侵染廣東順德 2 種蘭花的辣椒褪綠病毒分子鑒定沈 陽1， 洪 旭1， 呂文剛1， 鐘海偉1， 杜奕華1， 張群玲1， 李云鋒2*( 1順德出入境檢驗檢疫局 ， 廣東順德 528303; 2華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院 ， 廣東廣州 510642)摘要 目的 對侵染蝴蝶蘭和文心蘭的辣椒褪綠病毒進(jìn)行田間調(diào)查 ， 并進(jìn)行分子鑒定 ， 為廣東順德花卉順利出口提供技術(shù)支持和把關(guān)服務(wù) 。 方法 根據(jù)辣椒褪綠病毒的一對特異性引物核殼體 ( nucleocapsid， N) 基因 ， 應(yīng)用 RTPCR 檢測方法對 2 種蘭花疑似感染病毒的植株進(jìn)行分子鑒定 。 結(jié)果 蝴蝶蘭 ( 樣品編號 2、3、5 和 10) 和文心蘭 ( 樣品編號 6) 感染辣椒褪綠病毒 ， 系統(tǒng)進(jìn)化樹表明 2 種蘭花感染的辣椒褪綠病毒與該病毒泰國分離物以較高的后驗概率聚為同一類群 。 結(jié)論 辣椒褪綠病毒已在廣東順德的蝴蝶蘭和文心蘭上發(fā)生危害 ， 且文心蘭感染辣椒褪綠病毒為國內(nèi)首次報道 ， 出口企業(yè)需加強(qiáng)檢疫監(jiān)控工作 。關(guān)鍵詞 蝴蝶蘭 ; 文心蘭 ; 辣椒褪綠病毒 ; 鑒定中圖分類號 S41 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A文章編號 05176611( 2019) 04011703doi: 103969/jissn05176611201904032 開放科學(xué) ( 資源服務(wù) ) 標(biāo)識碼 ( OSID) :Molecular Identification of Capiscum chlorosis virus Infected Two Species of Orchids in Shunde， Guangdong ProvinceSHEN Yang， HONG Xu， L Wen-gang et al ( Shunde Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Shunde， Guangdong 528303)Abstract Objective Field investigation and molecular identification of CaCV infected with Phalaenopsis and Oncidium were conducted， toprovide technical supports and security services for the smooth export of flowers in Shunde， Guangdong Method Based on the nucleocapsid( N) gene of a pair of specific primers of CaCV， the two species of orchids with suspected virus infection were identified by RT-PCR ResultPhalaenopsis ( sample No 2， 3， 5 and 10) and Oncidium ( sample No 6) were infected with CaCV Phylogenetic tree showed that the two or-chids infected with CaCV and the Thai isolate of the virus were clustered into the same group with higher posterior probability ConclusionCapiscum chlorosis virus has been harmful in Phalaenopsis and Oncidium in Shunde， Guangdong Province， the infection of Oncidium with CaCVis the first reported in China Export enterprises need to strengthen quarantining and monitoring workKey words Phalaenopsis; Oncidium; CaCV; Identification基金項目 廣東出入境檢驗檢疫局科技計劃項目 ( 2018GDK64) 。