36 3 388 395 中國生物防治學(xué)報 Chinese Journal of Biological Control 2020 年 6 月 收稿日期 2019 11 25 基金項目 國家大宗蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系 CARS 25 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系北京市葉類蔬菜創(chuàng)新團隊建設(shè)專項資金資助 BAIC07 2018 中國 農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程 CAAS ASTIP IVFCAAS 農(nóng)業(yè)部園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室項目 作者簡介 共同第一作者 李磊 博士 助理研究員 E mail lilei01 趙昱榕 碩士研究生 E mail Z15046656769 通信 作者 李寶聚 博士 研究員 E mail libaoju 謝學(xué)文 博士 副研究員 E mail xiexuewen DOI 10 16409 ki 2095 039x 2020 03 015 芹菜軟腐病拮抗芽胞桿菌篩選及防治效果 李 磊 趙昱榕 鄭 斐 石延霞 柴阿麗 謝學(xué)文 李寶聚 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所 北京 100081 摘要 本研究從芹菜根際土壤分離篩選得到一株對芹菜軟腐病具有良好防治效果的菌株 ZF75 通過菌落 形態(tài)觀察 生理生化特性及 16S rDNA 序列分析 初步將該菌株鑒定為解淀粉芽胞桿菌 Bacillus amyloliquefaciens 平板對峙結(jié)果表明 菌株 ZF75 對番茄瘡痂病菌等 10 種病原菌具有較強的拮抗效果 用 溫室栽培試驗對菌株 ZF75 進行防病效果初探 試驗結(jié)果表明 菌株 ZF75 對芹菜軟腐病防效可達 89 62 同時 該菌株對芹菜具有顯著的促生效果 經(jīng)菌株 ZF75 菌懸液處理后的芹菜平均株高和莖粗分別達 24 18 cm 和 0 51 cm 綜合分析表明 菌株 ZF75 具有良好的田間應(yīng)用開發(fā)潛力 關(guān) 鍵 詞 芹菜 軟腐病 解淀粉芽胞桿菌 生物防治 中圖分類號 S476 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 1005 9261 2020 03 0388 08 Screening and Biocontrol of Antagonistic Bacillus against Celery Soft Rot LI Lei ZHAO Yurong ZHENG Fei SHI Yanxia CHAI Ali XIE Xuewen LI Baoju Institute of Vegetables and Flowers Chinese Academy of Agricultural Sciences Beijing 100081 China Abstract A biocontrol bacterium ZF75 isolated from the rhizosphere soil of celery had significant inhibitory effecton Pectobacterium carotovorum subsp odoriferum Based on biological characteristics physiological and biochemical characteristics and multilocus sequence analysis the strain ZF75 was identified as Bacillus amyloliquefaciens Plate confrontation assay demonstrated that strain ZF75 has strong inhibitory effects against ten pathogens such as Xanthomonas campestris pv vesicatoria Potted plant test in greenhouse indicated that strain ZF75 significantly reduced disease incidence of celery bacterial soft rot with the control efficacy of 89 62 Meanwhile strain ZF75 could significantly promote the plant growth drenching treatment with strain