利 用 分 子 檢 測 技 術(shù) 對 供 試 菌 株 進(jìn) 行 生 理 小 種 鑒 定 結(jié) 果 顯 示 山 東 單 縣 番 茄 枯 萎 病 的 致 病 菌 為 番 茄 枯 萎 病 菌 生 理 小 種 1 其 他 地 區(qū) 番 茄 頸 腐 根 腐 病 致 病 菌 為 番 茄 枯 萎 病 菌 生 理 小 種 3 關(guān) 鍵 詞 山 東 省 番 茄 分 子 檢 測 尖 孢 鐮 刀 菌 中 圖 分 類 號 S 4 3 2 4 4 文 獻(xiàn) 標(biāo) 識 號 A 文 章 編 號 1 0 0 1 4 9 4 2 2 0 1 9 1 2 0 0 7 8 0 4 I s o l a t i o n a n d I d e n t i f i c a t i o n o f T o m a t o F u s a r i u m o x y s p o r u m i n S h a n d o n g P r o v i n c e Z ha n g X i u L i u L e i W a n g H ui L i W e nl i W a ng F u C o l l e g e o f H o r t i c u l t u r e Q i n g d a o A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y K e y L a b o r a t o r y o f G e n e t i c I m p r o v e m e n t T o m a t o M o l e c ul a r m a r ke r s F us ar i um o x y s p o r um 番 茄 枯 萎 病 和 番 茄 頸 腐 病 是 危 害 番 茄 生 產(chǎn) 的 主 要 土 傳 病 害 尤 其 在 華 北 東 北 地 區(qū) 發(fā) 病 較 為 嚴(yán) 重 1 有 研 究 表 明 引 起 番 茄 枯 萎 病 和 頸 腐 病 的 病 原 菌 均 為 尖 孢 鐮 刀 菌 2 尖 孢 鐮 刀 菌 不 同 生 理 小 種 在 不 同 植 株 上 具 有 特 定 的 致 病 性 3 7 不 同 專 化 型 和 生 理 小 種 引 起 的 病 害 需 要 不 同 的 防 治 方 法 所 以 準(zhǔn) 確 確 定 專 化 型 和 生 理 小 種 對 預(yù) 防 治 理 由 尖 孢 鐮 刀 菌 引 起 的 病 害 尤 其 重 要 雖 然 尖 孢 鐮 刀 菌 的 類 型 可 以 通 過 選 擇 性 培 養(yǎng) 基 上 表 現(xiàn) 的 形 態(tài) 特 征 來 確 定 8 9 但 是 尖 孢 鐮 刀 菌 的 致 病 類 型 專 化 型 和 種 族 卻 不 能 由 此 鑒 定 目 前 最 普 遍 的 鑒 定 方 法 是 利 用 試 驗(yàn) 接 種 法 確 定 尖 孢 鐮 刀 菌 的 專 化 型 和 相 應(yīng) 生 理 小 種 但 是 這 種 方 法 耗 時 長 1 0 1 1 本 研 究 借 助 分 子 檢 測 手 段 對 分 離 的 病 原 物 進(jìn) 行 鑒 定 從 而 明 確 山 東 省 枯 萎 病 和 頸 腐 根 腐 病 病 原 菌 的 生 理 小 種 1 材 料 與 方 法 1 1 試 驗(yàn) 材 料 采 自 山 東 省 單 縣 臨 淄 壽 光 膠 州 即 墨 海 陽 萊 陽 地 區(qū) 番 茄 植 株 發(fā) 病 的 根 或 莖 1 2 試 驗(yàn) 方 法 1 2 1 真 菌 的 分 離 純 化 及 培 養(yǎng) 選 用 新 近 發(fā) 病 的 番 茄 植 株 作 為 分 離 材 料 使 用 之 前 表 面 噴 70 乙 醇 將 表 皮 組 織 用 滅 菌 解 剖 刀 削 去 在 病 健 交 界 處 取 材 切 取 其 中 小 塊 變 色 的 維 管 束 組 織 升 汞 滅 菌 后 用 無 菌 水 沖 洗 數(shù) 次 放 于 P D A 培 養(yǎng) 基 上 每 個 培 養(yǎng) 基 放 1 3 塊 2 5 培 養(yǎng) 5 d 即 可 長 出 菌 落 參 照 孫 飛 龍 1 2 的 方 法 進(jìn) 行 單 孢 分 離 將 純 化 的 單 菌 落 接 種 到 P D A 培 養(yǎng) 基 上 培 養(yǎng) 