作者簡介 沈陽 ( 1976) ， 男 ， 安徽靈璧人 ， 農(nóng)藝師 ， 從事植物檢疫研究 。* 通信作者 ， 教授 ， 從事植物病理學(xué)研究 。收稿日期 20180930蝴蝶蘭 ( Phalaenopsis sp) 能開出形如蝴蝶飛舞般的花朵 ， 深受花迷們的青睞 ， 素有 “洋蘭王后 ”之稱 。文心蘭 ( On-cidium sp) 花朵奇異可愛 ， 形似飛翔的金蝶 ， 極富動感 ， 是世界重要的盆花和切花種類之一 ， 又稱 “吉祥蘭 ”。然而 ， 近年來隨著蘭花國內(nèi)外貿(mào)易和種質(zhì)交流頻率的增加 ， 蘭花病毒病的發(fā)生有蔓延趨勢 ， 對蘭花產(chǎn)量和品質(zhì)產(chǎn)生了嚴(yán)重影響 。目前 ， 至少有 57 種病毒可感染蘭科植物 1。2008 年 ， 中國臺灣地區(qū)首次報道辣椒褪綠病毒 ( Capiscum chlorosis virus， CaCV)侵染蝴蝶蘭品種 2， 國內(nèi)僅有辣椒褪綠病毒侵染蝴蝶蘭的報道 34， 鮮見該病毒侵染文心蘭的文獻(xiàn)報道 。廣東順德 ， 素稱“千年花鄉(xiāng) ”， 被業(yè)內(nèi)稱為花卉業(yè)的 “圣地 ”， 2015 年成功創(chuàng)建國家級出口種苗花卉質(zhì)量安全示范區(qū) ， 區(qū)內(nèi)種植及出口花卉種類繁多 ， 品質(zhì)優(yōu)良 ， 特別是蝴蝶蘭 、文心蘭等蘭花出口量排全國前列 。為了有效地應(yīng)對進(jìn)口國對順德出口蘭花的植物檢疫措施 ， 應(yīng)盡早檢出感病蘭花植株并實施銷毀 ， 避免蘭花出口受到影響 。筆者根據(jù)辣椒褪綠病毒的一對特異性引物核殼體 ( nucleocapsid， N) 基因 ， 應(yīng)用 RTPCR檢測方法鑒定侵染蝴蝶蘭和文心蘭的辣椒褪綠病毒 ， 以期為出口花卉企業(yè)提供技術(shù)支持和保障 。1 材料與方法11 材料111 疑似病株樣品的采集 。于 2018 年 48 月 ， 先后 4 次在順德多家花卉種植基地開展了蝴蝶蘭 、文心蘭的病毒病害調(diào)查 ， 采用田間調(diào)查與訪問有經(jīng)驗的花農(nóng)等形式相結(jié)合 。選取普查點(diǎn) ， 覆蓋調(diào)查點(diǎn)面積的 80%以上 。采用 2 種調(diào)查方法 : 簡單隨機(jī)取樣法 ， 利用隨機(jī)數(shù)字表或非主觀地抽取一個隨機(jī)樣本 ， 適用于有害生物分布比較均勻的地塊 ; 系統(tǒng)取樣法 ( 順序取樣法 ) ， 在調(diào)查區(qū)內(nèi)按一定的間隔抽取一個取樣單位 ， 包括等距離平行取樣 、對角線取樣等 。常采用五點(diǎn)取樣法 ， 每點(diǎn)不少于 20 株 。采集具有疑似病毒病癥狀的蝴蝶蘭和文心蘭全株或部分組織 ， 主要是植株葉片 ， 詳細(xì)記錄病害發(fā)生部位和危害程度 ， 系統(tǒng)描述病害發(fā)生的癥狀 。拍攝照片 ， 并將感病標(biāo)本攜回實驗室進(jìn)行進(jìn)一步處理與病原鑒定 。112 材料 。RNA 及 DNA 提取試劑盒 、PCR 產(chǎn)物膠回收試劑盒 、PCR 試劑和 DNA Marker 均購于美津生物技術(shù)公司 ; 其他生化和普通化學(xué)試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純 。12 方法121 核酸抽提 。采用 RNAprep pure 植物總 RNA 提取試劑盒 ， 依照產(chǎn)品說明書所示步驟抽提樣品總 RNA，20 保存?zhèn)溆?。利用常規(guī)的 CTAB 法對樣品進(jìn)行總 DNA 抽提 56，20 保存?zhèn)溆?。122 病毒引物的設(shè)計 。根據(jù) GenBank 數(shù)據(jù)庫 CaCV 的核殼體蛋白基因的保守序列分別設(shè)計引物 。