山東農業(yè)科學 2020 52 5 100 104 Shandong Agricultural Sciences DOI 10 14083 j issn 1001 4942 2020 05 019 收稿日期 2019 12 30 基金項目 山東省農業(yè)良種工程項目 2017LZGC013 山東省農業(yè)科學院農業(yè)科技創(chuàng)新工程項目 CXGC2018E08 國家現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技 術體系建設專項資金項目 CARS 23 G14 作者簡介 蘇曉梅 1988 女 博士 助理研究員 主要從事番茄遺傳育種研究 E mail sxm198846 126 com 通訊作者 侯麗霞 1970 女 博士 研究員 主要從事番茄遺傳育種研究 E mail houlx2006 126 com 山東省番茄潰瘍病病原菌的分離與鑒定 蘇曉梅1 劉淑梅1 李嘉琦2 王施慧1 侯麗霞1 1 山東省農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所 山東省設施蔬菜生物學重點實驗室 國家蔬菜改良中心山東分中心 農業(yè)部黃淮地區(qū)蔬菜科學觀測實驗站 山東 山東濟南 250100 2 吉林農業(yè)大學園藝學院 吉林長春 130118 摘要 本試驗對山東省內不同地區(qū)番茄潰瘍病發(fā)病情況進行調查 采集具有典型癥狀的病樣 采用組織分 離方法分離純化病原菌 并對其進行形態(tài)學觀察 分子生物學鑒定和致病性測定 結果表明 不同地區(qū)番茄病 樣分離得到的4個菌株均屬于潰瘍病菌Cmm 但致病力存在差異 本研究可為番茄潰瘍病的準確鑒定和病 害防治提供參考 關鍵詞 番茄潰瘍病 Cmm 病原菌 分離鑒定 中圖分類號 S436 412 1 文獻標識號 A 文章編號 1001 4942 2020 05 0100 05 Isolation and Identification of Pathogen Causing Bacterial Canker of Tomato in Shandong Province Su Xiaomei1 Liu Shumei1 Li Jiaqi2 Wang Shihui1 Hou Lixia1 1 Institute of Vegetables and Flowers Shandong Academy of Agricultural Sciences Shandong Provincial Key Laboratory for Biology of Greenhouse Vegetables Shandong Branch of National Improvement Center for Vegetables Huang Huai Hai Region Scientific Observation and Experimental Station of Vegetables Ministry of Agriculture and Rural Affairs Shandong Jinan 250100 China 2 College of Horticulture Jilin Agricultural University Changchun 130118 China Abstract In this experiment the incidence of tomato bacterial canker disease was investigated in differ ent areas of Shandong Province The diseased samples with classical symptom were collected and then the pathogen was isolated by tissue isolation method and the morphological characteristics molecular identifica tion and pathogenicity test were conducted The results showed that four strains were obtained from the investi gated areas in Shandong Province All they belonged to Cmm with different pathogenicity This research could provide references