ZF75 increased plant height and stem diameter by 24 18 cm and 0 51 cm respectively In summary the strain ZF75 is a potential biocontrol agent to be applied in the field Key words celery soft rot disease Bacillus amyloliquefaciens biological control 芹菜軟腐病是由胡蘿卜軟腐果膠桿菌 Pectobacterium carotovorum 引起的一種世界性流行病害 1 是芹 菜生產(chǎn)的重要病害之一 嚴(yán)重影響芹菜的產(chǎn)量 2 前期出現(xiàn)水浸透明狀軟腐 后期發(fā)黃并逐漸變?yōu)樯詈稚?伴有腥臭味 嚴(yán)重時導(dǎo)致整個植株癱軟和腐爛 3 給種植戶帶來巨大的經(jīng)濟損失 4 果膠桿菌可大量產(chǎn)生胞壁降解酶 包括果膠酶 纖維素酶 多聚半乳糖醛酸酶 快速作用于植物組織 使植物腐爛死亡 因此軟腐病害一直以來被認(rèn)為是難于防控的細(xì)菌性植物病害 5 對于芹菜軟腐病的防治 多年來國內(nèi)外一直高度重視 目前 采用的化學(xué)農(nóng)藥防治存在環(huán)境壓力 致使病原產(chǎn)生抗藥性等問題 抗 病育種的難度較大 農(nóng)業(yè)措施也有較大的局限性 因此 生物防治逐漸成為人們關(guān)注的熱點 產(chǎn)酸克雷伯 第 3 期 李磊等 芹菜軟腐病拮抗芽胞桿菌篩選及防治效果 389 菌 Klebsiella oxytoca C1036 可誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性抵抗軟腐病菌 并發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)生的相關(guān)代謝產(chǎn)物可能在促進 植物生長方面發(fā)揮作用 6 Krzyzanowska 等 7 從 1165 株菌株中篩選出 18 株軟腐病菌拮抗菌株 但它們在 不同植物上表現(xiàn)出的防效卻差距很大 這表明生防菌株的防效可能與寄主有非常大的關(guān)系 目前 有關(guān)芹 菜軟腐病拮抗菌株的報道還很少 因此篩選針對芹菜上的軟腐病生物防治菌株尤為必要 近幾年芽胞桿菌 Bacillus 得到了廣泛的應(yīng)用 大量實踐證明芽胞桿菌易于從土壤和植物組織內(nèi)分離 并且能產(chǎn)生耐熱 抗 紫外線的芽胞 在植株上定殖和繁殖迅速 8 11 目前研究的芽胞桿菌中具有抑菌活性的主要有 枯草芽胞 桿菌 B subtilis 解淀粉芽胞桿菌 B amyloliquefaciens 萎縮芽胞桿菌 B atropheaus 短短芽胞桿菌 Brevibacillus brevs 等 12 14 本研究從芹菜根際土壤中分離得到了一株對植物具有良好促生防病效果的菌株 ZF75 根據(jù)生物學(xué)特 征 16S rDNA 序列特征 生理生化指標(biāo)以及 Biolog 結(jié)果對該生防菌進行了初步鑒定 確定其分類地位 并對其抑菌效果進行初步研究 以期為芹菜軟腐病的生物防治及生物藥劑開發(fā)提供依據(jù) 1 材料與方法 1 1 供試菌株 培養(yǎng)基和供試品種 芹菜軟腐病菌 P carotovorum subsp odoriferum 編號 QC14052001 經(jīng)鑒定該病原菌具有較強致病 力 由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所分離并保存 供試芹菜品種為文圖拉拮抗菌株的分離和培養(yǎng)采用 LB 培養(yǎng)基 胰蛋白胨 10 g 酵母粉 5 g NaCl 10 g 瓊脂粉 15 g 加水至 1000 mL 病原細(xì)菌的培養(yǎng)使用 NA 培養(yǎng)基 蛋白胨 10 g 牛肉粉 3 g NaCl 5 g 瓊脂粉 15 g pH 7 0 加水至 1000 mL 病原真菌的 培養(yǎng)及拮抗試驗采用 PDA 培養(yǎng)基 馬鈴薯 200 g 葡萄糖 20 g 瓊脂粉 15 g 加水至 1000 mL IAA 的 測定使用 DF 培養(yǎng)基 蛋白胨 5 g 酵母提取物 15 g 牛肉膏 15 g NaCl 5 g pH 7 0 加水至 1000 mL 和 DF 培養(yǎng)基 DF 培養(yǎng)基加 0 5 g L 的色氨酸 1 2 拮抗細(xì)菌的分離 從山東壽光 河北青縣 北京順義芹菜種植地采集健康芹菜的根際土樣 20 份 使用無菌樣品袋帶回實 驗室及時保存處理 稱取 10 g 土壤樣品 放入盛有 90 mL 無菌水的錐形瓶中 將錐形瓶置于 28 180 r min 搖床上振蕩 30 min 使之充分懸浮 80 水浴處理 10 