上游引物 ac1:5'AGAGCAATCGGGGC3'， 下游引物 ac2: 5'GTTCTAG-CAAAAGCACCT3'， 預(yù)計擴(kuò)增產(chǎn)物 864 bp。123 RTPCR 和 PCR 擴(kuò)增及電泳觀察 。以感病組織總RNA 為模板 ， 采用 RTPCR 試劑盒提供的一步法進(jìn)行 RTPCR 擴(kuò)增 。RTPCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳后 ， 在凝膠成像系統(tǒng)中觀察擴(kuò)增結(jié)果 。安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) ， JAnhui AgricSci 2019， 47( 4) : 117119， 139RTPCR 擴(kuò)增程序如下 : 50 反轉(zhuǎn)錄 30 min， 94 預(yù)變性 5 min; 94 變性 30 s， 55 退火 30 s， 72 延伸 45 s， 35 個循環(huán) ; 72 延伸 10 min。124 測序結(jié)果分析 。對電泳目的條帶切割回收 ， 送北京奧科生物技術(shù)公司進(jìn)行測序 。登錄 NCBI 官網(wǎng) ， 將測序結(jié)果輸入 BLAST( http: / /wwwncbinlmnihgov/BLAST/) 進(jìn)行相似性比對 。根據(jù)相似性確定病毒種類 ， 再進(jìn)一步利用 Mega51軟件對核苷酸序列進(jìn)行多序列分析比較和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹 。2 結(jié)果與分析21 蝴蝶蘭和文心蘭病毒病危害癥狀 由圖 1 可知 ， 疑似感染病毒病的 2 種蘭花病害癥狀主要表現(xiàn)在葉片 ， 一般在葉片上出現(xiàn)斑駁 、花葉 、壞死或斑點(diǎn) ， 少量植株表現(xiàn)為無癥狀 ， 初步統(tǒng)計發(fā)病率約為 10%。22 蝴蝶蘭與文心蘭病毒種類的分子檢測 以反轉(zhuǎn)錄得到的總 DNA 為模板 ， 將圖 1 疑似感病的全部樣品用 CaCV 的特異性引物核殼體基因進(jìn)行 PCR 檢測 ， 從表現(xiàn)典型癥狀的蝴蝶蘭 ( 樣品編號 2、3、5 和 10) 和文心蘭 ( 樣品編號 6) 中擴(kuò)增得到大小為 864 bp 左右的條帶 ， 與感染 CaCV 的陽性對照擴(kuò)增結(jié)果一致 ( 圖 2) 。結(jié)果表明采集的蝴蝶蘭和文心蘭的上述 5 個樣品可能被 CaCV 侵染危害 ， 2 種蘭花的其他疑似感病植株未被 CaCV 侵染 。圖 1 蝴蝶蘭和文心蘭病毒病疑似危害癥狀Fig1 Suspected damage symptoms of virus disease of Phalaenopsis and Oncidium orchid23 蝴蝶蘭與文心蘭 CaCV 順德分離物部分序列分析 將PCR 擴(kuò)增獲得的約 864 bp 的片段進(jìn)行純化 ， 并對電泳目的條帶切割回收和測序 。經(jīng) BLAST 程序 nucleotide blast 進(jìn)行序列相似性檢索和分析 ， 結(jié)果表明檢測為陽性的順德 2 種蘭811 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019 年花 5 個樣品得到的病毒基因組部分序列與 GenBank 中 CaCV泰國分離物 ( 登錄號 FJ9471561) 同源率最高 ， 為 98%99%。由圖 3 可知 ， 順德 2 種蘭花的 5 個樣品確認(rèn)感染 CaCV， 并且與 CaCV 泰國分離物以較高的后驗概率聚為同一類群 。序列聚類結(jié)果表明 ， 在廣東順德蝴蝶蘭和文心蘭上發(fā)現(xiàn)的CaCV 可能是由泰國傳過來的 。