for the identification and control of tomato bacterial canker Keywords Bacterial canker of tomato Cmm Pathogen Isolation and identification 番茄潰瘍病 bacterial canker of tomato 是一 種由細菌侵染而引起的維管束病害 病原菌為密 執(zhí)安棒形桿菌密執(zhí)安亞種 Clavibacter michiganen sis subsp michiganensis Cmm 可侵染辣椒 龍葵 裂葉茄及其它番茄屬植物 番茄潰瘍病的主要癥 狀包括葉片邊緣壞死 葉片萎蔫至枯死 莖和葉柄 出現(xiàn)褐色條斑 病斑下陷 開裂而露出髓腔 呈潰 瘍狀以及維管束變褐等 果實出現(xiàn)圓形病斑 中央 淺褐色 邊緣為白色暈圈 形似鳥眼狀 可聯(lián)合成 不規(guī)則斑塊 1 該病害在番茄生育期內均可發(fā) 生 特別是溫暖潮濕條件更易造成該病的大規(guī)模 暴發(fā)與流行 我國于1985年首次在北京市平谷 發(fā)現(xiàn)番茄潰瘍病 2 1993年東北地區(qū)也報道了 該病發(fā)生 3 2002年 安徽省國寧市方塘鄉(xiāng)番茄 潰瘍病發(fā)病率超過80 2007 2009年 該病給 貴州省修文縣造成的產量損失達40 50 4 近年來 隨著氣候的異常變化及番茄種植規(guī)模擴 大 番茄潰瘍病在黑龍江 吉林 遼寧 內蒙古 新 疆 河北 河南 山東 上海 海南 重慶 湖北 貴州 等省區(qū)均有不同程度發(fā)生 且逐年加重 這對番茄 生產造成一定影響 1 5 8 本研究對山東省不同地區(qū)番茄潰瘍病田間發(fā) 病情況進行調查 采集病樣進行病原菌分離與純 化 并對分離得到的病原菌進行形態(tài)學觀察 分子 生物學鑒定以及致病性測定 以明確不同地區(qū)番 茄潰瘍病菌的致病力差異 為番茄潰瘍病的鑒定 防治及探索該病病原菌的多態(tài)性提供參考 1 材料與方法 1 1 試驗材料 供試培養(yǎng)基 523液體培養(yǎng)基 每升含10 g 蔗糖 8 g水解酪素 4 g酵母浸膏 2 g K2HPO4 0 3 g MgSO4 7H2O 523固體培養(yǎng)基 在上述 523液體培養(yǎng)基基礎上添加15 g瓊脂 培養(yǎng)基用 前高壓滅菌 且pH值調整為6 9 7 1 病原菌致病性測定試驗所用番茄品種Heinz 1706 種植于32孔穴盤 待長至三葉一心時進行 處理 1 2 田間調查及病樣采集 于2018 2019年調查山東省泰安市岱岳區(qū) 濟南市濟陽區(qū) 蒙陰縣 壽光市等地番茄潰瘍病發(fā) 病情況 選擇典型病株 觀察 記錄病害癥狀 并將 病樣帶回實驗室進行病原菌分離 1 3 病原菌分離培養(yǎng)及形態(tài)觀察 采用常規(guī)組織分離法對病原菌進行分離 具 體步驟 使用滅菌解剖刀切取病健交界處1 2 cm莖段 先用無菌水沖洗干凈 再經1 NaClO 溶液消毒5 min 后用無菌水清洗3次 將消毒后 莖段置于滅菌培養(yǎng)皿中 加1 2滴無菌水 擠壓 使組織液滲出 用滅菌接種環(huán)蘸取組織液在523 固體培養(yǎng)基平板上劃線 先在平板的一側順序劃 3 5條線 再將培養(yǎng)皿轉60 從第二條線末端順 序劃3 5條線 9 后置于28 恒溫箱中培養(yǎng) 2 3 d后 挑取疑似潰瘍病菌落進行純化培養(yǎng) 觀 察 記錄菌落形狀 大小 顏色等形態(tài)特征 1 4 病原菌分子生物學鑒定 挑取純化后菌落至523液體培養(yǎng)基中 28 200 r min振蕩培養(yǎng)12 h后 6 000 r min離心2 min 棄上清 菌體用無菌水洗滌2次后 重懸于無 菌水中備用 以上述重懸菌體為模板 采用表1中引物進 行PCR擴增 反應體系 10 L 菌懸液2 L 上 下游引物各0 25 L 2 Taq Mix 5 L ddH2O 2 5 L 反應程序 94 預變性5 min 94 變性 30 s 55 退火30 s 72 延伸1 min 32個循環(huán) 72 延伸5 min 16 保存 擴增產物經1 5 瓊 脂糖凝膠電泳檢測后送至北京六合華大基因科技 有限公司測序 利用NCBI數(shù)據(jù)庫的Blast程序 對測序結果進行比較 表1 試驗所用引物 引物編號引物名稱引物序列 5 3 產物長度 bp 參考文獻 1 Cmm5 GCGAATAAGCCCATATCAA 614 Dreier等 10 Cmm6 