min 后梯度稀釋至 10 3 10 4 10 5 10 6 吸取 100 L 涂布于 LB 平板上 每個梯度重復(fù) 3 次 28 恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 2 d 挑取形態(tài)不同的細(xì)菌菌落經(jīng)平板劃 線純化后編號保存 1 3 拮抗細(xì)菌的篩選 1 3 1 芹菜莖段法測定防效 將芹菜軟腐病菌接種于 NB 培養(yǎng)基中 各拮抗菌株接種于 LB 液體培養(yǎng)基中 28 搖培 24 h 后 調(diào)節(jié)濃度至 10 8 cfu mL 選取成熟期一致 生長健康 無任何病蟲害的芹菜次外層莖 稈組織作為試驗材料 將莖稈兩端各 20 的組織切除 中間部分切成 5 cm 長的莖段 每處理 7 個莖段 用皮筋捆成一組 采用莖段浸菌法接種細(xì)菌性軟腐病菌 將處理好的芹菜莖段豎直碼放在盛有 10 8 cfu mL 芽胞桿菌菌懸液的保鮮盒內(nèi) 以 0 5 1 cm 的莖稈浸泡在菌懸液里為宜 浸菌 1 h 后取出莖段 水平均勻 碼放在濾紙上 室內(nèi)自然風(fēng)干 1 h 而后以相同方式在病原菌菌懸液中浸泡 20 min 取出后放入保鮮盒內(nèi) 水平碼放整齊 在人工氣候箱中溫度 28 相對濕度 85 條件下保濕培養(yǎng) 清水處理組只浸致病菌不浸 生防菌 空白處理組不浸致病菌不浸生防菌 芹菜莖段人工接種病原菌后 每隔 8 h 觀察 1 次病原菌的侵 染情況 當(dāng)清水對照處理發(fā)病率達到 90 以上時 調(diào)查各處理芹菜莖段的病情指數(shù)并計算防效 15 病情指 數(shù)分級標(biāo)準(zhǔn) 0 級 莖段無任何變化 1 級 發(fā)病組織占莖段長度的 10 及以下 2 級 發(fā)病組織占莖段長 度的 11 30 3 級 發(fā)病組織占莖段長度的 31 50 4 級 發(fā)病組織占莖段長度的 51 100 病 情指數(shù) 各級病莖數(shù) 相對級數(shù)的代表值 總莖段數(shù) 最高級數(shù)的代表值 100 防效 清 水對照平均病情指數(shù) 處理平均病情指數(shù) 清水對照平均病情指數(shù) 100 1 3 2 雙層培養(yǎng)法測定抑制率 采用雙層培養(yǎng)法 16 進行細(xì)菌抑菌譜測定 將拮抗菌株接種在液體 LB 培養(yǎng) 基中 28 下振蕩培養(yǎng) 16 h 調(diào)節(jié)菌懸液濃度至 10 8 cfu mL 在 90 mm PDA 平板中心接種 5 L 拮抗菌株 的菌懸液 以接種液體 LB 培養(yǎng)基為空白對照 28 下培養(yǎng) 24 h 后在通風(fēng)櫥中向倒扣的培養(yǎng)皿中加入 3 mL 390 中 國 生 物 防 治 學(xué) 報 第 36 卷 氯仿 靜置 12 h 以蒸干氯仿并滅活菌株 ZF75 將病原細(xì)菌接種于 NB 培養(yǎng)基中 28 振蕩培養(yǎng) 36 h 調(diào) 節(jié)菌懸液濃度至 10 8 cfu mL 在 4 mL 5 m v WA 培養(yǎng)基中加入 100 L 菌懸液 混勻后倒入 PDA 平板 作為上層 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48 h 觀察并測量抑菌圈大小 抑菌率 對照生長量 處理生長量 對照 生長量 100 1 4 生防細(xì)菌的鑒定 1 4 1 形態(tài)觀察和生理特性測定 通過拮抗菌株的篩選試驗 得到一株對芹菜軟腐病防治效果最好的菌 株 ZF75 將分離菌株劃線接種于 LB 培養(yǎng)基 28 培養(yǎng) 48 h 觀察該菌株的菌落形態(tài) 依據(jù) 伯杰細(xì) 菌鑒定手冊 第八版 17 及 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊 18 28 培養(yǎng) 24 48 h 后 對生理生化特征按進 行鑒定 1 4 2 Biolog 鑒定 使用 BIOLOG GENIII 試劑盒 按照試劑盒說明書操作 測定唯一碳源利用 所有儀 器耗材皆為 Biolog 公司產(chǎn)品 1 4 3 分子鑒定 采用細(xì)菌 DNA 試劑盒提取菌株 ZF75 的 DNA 將其作為 PCR 反應(yīng)的模板 DNA 引物 用于擴增菌株 ZF75 的序列 16S rDNA 通用引物 上游引物 27F 5 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3 下游引物 1492R 5 TACGGCTACCTTGTTACGACTT 3 gyrB 引物 上游引物 UP1 5 GAAGTCATC ATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA 3 下游引物 