注 : MDNA Marker; 117蘭花樣品編號 ， 其中 16、17 分別重復(fù)樣品 1 和 11; 陽為感染 CaCV 的陽性對照 ; 陰為健康對照 ; CK 為無菌清水對照Note: MDNA Marker; 117Orchid samples No， No16， 17 repeat samples No1 and 11 respectively; Positive: positive control of CaCV infection; Negative:healthy control; CK: sterile water control圖 2 蘭花 CaCV RTPCR 檢測電泳結(jié)果Fig2 Electrophoresis of orchid CaCV RTPCR圖 3 基于 CaCV 擴(kuò)增序列和 Orthotospovirus 其他病毒序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig3 Phylogenetic tree constructed from CaCV amplification sequence and other virus sequences of Orthotospovirus3 結(jié)論與討論2017 年 ， 國際病毒分類委員會 ( ICTV) 將布尼亞病毒科( Bunyaviridae) 的番茄斑萎病毒屬歸類到新增的番茄斑萎病毒科 ( Tospoviridae) ， 屬名由 Tospovirus 改為 Orthotospovirus， 該屬現(xiàn)有 11 個確定種 7， CaCV 是西瓜銀斑駁病毒 ( Watermelonsilver mottle virus， WSMoV) 的一個株系 8， 該病毒在蝴蝶蘭和文心蘭的傳播途徑為薊馬傳播或無性繁殖傳播 910。Ortho-tospovirus 病毒引起植物病害癥狀主要有壞死 、褪綠 、黃化環(huán)形病斑 、銀色 、局部枯斑 、矮化和斑駁 。從癥狀表現(xiàn)看 ， 在蝴蝶蘭和文心蘭上主要表現(xiàn)為斑駁 、花葉 、壞死或斑點(diǎn)等典型癥狀 。蝴蝶蘭和文心蘭感染 CaCV 后 ， 觀賞價值受到影響 ， 甚至不能順利出口 ， 對于以出口為導(dǎo)向的順德花卉種植企業(yè)尤為重要 。目前在危害蘭花的各類病害中 ， 生物防治和化學(xué)防治對病毒病仍然無大的效果 ， 因此對蘭花病毒病的預(yù)防顯得極為重要 。目前主要從以下幾個方面對蘭花的病毒病進(jìn)行綜合防治 : 培育無毒種苗 ， 大量種植無毒蘭花種苗并采取有效的防護(hù)措施使種苗不被病毒侵染 ， 從而繁育 、生產(chǎn)無毒小苗 ;( 下轉(zhuǎn)第 139 頁 )91147 卷 4 期 沈 陽等 侵染廣東順德 2 種蘭花的辣椒褪綠病毒分子鑒定茶樹在生長過程中葉片間的上下交疊和相互障蔽現(xiàn)象十分嚴(yán)重 ， 作物的株冠層是一種特殊的小生態(tài)環(huán)境 ， 要把藥液噴灑到株冠層內(nèi)并要求全部噴濕 ， 在技術(shù)上和理論上都是不可能的 10。因此在施藥過程中 ， 應(yīng)充分考慮目標(biāo)害蟲的空間分布 ， 選擇不同的噴霧機(jī)具 ， 使藥液均勻附著在茶樹上 ，以達(dá)到最佳防治效果 。綜合該研究數(shù)據(jù)表明 ， 機(jī)動噴霧組施藥后最佳蟲口減退率達(dá) 9652%、最佳防效達(dá) 9653%， 且持效性更強(qiáng) ; 工效為電動噴霧組的 25 倍 、人工噴霧組的 33 倍 ;總成本較人工組省 525 元 /hm2。結(jié)合實踐操作 ， 使用機(jī)動噴霧器進(jìn)行農(nóng)藥噴施 ， 機(jī)器操作動力大 ， 農(nóng)藥呈彌霧狀態(tài) ， 霧滴細(xì)而均勻 ， 施用同等劑量農(nóng)藥后 ， 葉蟬蟲口減退率更高 ， 防效更好且持久 ， 低成本高效率 ， 為此次研究效果最佳噴施方式 ， 此次試驗結(jié)果與夏龍會等 11的研究結(jié)果基本一致 。因此 ， 建議在經(jīng)濟(jì)條件允許范圍下建議使用機(jī)動噴霧器進(jìn)行農(nóng)藥噴灑 。通過展開農(nóng)藥精量化研究 ， 初步明確了帕力特的施用濃度對茶樹的影響及對葉蟬的防效 ， 同時 ， 篩選了最佳噴施機(jī)械 ， 為大面積開展新型非水溶性農(nóng)藥帕力特的推廣應(yīng)用 、以及如何采用噴施方式提高葉蟬防效提供了理論數(shù)據(jù) 。