5 d 觀 察 菌 落 形 態(tài) 大 小 和 顏 色 等 用 移 液 槍 吸 取 P D B 液 體 培 養(yǎng) 基 反 復(fù) 沖 洗 吹 打 菌 落 將 沖 洗 下 來 的 孢 子 和 菌 絲 加 入 150 m L 馬 鈴 薯 葡 萄 糖 液 體 培 養(yǎng) 基 中 于 180 r m i n 的 搖 床 上 振 蕩 培 養(yǎng) 5 d 收 集 菌 絲 用 于 D N A 提 取 1 2 2 D N A 提 取 將 液 體 培 養(yǎng) 的 真 菌 用 三 層 紗 布 過 濾 后 1 000 r m i n 離 心 10 m i n 棄 掉 上 清 液 保 留 沉 淀 在 烘 箱 中 35 下 烘 12 h 即 可 得 到 干 燥 的 菌 絲 使 用 真 菌 基 因 組 D N A 提 取 試 劑 盒 S o l a r b i o 提 取 真 菌 樣 品 D N A 1 2 3 D N A 濃 度 的 檢 測 取 5 L D N A 樣 品 采 用 1 的 瓊 脂 糖 凝 膠 電 泳 進(jìn) 行 檢 測 12 0 V 1 1 0 A 30 m i n 于 B i o R A D 自 動 凝 膠 成 像 系 統(tǒng) 觀 察 條 帶 亮 度 并 使 用 紫 外 分 光 光 度 計 檢 測 樣 品 D N A 濃 度 1 2 4 分 子 檢 測 用 四 種 引 物 1 3 表 1 分 別 進(jìn) 行 P C R 擴(kuò) 增 P C R 反 應(yīng) 體 系 模 板 D N A 20 8 0 ng L 2 0 L 2 P C R M i x 含 M g 2 dN T P s T a q D N A P o l y m e r a s e 等 1 0 0 L 引 物 1 0 m o l L 各 1 0 L 滅 菌 超 純 水 6 0 L P C R 反 應(yīng) 程 序 9 4 5 m i n 94 30 s 5 6 U n i 58 s p 13 s p 23 s pr l 30 s 72 30 s 35 個 循 環(huán) 72 1 0 m i n P C R 反 應(yīng) 結(jié) 束 后 取 7 L 擴(kuò) 增 產(chǎn) 物 用 1 5 瓊 脂 糖 凝 膠 電 泳 進(jìn) 行 檢 測 采 用 B i o R A D 自 動 凝 膠 成 像 系 統(tǒng) 觀 察 并 拍 照 記 錄 擴(kuò) 增 結(jié) 果 表 1 所 用 引 物 信 息 引 物 名 稱 序 列 5 3 位 置 u n i f A T C A T C T T G T G C C A A C T T C A G n t 1 7 0 1 9 0 o f S a i t a m a l y 1 p g 1 u n i r G T T T G T G A T C T T T G A G T T G C C A n t 8 4 1 8 2 0 o f S a i t a m a l y 1 p g 1 s p 1 3 f G T C A G T C C A T T G G C T C T C T C n t 8 9 6 9 1 5 o f S a i t a m a r l y p g x 4 s p 1 3 r T C C T T G A C A C C A T C A C A G A G n t 1 3 4 0 1 3 2 1 o f S a i t a m a r l y p g x 4 s p 2 3 f C C T C T T G T C T T T G T C T C A C G A n t 2 4 0 2 6 0 o f S a i t a m a l y 1 p g 1 s p 2 3 r G C A A C A G G T C G T G G G G A A A A n t 7 5 7 7 3 8 o f S a i t a m a l y 1 p g 1 s p r l f G A T G G T G G A A C G G T A T G A C C n t 3 8 5 4 0 4 o f S a i t a m a r l y p g x 4 s p r l r C C A T C A C A C A A G A A C A C A G G A n t 1 3 3 0 1 3 1 0 o f S a i t a m