UP2r 5 AGCAGGGTACGGATGTG CGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT 3 PCR 反應(yīng)條件 95 預(yù)變性 10 min 95 變性 30 s 55 引物復(fù)性 30 s 72 延伸 45 s 34 個循環(huán) 最后 72 延伸 8 min PCR 反應(yīng)采用 50 L 體系 2 Rapid Taq Master Mix 25 L 上下游引物各 0 5 L 菌株總 DNA 0 2 L ddH 2 O 23 8 L PCR 產(chǎn)物用 1 瓊脂糖凝 膠電泳檢測 以 DNA Marker BM5000 為對照檢測產(chǎn)物分子量 電泳測定分析確認(rèn)所需產(chǎn)物后 將樣品送 北京博邁德司測序 采用 MEGA 7 0 軟件中的最大似然法構(gòu)建菌株 ZF75 與其他相近菌株之間的進化樹 1 5 菌株 ZF75 抑菌譜測定 1 5 1 真菌抑菌譜測定 采用平板對峙法 19 進行真菌抑菌譜的測定 在 90 mm PDA 平板中心分別接種 5 mm 所選取的真菌靶標(biāo)菌片 28 下培養(yǎng) 2 d 將菌株 ZF75 接種在液體 LB 培養(yǎng)基中 28 下振蕩培養(yǎng) 16 h 調(diào)節(jié)菌懸液濃度至 10 8 cfu mL 在距離培養(yǎng)皿邊緣 10 mm 處相對的 4 點接種 5 L 菌株 ZF75 的菌懸液 以 接種液體 LB 培養(yǎng)基為空白對照 28 下培養(yǎng) 5 d 后測量靶標(biāo)菌的對照生長量 菌落半徑 和處理生長量 接種細(xì)菌后的生長半徑 用抑菌率表示 抑菌率 對照生長量 處理生長量 對照生長量 100 1 5 2 細(xì)菌抑菌譜測定 方法同 1 3 2 雙層培養(yǎng)法測定抑制率 測定菌株 ZF75 對各病原細(xì)菌的抑菌率 1 6 菌株 ZF75 產(chǎn) IAA 能力測定 稱取 0 01 g IAA 純品溶于 1 mL 無水乙醇中 混勻后吸取 100 L 加去離子水稀釋至 1 mL 混勻后再 吸取 100 L 加去離子水稀釋至 1 mL 得 100 g mL IAA 母液 然后分別配制下列濃度梯度 IAA 水溶液 5 10 15 20 25 30 g mL 將 ZF75 經(jīng) LB 固體培養(yǎng)基活化 LB 液體培養(yǎng)基搖培 1 2 d 并以 0 1 接種量 菌液量 培養(yǎng)基量 v v 分別接種于 DF DF 培養(yǎng)基中 于 28 培養(yǎng) 7 d 12000 r min 離心 5 min 取 1 mL 上清液或各濃度標(biāo)準(zhǔn)液于試管中 加入 50 L Solution 10 mmol L 磷酸 及 2 mL Solution 1 mL 0 5 mol L FeCl 3 溶于 50 mL 35 HClO 4 反應(yīng)液 混勻后于室溫中反應(yīng) 25 min 檢測 530 nm 處吸光度 在 標(biāo)準(zhǔn)曲線上比對并計算 IAA 產(chǎn)量 20 以去離子水作為空白對照 每處理重復(fù) 3 次 結(jié)果取平均值 1 7 菌株 ZF75 對芹菜軟腐病的盆栽防治效果 將裝滿無菌基質(zhì)的 25 cm 60 cm 育苗缽澆透水后 撒播芹菜種子 待芹菜幼苗長至 3 4 片真葉時 1 5 2 月苗齡 開始制備含菌基質(zhì) 將濃度為 10 8 cfu mL 的菌株 ZF75 菌懸液與基質(zhì)土攪拌均勻后 分裝于 5 cm 5 cm 育苗缽中 將生長狀況一致的芹菜幼苗移栽至含生防菌基質(zhì)育苗缽中 緩苗 3 d 待植 株直立 生長正常時用 75 酒精表面消毒的針刺傷芹菜植株莖基部 1 2 次 刺傷但不穿透 而后向傷口 處灌施 1 10 8 cfu mL 致病菌菌懸液 2 mL 每處理 3 次重復(fù) 每重復(fù) 30 株芹菜幼苗 人工接種病原菌后 將植物材料在溫度 26 30 相對濕度 70 85 條件下保濕培養(yǎng) 清水處理只接致病菌不施生防菌 空白對照不接致病菌不施生防菌 芹菜幼苗接種后每隔 8 h 觀察 1 次幼苗發(fā)病情況 待清水對照發(fā)病率達 到 65 以上時 調(diào)查各處理植株發(fā)病情況并計算防效 第 3 期 李磊等 芹菜軟腐病拮抗芽胞桿菌篩選及防治效果 391 1 8 菌株 ZF75 對芹菜促生效果 在溫室條件下 隨機選擇顆粒飽滿程度一致 健康的芹菜種子進行播種 待幼苗長出 3 4 片真葉后 選擇長勢一致的芹菜苗移至 72 cm 24 cm 25 cm 的育苗盆中 緩苗 1 周后將濃度為 1 10 8 cfu mL 菌株 ZF75 菌懸液以 60 L hm 2 進行沖施處理 以沖施空白 LB 培養(yǎng)基作為對照 30 d 后測量芹菜植株株高及地上 部分 1 cm 處的莖粗 一個處理 