結(jié)合農(nóng)藥精量化核心示范點(diǎn)防治效果 ， 于 2015 年 6 月結(jié)合小區(qū)試驗研究結(jié)果在茶園對使用機(jī)動噴霧器噴施 450 mL/hm2帕力特藥劑進(jìn)行了示范推廣應(yīng)用 ， 示范面積高縣 3667 hm2、宜賓縣 2300 hm2、江安縣 1133 hm2， 2016 年在宜賓地區(qū)17 5000 hm2( 宜 賓 地 區(qū) 2016 年 總 投 產(chǎn) 茶 園 共 計59 4667 hm2) 投產(chǎn)茶園進(jìn)行推廣應(yīng)用 ， 推廣應(yīng)用過程當(dāng)中得到了廣大茶農(nóng)好評 。隨著人民生活水平的提高 ， 茶農(nóng)勞務(wù)成本也在不斷提高 ， 如何以更低廉的成本達(dá)到更好的效果 ， 是茶園管理中必須考慮的問題之一 。該研究提出的使用機(jī)動噴霧器進(jìn)行農(nóng)藥噴施 ， 不僅能充分噴灑農(nóng)藥 ， 達(dá)到更好的防效 ， 且整體成本也低于常規(guī)的人工 、電動噴霧器 ， 值得推廣應(yīng)用 。該研究農(nóng)藥精量化僅針對帕力特進(jìn)行了系統(tǒng)性研究 ， 在條件允許情況下還應(yīng)加大試驗研究范圍 ， 結(jié)合宜賓茶區(qū)實際情況對新型農(nóng)藥均進(jìn)行相關(guān)研究 ， 從科學(xué)角度為茶農(nóng)提供最佳選擇 ， 創(chuàng)造茶園最佳利益 。參考文獻(xiàn) 1 吳其趕 無公害茶葉栽培技術(shù)及病蟲害防治措施探析 J 農(nóng)家參謀 ，2018( 17) : 85 2 王春梅 ， 葉玉龍 ， 劉躍云 ， 等 四川省宜賓市茶園非水溶性農(nóng)藥帕力特藥效研究 J 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) ， 2015， 41( 15) : 66926693， 6696 3 王志 ， 朱飛 ， 王章學(xué) ， 等 非水溶性農(nóng)藥帕力特防治茶棍薊馬效果研究 J 農(nóng)業(yè)災(zāi)害研究 ， 2014， 4( 4) : 4950， 60 4 李賽 茶園怎樣合理使用農(nóng)藥 J 農(nóng)村實用技術(shù) ， 2009( 3) : 44 5 劉豐靜 ， 李慧玲 ， 王定鋒 ， 等 240g/L 帕力特懸浮劑防治茶橙癭螨試驗 J 福建茶葉 ， 2014， 36( 6) : 2425 6 王紹梅 ， 宋文明 ， 李崇興 新農(nóng)藥凱恩 、帕力特茶園田間防治試驗 J 福建茶葉 ， 2013( 6) : 3839 7 肖衛(wèi)平 ， 王蓉 ， 鄭松 ， 等 6 種手動噴霧器田間使用效果比較 J 耕作與栽培 ， 2007( 3) : 3839 8 楊向黎 ， 李杰 農(nóng)藥的精量施藥技術(shù) J 今日農(nóng)藥 ， 2009( 5) : 44 9 雷該翔 ， 方景英 ， 沈葵英 凱恩與帕力特防治茶小綠葉蟬藥效 J 茶葉科學(xué)技術(shù) ， 2012( 4) : 1819 10 屠豫欽 植物化學(xué)保護(hù)與農(nóng)藥應(yīng)用工藝 M 北京 : 金盾出版社 ， 2018:198219 11 夏會龍 ， 陳雪芬 ， 肖強(qiáng) 改進(jìn)茶園農(nóng)藥噴撒技術(shù)的理論探討 J 中國茶葉 ， 1989( 3) : 1011檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪( 上接第 119 頁 )加強(qiáng)植物檢疫工作 ， 從目前國內(nèi)發(fā)現(xiàn)的蘭花病毒基因序列分析結(jié)果可知 ， CyMV 和 ORSV 分離物與荷蘭 、韓國 、日本等地的分離物同源性很高 11， 因此加強(qiáng)口岸檢疫意義重大 ; 加強(qiáng)對蘭花種植基地蚜蟲 、飛虱 、葉蟬 、螨類和線蟲等有害生物綜合防治工作 ， 這幾類有害生物是傳播病毒病的重要媒介生物 ， 其能夠?qū)⑵渌参锏牟《静魅镜教m花 ， 造成蘭花病毒病的蔓延擴(kuò)散 ; 定期清園 ， 銷毀病葉 、雜草 、老葉等潛在病毒載體 ， 對外人進(jìn)入種植場所進(jìn)行嚴(yán)格限制 ， 降低將外界病毒帶入蘭花種植場的風(fēng)險 ; 加強(qiáng)農(nóng)業(yè)栽培措施 ， 適當(dāng)降低蘭花種植密度 ， 例如 CymMV 可以通過汁液傳播 ， 盡可能避免蘭花植株葉片間的相互重疊和摩擦損傷 ， 以減少病毒通過葉片傷口交叉感染 12。