a r l y p g x 4 2 結(jié) 果 與 分 析 2 1 真 菌 的 菌 落 形 態(tài) 病 原 菌 在 P D A 培 養(yǎng) 基 上 2 5 培 養(yǎng) 5 d 后 臨 淄 壽 光 膠 州 即 墨 海 陽 萊 陽 地 區(qū) 的 病 原 菌 形 態(tài) 基 本 一 致 菌 落 顏 色 呈 淡 白 灰 色 圓 形 菌 絲 為 絨 毛 狀 直 徑 大 致 60 m m 單 縣 分 離 的 菌 株 與 其 它 幾 個 地 區(qū) 存 在 明 顯 區(qū) 別 菌 落 顏 色 呈 淡 粉 白 色 圓 形 菌 絲 絨 毛 狀 長 且 密 集 菌 絲 量 大 圖 1 A G 分 別 為 單 縣 臨 淄 壽 光 膠 州 即 墨 海 陽 萊 陽 地 區(qū) 菌 株 圖 1 山 東 省 不 同 地 區(qū) 病 原 菌 的 菌 落 形 態(tài) 特 征 2 2 D N A 的 質(zhì) 量 與 濃 度 檢 測 經(jīng) 紫 外 分 光 光 度 計 檢 測 樣 品 D N A 的 O D 2 6 0 O D 2 8 0 值 在 1 8 2 0 范 圍 內(nèi) 說 明 真 菌 D N A 樣 品 質(zhì) 量 良 好 用 1 的 瓊 脂 糖 凝 膠 電 泳 檢 測 電 泳 條 帶 明 亮 且 整 齊 無 拖 帶 圖 2 均 可 用 于 P C R 擴(kuò) 增 2 3 分 子 標(biāo) 記 檢 測 引 物 u ni f r 和 s p 13 f r 在 所 有 菌 株 D N A 中 均 可 分 別 擴(kuò) 增 出 67 0 b p 和 445 bp 的 特 異 片 段 引 物 M D L 2 0 0 0 M a r k e r 1 7 分 別 為 單 縣 臨 淄 壽 光 膠 州 即 墨 海 陽 萊 陽 菌 株 下 同 圖 2 供 試 樣 品 真 菌 D N A 電 泳 圖 譜 9 7 第 12 期 張 秀 等 山 東 省 番 茄 尖 孢 鐮 刀 菌 的 分 離 及 鑒 定 s pr l f r 在 所 有 樣 品 中 均 未 擴(kuò) 增 出 94 7 b p 的 特 異 片 段 引 物 s p 2 3 f r 在 除 單 縣 外 的 其 它 地 區(qū) 菌 株 D N A 中 均 擴(kuò) 增 出 51 8 b p 的 特 征 片 段 圖 3 初 步 確 定 單 縣 枯 萎 病 病 原 菌 為 枯 萎 病 菌 生 理 小 種 1 F u s ar i um o x y s p o r um f s p l y c o p e r s i c i r a c e 1 F o l 1 其 它 地 區(qū) 病 原 菌 為 枯 萎 病 菌 生 理 小 種 3 F u s ar i um o x y s p o r um f s p l y c o p e r s i c i r a c e 3 F o l 3 A D 分 別 為 引 物 u n i f r s p 1 3 f r s p 2 3 f r s p r l f r 的 擴(kuò) 增 結(jié) 果 圖 3 4 對 引 物 的 P C R 擴(kuò) 增 結(jié) 果 3 討 論 與 結(jié) 論 本 研 究 發(fā) 現(xiàn) 臨 淄 壽 光 膠 州 即 墨 海 陽 萊 陽 地 區(qū) 的 病 原 菌 菌 落 特 征 基 本 一 致 單 縣 菌 株 的 菌 落 特 征 與 其 它 地 區(qū) 有 明 顯 區(qū) 別 進(jìn) 一 步 利 用 分 子 檢 測 技 術(shù) 進(jìn) 行 鑒 定 發(fā) 現(xiàn) 臨 淄 壽 光 膠 州 即 墨 海 陽 萊 陽 6 個 地 區(qū) 的 病 原 菌 為 枯 萎 病 菌 生 理 小 種 3 單 縣 地 區(qū) 的 病 原 菌 為 枯 萎 病 菌 生 理 小 種 1 番 茄 頸 腐 根 腐 病 害 已 給 美 國 日 本 加 拿 大 墨 西 哥 以 色 列 韓 國 以 及 歐 洲 等 許 多 國 家 和 地 區(qū) 的 番 茄 生 產(chǎn) 造 成 重 大 損 失 1 山 東 省 于 2 01 0 年 在 壽 光 發(fā) 現(xiàn) 該 病 害 后 該 病 害 逐 漸 蔓 延 至 全 省 各 地 當(dāng) 前 此 病 害 已 經(jīng) 嚴(yán) 