5 株芹菜 每處理 3 次重復(fù) 2 結(jié)果與分析 2 1 拮抗細(xì)菌的分離與篩選 采用稀釋涂布法從 20 份芹菜根際土壤樣品中分離出 134 株細(xì)菌 以芹菜軟腐病菌為供試植物病原細(xì) 菌 采用芹菜莖段法對所分離的細(xì)菌進行拮抗篩選 共獲得 78 株對芹菜軟腐病菌有拮抗作用的菌株 其 中 10 株防效大于 60 菌株 ZF75 防效最好且防治效果顯著 達 82 55 再采用雙層培養(yǎng)法將 10 株菌株 的抑菌率進行驗證 所得結(jié)果與防效結(jié)果相似 菌株 ZF75 抑制率最高 為 60 56 表 1 圖 1 表 1 拮抗細(xì)菌菌株對芹菜軟腐病菌的抑制效果 Table 1 Control effect of antagonistic bacteria on celery soft rot 處理 Treatment 濃度 Concentration 病情指數(shù) Disease index 防治效果 Control effect 抑制率 Inhibitory rate ZF5 1 10 8 cfu mL 27 86 2 58 c 70 63 2 72 b 57 38 0 52 bc ZF28 1 10 8 cfu mL 35 99 0 48 b 62 05 0 50 c 55 80 0 44 de ZF42 1 10 8 cfu mL 26 07 9 15 c 72 51 9 65 b 58 28 0 75 b ZF48 1 10 8 cfu mL 34 84 2 38 b 63 26 2 51 c 56 69 0 58 cde ZF58 1 10 8 cfu mL 38 10 1 03 b 59 83 1 09 c 56 94 0 62 cd ZF75 1 10 8 cfu mL 16 55 1 97 d 82 55 2 07 a 60 56 1 47 a ZF76 1 10 8 cfu mL 22 57 2 17 cd 76 20 2 29 ab 59 92 0 19 a ZF87 1 10 8 cfu mL 36 04 2 88 b 62 00 3 03 c 55 91 0 42 de ZF94 1 10 8 cfu mL 36 49 3 41 b 61 52 3 60 c 55 48 0 41 e ZF104 1 10 8 cfu mL 26 68 5 12 c 71 87 5 40 b 57 77 0 76 bc CK 94 84 3 28 a 注 數(shù)據(jù)為平均值 標(biāo)準(zhǔn)誤 不同小字母表示 0 05 水平上差異顯著 Note data were presented as mean SD data with different lowercase letters indicated significant difference at 0 05 level A 菌株 ZF75 菌落形態(tài) Colony morphology of ZF75 strain B 菌株 ZF75 抑菌圈 Inhibition zone of ZF75 strain 圖 1 菌株 ZF75 菌落形態(tài)及抑菌圈效果 Fig 1 Colony morphology and inhibition zone of strain ZF75 2 2 菌株鑒定 菌株 ZF75 在 LB 培養(yǎng)基上菌落為淡黃色 不透明 邊緣不規(guī)則 表面光滑 圖 1A 根據(jù) 伯杰 細(xì)菌鑒定手冊 和 常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊 檢測菌株 ZF75 的生理生化反應(yīng) 菌株 ZF75 經(jīng)過革蘭氏染 392 中 國 生 物 防 治 學(xué) 報 第 36 卷 色后菌體呈紫色 為革蘭氏陽性菌 菌體長桿狀 4 41 和 NaCl 含量 1 5 均能生長 有游動 性 接觸酶 V P 反應(yīng)為陽性 檸檬酸鹽 明膠液化 氧化酶反應(yīng)為陰性 可以利用阿拉伯糖和甘露醇 不能利用果膠 表 2 以菌株 ZF75 基因組 DNA 為模板測序表明 16S rDNA 序列長 1454 bp 并上傳 NCBI 網(wǎng)站 序列登錄號 MK215647 1 對 16S rDNA 和 gyrB 序列構(gòu)建聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹 菌株 ZF75 與解淀粉芽胞桿菌模式菌株 DSM7 聚在通一簇上 圖 2 綜上 鑒定菌株 ZF75 為芽胞桿菌屬解淀粉 芽胞桿菌 B amyloliquefaciens 表 2 菌株 ZF75 生理生化測定 Table 2 Physiological and biochemical characters of strain ZF75 測試項目 Items 結(jié)果Results 測試項目 Items 結(jié)果Results 