CGTCAGGAGGTCGCTAATA 2 ClaF1 TCATTGGTCAATTCTGTCTCCC 271 Pastrik等 11 ClaR2 TACTGAGATGTTTCACTTCCCC 3 BT1 CGTCAGGCGTCTGTTCT 268趙文軍等 12 BT2 GATGCTCGCGTCCACT 4 ITS1 GCATGTGCACCTCTCCTCTGTAT 420李江利等 5 ITS2 TCACATGAGATTGAATCGTTTCGCCT 5 27F AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 1300張慶萍等 13 1492R GGTTACCTTGTTACGACT 1 5 病原菌致病性測定 將純化后各病原菌分別轉至523液體培養(yǎng)基 中 28 200 r min振蕩培養(yǎng)12 h后 將各菌懸 液濃度調至108 109 cfu mL 采用打頂法接種 將手術剪前端1 cm處蘸取菌懸液 在幼苗新葉處 將主莖剪斷 14 以蘸取無菌水為對照 每份菌懸 液接種8株 重復3次 接種后 先將植株置于 28 環(huán)境中 RH為90 100 保濕48 h 再進 行正常管理 白天25 28 夜晚20 22 平均 濕度80 90 20 d后觀察病情發(fā)展情況 2 結果與分析 2 1 山東省不同地區(qū)番茄潰瘍病的田間發(fā)病情況 經調查發(fā)現(xiàn) 不同地區(qū)番茄病株表現(xiàn)癥狀一 致 均為下部葉片先出現(xiàn)染病癥狀 后逐漸向頂端 蔓延 該病進一步擴展時 葉柄 側枝或主莖出現(xiàn) 灰褐色條斑 后期莖部略變粗 表面產生許多不定 101 第5期 蘇曉梅 等 山東省番茄潰瘍病病原菌的分離與鑒定 根或刺狀突起 開裂 髓部中空變褐 全株枯死 果 實出現(xiàn)典型的 鳥眼斑 癥狀 即病斑中央產生黑 色小斑點并伴有白色暈圈 多個病斑融合使果實 表面粗糙 圖1 圖1 山東省不同地區(qū)番茄潰瘍病田間發(fā)病情況 2 2 病原菌分離與形態(tài)學鑒定 本試驗從不同地區(qū)番茄病樣中分離得到4株 菌株 培養(yǎng)3 d后 各菌株形態(tài)基本相同 菌落呈 凸圓形 黃色 表面平滑 邊緣無鋸齒 粘稠狀 直 徑為1 3 mm 圖2 根據(jù)形態(tài)學特征 初步鑒 定4個菌株均為番茄潰瘍病菌Cmm a 濟陽分離菌株b 蒙陰分離菌株c 岱岳分離菌株d 壽光分離菌株 下同 圖2 不同地區(qū)分離病原菌株形態(tài) 2 3 病原菌分子生物學鑒定 由圖3可以看出 不同引物均能擴增出特異 條帶 大小與預期一致 而對照無條帶 將引物 27F 1492R擴增得到的產物進行測序 經Blast比 對 發(fā)現(xiàn)其與HQ144241 1 已知Cmm序列的 GeneBank登錄號 同源性達99 以上 圖4 因 此 分離獲得的病原菌為番茄潰瘍病菌Cmm M Takara DL1000 DNA Marker CK 無菌水 1 5 對應表1不同Cmm引物擴增結果 圖3 不同引物對4個菌株的PCR擴增產物 201山東農業(yè)科學 第52卷 圖4 引物27F 1492R擴增產物的部分比對結果 2 4 病原菌致病性鑒定 由圖5可以看出 接種濟陽 蒙陰 壽光分離 菌株的番茄幼苗明顯出現(xiàn)萎蔫 死亡癥狀 其中 接種濟陽分離菌株的幼苗癥狀最重 所有植株均 死亡 接種蒙陰分離菌株的幼苗癥狀次之 接種壽 光分離菌株的8株幼苗中有3株萎蔫死亡 5株 萎蔫 而接種岱岳分離菌株的幼苗無明顯發(fā)病癥 狀 僅在接種傷口處出現(xiàn)萎蔫 個別葉片發(fā)生萎 圖5 接種不同地區(qū)分離菌株的番茄幼苗發(fā)病情況 蔫 因此 不同地區(qū)的番茄潰瘍病菌株致病力強 弱存在差異 3 討論與結論 本試驗采集山東省內主要番茄產區(qū)的番茄潰 瘍病樣 并從中分離獲得純化菌株 根據(jù)形態(tài)學 觀察和分子生物學鑒定結果 證實所得菌株均為 Cmm 這與其它地區(qū)所報道 5 7 的番茄潰瘍病菌 一致 然而 本研究樣本僅采自山東省 存在一定 局限性 但引起番茄潰瘍病的病原菌并沒有生理 小種分化 只是致病力有所差異 這與前人的研 究 15 17 基本一致 因此 下一步應擴大采集和鑒 定國內番茄產區(qū)的潰瘍病菌 對其遺傳多樣性及 致病性差異進行分析 另外 番茄潰瘍病菌Cmm 的測序工作已經完成 18 可充分利用基因組數(shù)據(jù) 信息 在病原菌的致病機制和寄主的抗病機理及 闡明二者互作機制方面開展研究 從而更好地為 該病害防治提供參考 301 第5期 蘇曉梅 等 