筆者通過核酸提取 、PCR 擴(kuò)增 、基因序列分析并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹 ， 確定了 CaCV 侵染廣東順德蝴蝶蘭和文心蘭這 2種蘭花品種 ， 為花卉種植企業(yè)有效鑒別染病蘭花植株提供技術(shù)支持 ， 并為順德蘭花的順利出口提供把關(guān)服務(wù) 。參考文獻(xiàn) 1 LEE C H， ZHENG Y X， JAN E JThe orchid-infecting viruses found in the21st century M / /CHEN W H， CHEN H WOrchid biotechnology IIINewJersey: World Scientific， 2015: 145157 2 ZHENG Y X， CHEN C C， YANG C J， et alIdentification and characteriza-tion of a tospovirus causing chlorotic ringspots on Phalaenopsis orchids J European journal of plant pathology， 2008， 120( 2) : 199209 3 程曉非 ， 董家紅 ， 方琦 ， 等 從云南蝴蝶蘭上檢測到番茄斑萎病毒屬病毒 J 植物病理學(xué)報 ， 2008， 38( 1) : 3134 4 吳竹妍 ， 劉勇 ， 黎園 ， 等 廣州蝴蝶蘭上檢測到辣椒褪綠病毒 C / /郭澤建 ， 侯明生 中國植物病理學(xué)會 2011 年學(xué)術(shù)年會論文集 北京 : 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社 ， 2011 5 HARRISON B D， LIU Y L， KHALID S， et alDetection and relationships ofcotton leaf curl virus and allied whitefly-transmitted geminiviuses occurringin Pakistan J Annals of applied biology， 1997， 130( 1) : 6175 6 左瑞娟 CTAB 法在提取植物病原物核酸中的應(yīng)用 J 文山學(xué)院學(xué)報 ，2012， 25( 3) : 811 7 唐霜 ， 沈姝 ， 史君明 ， 等 布尼亞病毒目新分類概述 J 生物多樣性 ，2018， 26( 9) : 10041015 8 ZHENG Y X， CHEN C C， JAN F JComplete nucleotide sequence of capsi-cum chlorosis virus isolated from Phalaenopsis orchid and the prediction ofthe unexplored genetic information of tospoviruses J Archives of virolo-gy， 2011， 156( 3) : 421432 9 GERMAN T L， ULLMAN D E， MOYER J WTospoviruses: Diagnosis mo-lecular biology， phylogeny， and vector relationships J Annual reviews ofphytopathology， 1992， 30: 315348 10 吳竹妍 西瓜銀斑駁病毒的分子特性及抗血清的制備 D 廣州 : 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) ， 2012 11 扆守鑫 ， 譚冠林 ， 李凡 ， 等 云南部分蘭花病毒病的病害調(diào)查及病原鑒定 J 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報 ， 2008， 23( 3) : 325328 12 劉黎卿 ， 林志楷 ， 郭鶯 蝴蝶蘭病毒病研究進(jìn)展及防治對策綜述 J 安徽農(nóng)學(xué)通報 ， 2010， 16( 24) : 2123， 12693147 卷 4 期 王春梅等 茶園假眼小綠葉蟬低殘高效農(nóng)藥精量化研究