重 威 脅 到 山 東 省 溫 室 大 棚 冬 春 季 番 茄 生 產(chǎn) 1 4 本 研 究 對 從 山 東 省 主 要 番 茄 產(chǎn) 區(qū) 采 集 的 番 茄 頸 腐 根 腐 病 病 樣 進(jìn) 行 病 原 菌 分 離 純 化 及 鑒 定 基 本 確 定 引 起 山 東 省 番 茄 頸 腐 根 腐 病 主 要 病 原 物 為 番 茄 枯 萎 病 生 理 小 種 3 H i r a n o 等 1 3 將 日 本 地 區(qū) 番 茄 頸 腐 根 腐 病 病 原 菌 鑒 定 為 F u s ar i u m o x y s p o r u m f s p r adi c i s l y c o p e r s i c i F O R L 可 見 山 東 省 番 茄 頸 腐 根 腐 病 病 原 菌 與 日 本 地 區(qū) 不 同 參 考 文 獻(xiàn) 1 J a c o b s A H e e r d e n S W F i r s t r e p o r t o f F u s a r i u m o x y s p o r u m f s p r a d i c i s l y c o p e r s i c i i n S o u t h A f r i c a J A u s t r a l a s i a n P l a n t D i s N o t e s 2 0 1 2 7 2 9 3 2 2 耿 麗 華 李 常 保 遲 勝 起 等 番 茄 頸 腐 根 腐 病 病 原 鑒 定 及 不 同 條 件 對 其 生 長 的 影 響 J 植 物 病 理 學(xué) 報 2 0 1 2 4 2 5 4 4 9 4 5 5 3 N o g u e z M A T o k e s h i H R e v i e w o f c l a s s i f i c a t i o n o f r a c e 3 o f F u s a r i u m o x y s p o r u m f s p l y c o p e r s i c i J A n a i s D a E s c o l a S u p e r i o r D e A g r i c u l t u r a L u i z D e Q u e i r o z 1 9 7 3 3 1 4 1 9 4 3 0 4 S c h m i d t S M H o u t e r m a n P M S c h r e i v e r I e t a l M I T E s i n t h e p r o m o t e r s o f e f f e c t o r g e n e s a l l o w p r e d i c t i o n o f n o v e l v i r u l e n c e g e n e s i n F u s a r i u m o x y s p o r u m J B M C G e n o m i c s 2 0 1 3 1 4 1 1 1 9 1 3 9 5 C i r u l l i M A l e x a n d e r L G A c o m p a r i s o n o f p a t h o g e n i c i s o l a t e s o f F u s a r i u m o x y s p o r u m f s p l y c o p e r s i c i a n d d i f f e r e n t s o u r c e s o f r e s i s t a n c e i n t o m a t o J P h y t o p a t h o l o g y 1 9 9 6 5 6 1 3 0 1 1 3 0 4 6 G r a t t i d g e R O B r i e n R G O c c u r r e n c e o f a t h i r d r a c e o f F u s a r i u m w i l t o f t o m a t o e s i n Q u e e n s l a n d J P l a n t D i s e a s e 1 9 8 2 6 6 2 1 6 5 1 6 6 7 S h i o m i H K o m a d a H H i g h l y v i r u l e n t i s o l a