山東省番茄潰瘍病病原菌的分離與鑒定 近年來番茄潰瘍病已成為我國番茄生產的重 大威脅 許多國家已將其列為檢疫性病害 目前 該病害主要以預防為主 生產中尚無有效防治藥 劑 而培育抗病品種是有效的防治手段 本研究 對番茄潰瘍病菌進行分離鑒定以及致病力測定 這是進行番茄潰瘍病抗性鑒定的前提 下一步還 需建立完善的苗期接種鑒定體系以及篩選鑒定番 茄種質資源 更好地為番茄潰瘍病的抗病育種及 利用研究奠定基礎 參 考 文 獻 1 李煥玲 石延霞 謝學文 等 李寶聚博士診病手記 四十 二 番茄潰瘍病的發(fā)生規(guī)律與防治技術 J 中國蔬菜 2011 23 24 27 2 劉泮華 張樂 李明遠 北京市發(fā)生番茄潰瘍病 簡報 J 植物保護 1986 12 1 32 33 3 趙廷昌 王克 白金鏜 等 東北地區(qū)番茄細菌性潰瘍病的 發(fā)生和病原鑒定研究 J 植物病理學報 1993 23 1 29 34 4 石延霞 張珊珊 黃大野 等 李寶聚博士診病手記 二十 三 貴州省修文縣番茄 火燒疫 病原鑒定 J 中國蔬 菜 2010 7 18 19 5 李江利 歐陽林杰 郭淼淼 等 河南省番茄潰瘍病的發(fā)現(xiàn) 與分子確診 J 河南農業(yè)大學學報 2011 45 3 349 352 6 祁占東 承德地區(qū)番茄潰瘍病發(fā)生特點與綜合防治技術 J 中國蔬菜 2014 1 71 72 7 陳磊 羅金燕 趙玉強 等 上海市番茄潰瘍病的確診及其 防控對策 J 浙江農業(yè)科學 2016 57 12 2054 2057 8 康華軍 溫智浩 袁軍海 等 新疆加工番茄細菌性斑點病 與潰瘍病復合侵染鑒定及防治建議 J 中國蔬菜 2018 6 83 86 9 曹春梅 徐利敏 胡俊 25個番茄品種抗細菌性潰瘍病室 內測定 J 內蒙古農業(yè)科技 2008 2 30 32 10 Dreier J Bielefeld U Biologie F Southern hybridization and PCR for specific detection of phytopathogenic Clavibacter michi ganensis subsp michiganensis J Phytopathology 1995 85 462 468 11 Pastrik K H Rainey F A Identification and differentiation of Clavibacter michiganensis subspecies by polymerase chain reac tion based techniques J Journal of Phytopathology 1999 147 11 12 687 693 12 趙文軍 夏明星 陳紅運 等 番茄潰瘍病菌PCR快速檢 測技術 J 植物檢疫 2007 21 2 75 77 13 張慶萍 王燕春 趙偉強 等 番茄潰瘍病病原菌遺傳多樣 性分析 J 北方農業(yè)學報 2017 45 6 20 23 14 羅來鑫 李健強 Bolkan H 番茄細菌性潰瘍病苗期接種新 方法的研究 J 植物病理學報 2005 35 2 123 128 15 王蕊 羅來鑫 李健強 不同來源番茄潰瘍病菌致病力差異 研究 J 植物保護 2010 36 1 73 76 16 Milija evic Marc ic S Gartemann K H Frohwitter J et al Characterization of Clavibacter michiganensis subsp michi ganensis strains from recent outbreaks of bacterial wilt and can ker in Serbia J European Journal of Plant Pathology 2012 134 697 711 17 張慶萍 王燕春 徐佳 等 番茄潰瘍病病原菌致病性的鑒 定 J 北方農業(yè)學報 2016 44 6 26 30 18 Gartemann K H Abt B Bekel T et al The genome sequence of the tomato pathogenic actinomycete Clavibacter michi ganensis subsp michiganensis NCPPB382 reveals a large island involved in pathogenicity J Journal of Bacteriology 2008 190 6 2138 2149 401山東農業(yè)科學 第52卷