革蘭氏染色 Gram staining test 果膠 Pectin 接觸酶試驗 Catalase test 在4 或 41 生長 Growth at 4 or 41 檸檬酸鹽試驗 Citrate solution test 氧化酶反應(yīng) Cytochrome oxidase test 明膠液化試驗 Gelatin liquefaction test V P 試驗 Acetyl methanol test 阿拉伯糖 D Arabitol 1 NaCl 甘露醇 D Mannose 8 NaCl 注 表示該試驗結(jié)果為陽性 表示該試驗結(jié)果為陰性 Note indicated that the result of the experiment was positive indicated that the result of the experiment was negative Bacillus subtilis strain 168 T Bacillus subtilis strain NCIB 3610 Bacillus velezensis strain FZB42 T Bacillus velezensis strain M75 Bacillus amyloliquefaciens strain ZF75 Bacillus amyloliquefaciens strain Y2 Bacillus amyloliquefaciens strain ZJU1 Bacillus amyloliquefaciens strain DSM7 T Bacillus amyloliquefaciens strain XH7 Bacillus amyloliquefaciens strain MT45 Bacillus amyloliquefaciens strain YP6 Bacillus licheniformis strain ATCC 9789 T Bacillus cereus strain ATCC 4342 Bacillus cereus strain ATCC 14579 T Bacillus megaterium strain ATCC 14581 T Paenibacillus polymyxa strain ATCC 15970 T 100 94 100 97 67 49 100 47 47 58 0 020 圖 2 菌株 ZF75 系統(tǒng)發(fā)育樹 Fig 2 Phylogenetic tree of strain ZF75 2 3 抑菌譜測定結(jié)果分析 分別采用平板對峙法和雙層培養(yǎng)法測定菌株 ZF75 對 6 種病原真菌和 6 種病原細(xì)菌的抑制效果結(jié)果表 明 菌株 ZF75 能夠顯著抑制密執(zhí)安棒桿菌番茄潰瘍致病型 對丁香假單胞番茄致病變種 胡蘿卜軟腐果 膠桿菌氣味亞種 青枯雷爾氏菌 茄匍柄霉 多主棒孢菌的抑制率均在 60 以上 對全部 12 個屬不同種 的病原真菌和病原細(xì)菌都有一定的抑制作用 表 3 綜合以上結(jié)果 菌株 ZF75 具有廣譜抑菌活性 2 4 菌株 ZF75 產(chǎn) IAA 能力分析 通過測定 IAA 標(biāo)準(zhǔn)品不同濃度的稀釋液在 530 nm 處的吸光值 繪制 IAA 的標(biāo)準(zhǔn)曲線為 y 52 507x 2 1535 R 2 0 9996 根據(jù)標(biāo)曲計算 IAA 產(chǎn)量 圖 3 菌株 ZF75 接種于 DF 和 DF 培養(yǎng)基中 在第 7 d 檢測株菌 ZF75 的 IAA 產(chǎn)量結(jié)果表明 菌株 ZF75 在含有 500 g mL 色氨酸的 DF 培養(yǎng)基中在第 7 d 可產(chǎn) 第 3 期 李磊等 芹菜軟腐病拮抗芽胞桿菌篩選及防治效果 393 生 IAA 濃度達到 6 86 g mL 而在不含有色氨酸的 DF 培養(yǎng)基中 第 7 d 時 菌株 ZF75 產(chǎn)生的 IAA 濃 度為 5 43 g mL 表 4 上述結(jié)果表明 色氨酸能誘導(dǎo)菌株 ZF75 產(chǎn)生 IAA 表 3 菌株 ZF75 抑菌譜測定 Table 3 The effects of strain ZF75 on plant pathogens 病原菌 Pathogens 抑菌率 Inhibitory rate 密執(zhí)安棒桿菌番茄潰瘍致病型 Clavibacter michiganensis subsp michiganensis 70 19 0 32 a 丁香假單胞番茄致病變種 Pseudomonas syringae pv tomato 62 96 1 40 c 野油菜黃單胞辣椒斑點致病變種 Xanthomonas campestris pv vesicatoria 50 37 1 16 f 胡蘿卜軟腐果膠桿菌氣味亞種 P carotovorum subsp odoriferum 