t e s o f F u s a r i u m o x y s p o r u m f s p l y c o p e r s i c i r a c e 2 J A n n a l s o f t h e P h y t o p a t h o l o g i c a l S o c i e t y o f J a p a n 2 0 0 6 7 2 2 2 1 2 2 2 0 8 山 東 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 第 51 卷 8 L a u r e n c e M H W a l s h J L S h u t t l e w o r t h L A e t a l S i x n o v e l s p e c i e s o f F u s a r i u m f r o m n a t u r a l e c o s y s t e m s i n A u s t r a l i a J F u n g a l D i v e r s i t y 2 0 1 5 7 7 1 1 1 8 9 G h i a s i a n S A R e z a y a t S M K o r d B a c h e h P e t a l F u m o n i s i n p r o d u c t i o n b y F u s a r i u m s p e c i e s i s o l a t e d f r o m f r e s h l y h a r v e s t e d c o r n i n I r a n J M y c o p a t h o l o g i a 2 0 0 5 1 5 9 1 3 1 4 0 1 0 T r o i s i M B e r t e t t i D G u l l i n o M L e t a l R a c e d i f f e r e n t i a t i o n i n F u s a r i u m o x y s p o r u m f s p c h r y s a n t h e m i J J o u r n a l o f P h y t o p a t h o l o g y 2 0 1 3 1 6 1 1 0 6 7 5 6 8 8 1 1 W o o S L Z o i n a A D e l S o r b o G e t a l C h a r a c t e r i z a t i o n o f F u s a r i u m o x y s p o r u m f s p p h a s e o l i b y p a t h o g e n i c r a c e s V C G s R F L P s a n d R A P D J P h y t o p a t h o l o g y 1 9 9 6 8 6 9 9 6 6 9 7 3 1 2 孫 飛 龍 北 五 味 子 3 種 病 害 的 病 原 菌 鑒 定 及 有 效 藥 劑 篩 選 D 長 春 吉 林 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 2 0 1 6 1 3 H i r a n o Y A r i e T P C R b a s e d d i f f e r e n t i a t i o n o f F u s a r i u m o x y s p o r u m f s p l y c o p e r s i c i a n d r a d i c i s l y c o p e r s i c i a n d r a c e s o f F o x y s p o r u m f s p l y c o p e r s i c i J J o u r n a l o f G e n e r a l P l a n t P a t h o l o g y 2 0 0 6 7 2 5 2 7 3 2 8 3 1 4 程 琳 張 生 李 艷 青 等 番 茄 頸 腐 根 腐 病 病 原 菌 鑒 定 與 抗 病 種 質(zhì) 材 料 的 篩 選 J 園 藝 學(xué) 報 2 0 1 6 4 3 4 7 8 1 7 8 8 1 8 第 12 期 張 秀 等 山 東 省 番 茄 尖 孢 鐮 刀 菌 的 分 離 及 鑒 定