60 56 1 47 d 青枯雷爾氏菌 Ralstonia solanacearum 60 93 0 64 cd 西瓜嗜酸菌 Acidovorax citrulli 52 96 0 85 e 茄鏈格孢 Alternaria solani 48 12 1 23 g 茄匍柄霉 Stemphylium solani 61 34 1 75 cd 辣椒疫霉 Phytophthora capsici 39 84 2 07 i 多主棒孢菌 Corynespora cassiicola 65 51 0 40 b 瓜果腐霉 Pythium aphanidermatum 43 14 0 42 h 茄病鐮孢菌 Fusarium solani 41 38 1 72 hi 注 數(shù)據(jù)為平均值 標(biāo)準(zhǔn)誤 不同小字母表示 0 05 水平上差異顯著 Note Data were presented as mean SD data with different lowercase letters indicated significant difference at 0 05 level 35 30 25 20 15 10 5 0 0 0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 吸光度 Absorbance A IAA 濃度 Concent r at ion of IAA g mL y 52 507x 2 1535 R 2 0 9996 圖 3 IAA 標(biāo)準(zhǔn)曲線 Fig 3 Standard curve of IAA 表 4 菌株 ZF75 產(chǎn) IAA 能力測定 Table 4 IAA production ability of strain ZF75 處理 Treatment OD 530 IAA 產(chǎn)量 IAA production g mL DF 0 02 0 00 d 3 32 0 03 d DF ZF75 0 06 0 02 b 5 43 1 05 b DF 0 04 0 00 c 4 20 0 00 c DF ZF75 0 09 0 00 a 6 86 0 07 a 注 數(shù)據(jù)為平均值 標(biāo)準(zhǔn)誤 不同小字母表示 0 05 水平上差異顯著 Note data were presented as mean SD data with different lowercase letters indicated significant difference at 0 05 level 2 5 菌株 ZF75 對芹菜軟腐病盆栽防治效果 對照接種芹菜軟腐病菌 1 d 后開始發(fā)病 3 d 后病情指數(shù)達到 90 以上 植株潰爛萎蔫 菌株 ZF75 在 濃度為 1 10 8 cfu mL 時 對芹菜軟腐病的防治效果為 89 62 中生菌素按照 1000 倍液施用后對芹菜軟腐 394 中 國 生 物 防 治 學(xué) 報 第 36 卷 病的防治效果為 37 74 春雷霉素 1000 倍液對芹菜軟腐病的防治效果為 27 40 菌株 ZF75 防效顯著高 于對照藥劑 能有效防治芹菜軟腐病菌 表 5 表 5 菌株 ZF75 對芹菜軟腐病盆栽防治效果 Table 5 Control efficiency of strain ZF75 on celery soft rot 處理 Treatment 濃度 Concentration 病情指數(shù) Disease index 抑菌率 Control effect ZF75 1 10 8 cfu mL 10 19 12 28 d 89 62 12 51 a 中生菌素 Zhongshengmycin 1000 61 11 34 84 c 37 74 35 89 b 春雷霉素 Kasugamycin 1000 83 33 27 40 b 27 40 27 92 c 對照 CK 98 15 6 14 a 注 數(shù)據(jù)為平均值 標(biāo)準(zhǔn)誤 不同小字母表示 0 05 水平上差異顯著 Note data were presented as mean SD data with different lowercase letters indicated significant difference at 0 05 level 2 6 菌株 ZF75 對芹菜促生效果 芹菜促生試驗表明 菌株 ZF75 對芹菜具有良好的促生效果 經(jīng)過 ZF75 菌懸液處理 30 d 的芹菜 平 均株高和平均莖粗分別達 24 18 和 0 51 cm 與清水對照差異顯著 平均株高和平均莖粗分別增加 4 39 和 0 07 cm 表 6 表 6 菌株 ZF75 對芹菜的促生效果 Table 6 The growth promoting effect of ZF75 on celery 處理 Treatment 株高 Plant height 莖粗 Stem diameter ZF75 24 18 2 40 a 0 51 0 08 a LB 20 15 1 62 b 0 46 0 07 b 對照 CK 19 79 1 83 b 0 44 0 10 b 注 數(shù)據(jù)為平均值 標(biāo)準(zhǔn)誤 不同小字母表示 0 05 水平上差異顯著 Note data were presented as mean SD data with different lowercase letters indicated significant difference at 0 05 level 3 討論 菌株 ZF75 是從芹菜根際土壤分離篩選得到一株對芹菜軟腐病具有良好防效的生防菌株 通過菌落形 態(tài)觀察 生理生化特性測定及多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹分析 將該菌株鑒定為解淀粉芽胞桿菌 解淀粉芽胞 桿菌在自然界中分布比較廣 大量的生防解淀粉芽胞桿菌在植株內(nèi)部 21 或根際土壤 22 23 中被分離得到 是 一種重要的生防資源 對植物病原真菌或植物病原細(xì)菌能產(chǎn)生抑制作用 如該菌種對蘆筍莖枯病 24 香蕉 枯萎病 25 番茄枯萎病 26 稻瘟病 27 西瓜枯萎病 28 等植物病害均有防治作用 本研究篩選得到的解淀粉芽胞桿菌 ZF75 對芹菜軟腐病菌胡蘿卜軟腐果膠桿菌氣味亞種具有較強的拮 抗作用 雙層培養(yǎng)法測定抑菌率為 60 56 芹菜莖段法測定防治效果為 82 55 溫室盆栽試驗防效為 89 62 與王彪等 29 的試驗結(jié)果相似 溶桿菌 13 1 能對不同致病力的魔芋軟腐病菌產(chǎn)生拮抗作用 能在 魔芋根部 根際土等生態(tài)位點定殖 30 巨大芽胞桿菌 L2 流分 LE4 3 對魔芋軟腐病菌有良好的抑菌作用 經(jīng) GC MS 檢測其主要成分為苯乙酸乙酯 亞油酸乙酯和苯乙酸甲酯 并推測其作用機制是通過影響細(xì)胞 膜完整性 損傷細(xì)胞結(jié)構(gòu) 抑制細(xì)胞蛋白質(zhì)合成及能量代謝對病原菌發(fā)揮抑菌作用 31 菌株 ZF75 抑菌譜 測定結(jié)果發(fā)現(xiàn) 菌株 ZF75 對病原細(xì)菌的抑制效果較好 但抗真菌活性相對較弱 這可能與菌株本身合成 抗菌物質(zhì)的種類與含量有關(guān) 還有待進一步研究 32 33 生防菌的生防效果易受土壤溫濕度 pH 作物生長 狀況及土壤中生態(tài)系統(tǒng)等微環(huán)境因素的影響 引起防治效果的不穩(wěn)定 極大地限制了生防芽胞桿菌的大面 積推廣應(yīng)用 因此 生防芽胞桿菌 ZF75 在植物根部的定殖能力需要進一步的研究 以便為該菌株的田間 應(yīng)用提供理論指導(dǎo) 參 考 文 獻 1 Nabhan S de Boer S H Maiss E et al Taxonomic relatedness between Pectobacterium carotovorum subsp carotovorum Pectobacterium carotovorum 第 3 期 李磊等 芹菜軟腐病拮抗芽胞桿菌篩選及防治效果 395 subsp odoriferum and Pectobacterium carotovorum subsp brasiliense subsp nov J Journal of Applied Microbiology 2012 113 4 904 913 2 Avrova A O Hyman L J Toth R L et al Application of amplified fragment length polymorphism fingerprinting for taxonomy and identification of the soft rot bacteria Erwinia carotovora and Erwinia chrysanthemi J Applied and Environmental Microbiology 2002 68 1499 1508 3 田宇 馬亞麗 何付新 等 北京地區(qū)芹菜細(xì)菌性軟腐病菌鑒定及其致病力分析 J 植物病理學(xué)報 2016 46 4 433 442 4 Nazerian E Sijam K Ahmad Z A M et al Characterization of Pectobacterium carotovorum subsp carotovorum as a new disease on lettuce in Malaysia J Australasian Plant Disease Notes 2013 8 1 105 107 5 Wegener C B Induction of defence responses against Erwinia soft rot by an