34(2)294-302 中國生物防治學(xué)報 Chinese Journal of Biological Control 2018 年 4 月 收稿日期： 2017-11-16 基金項(xiàng)目 ： 山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目（ 20150313003-5）；山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院攻關(guān)項(xiàng)目（ ygg1512）；山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士研究基金（ YBSJJ1411） 作者簡介： 李欣欣，助理研究員， E-mail： lixinxin_215163.com； *通信作者，博士，教授， E-mail： zswansxu.edu.cn。 DOI: 10.16409/j.cnki.2095-039x.2018.02.018 堆肥提取液誘導(dǎo)草莓對黃萎病抗性及抑菌機(jī)理研究 李欣欣 1,2，王秀紅 2，史向遠(yuǎn) 2，籍增順 2，李志強(qiáng) 2，張生萬 1* （ 1. 山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太原 030006； 2. 山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究中心，太原 030031） 摘要： 為了明確菌糠堆肥提取液的生物防治效果，進(jìn)一步探討其抑菌防病機(jī)理，以便于有針對性地利用堆肥提取液達(dá)到防病、治病的效果。采用體內(nèi)和體外 2 種試驗(yàn)方法，以草莓黃萎病菌為靶標(biāo)病原菌，研究了堆肥提取液原液、高溫滅菌液和過濾除菌液對大麗輪枝菌菌絲生長和分生孢子萌發(fā)的抑制作用，通過溫室盆栽試驗(yàn)驗(yàn)證 其對草莓黃萎病的防病促生效果，并測定根施堆肥提取液對草莓葉片內(nèi)防御酶系的影響。研究表明，堆肥提取液對病原菌菌絲生長和分生孢子萌發(fā)均有顯著的抑制作用，抑制率分別為 92.43%和82.94%，經(jīng)高溫滅菌和過濾除菌后抑制效果顯著降低。盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，預(yù)先用堆肥提取液灌根處理對草莓黃萎病的防治效果高達(dá) 42.23%，且能誘導(dǎo)草莓葉片內(nèi)防御酶活性顯著增強(qiáng)，接病原菌后第 6 d 該處理下的 POD 和 PPO 活性分別比施清水對照提高了 45.45%和 39.47%，而 MDA 含量則下降了 14.83%。說明微生物對病原菌的直接抑制作用以 及誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性是菌糠堆肥提取液發(fā)揮抑菌防病功效的主要因素。 關(guān) 鍵 詞： 菌糠堆肥提取液；草莓黃萎病；誘導(dǎo)抗性；作用機(jī)理 中圖分類號 ： S476 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A 文章編號： 1005-9261(2018)02-0294-09 Induced Resistance in Strawberry against Verticillium Wilt by Compost Tea and Its Inhibition Mechanism LI Xinxin1,2, WANG Xiuhong2, SHI Xiangyuan2, JI Zengshun2, LI Zhiqiang2, ZHANG Shengwan1* (1. College of Life Science, Shanxi University, Taiyuan 030006, China; 2. Research Center of Modern Agriculture, Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Taiyuan 030031, China) Abstract: We investigated the biocontrol potential of the tea produce from spent mushroom substrate compost for the control of strawberry Verticillium wilt caused by Verticillium dahliae, which is in order to make target use of compost tea to the achievement of disease prevention and treatment. In vitro and in vivo experiments were carried out to determine the mechanisms involved in suppression of V. dahliae. Non-sterilized, heat-sterilized and filter-sterilized compost teas were tested on the inhibition of mycelial growth and conidial germination of V. dahliae. Glasshouse trials were conducted to evaluate the control efficiency of compost tea against strawberry Verticillium wilt and plant growth-promoting effect, and to test for the ability of the compost tea to induce the production of defense-related enzymes. The highest percentage of inhibition in mycelial growth and conidial germination was obtained by the non-sterilized compost tea with values of 92.43% and 82.94%, respectively. The inhibitory efficacy was reduced significantly when the tea was heat-sterilized or filter-sterilized. Pot tests indicated that the control effect of Verticillium wilt was 42.23% when strawberry plants were pre-treated with compost tea. There was a significant increase in defense enzymes when the pre-treated strawberry plants were challenged with V. dahliae. The activities of POD and PPO were increased by 45.45% and 39.47% respectively as compared with the control, while the content of MDA decreased by 14.83% on the sixth day after inoculation. It was therefore suggested that the SMS compost tea suppress pathogen through direct inhibition of microorganisms and primed systemic resistance. 第 2 期 李欣欣 等 ： 堆肥提取液誘導(dǎo)草莓對黃萎病抗性及抑菌機(jī)理研究 295 Key words: compost tea of spent mushroom substrate (SMS); strawberry Verticillium wilt; induced systemic resistance; action mechanism 草莓黃萎病是由大麗輪枝菌 Verticillium dahliae 引起的土傳性植物維管束萎蔫病害，幾乎遍及全球各主要草莓產(chǎn)區(qū)。該病原菌侵染力強(qiáng)，寄主范圍廣，傳播途徑復(fù)雜，受感染植株生長發(fā)育受阻，產(chǎn)量和品質(zhì)嚴(yán)重下降，已成為制約草莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸。因缺乏有效的抗病種質(zhì)資源，生產(chǎn)中常使用溴甲烷等化學(xué)藥劑防治草莓黃萎病，但存在農(nóng)藥殘留、抗藥性和環(huán)境污染等問題，已被世界大多數(shù)國家禁止使用；輪作倒茬等 農(nóng)藝措施雖有一定的效果，但難以適應(yīng)中國集約化的農(nóng)業(yè)種植模式。因此 ， 研究探索新的防治途徑與方法已成為草莓產(chǎn)業(yè)亟需解決的問題。 20 世紀(jì) 60 年代以來，國內(nèi)外有關(guān)利用農(nóng)業(yè)廢棄物來源的有機(jī)改良劑來防病促生的研究方興未艾。其中堆肥提取液是在腐熟堆肥的基礎(chǔ)上用不同方法制備出的水性提取物，不僅能改善土壤微生物環(huán)境，提高農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)，而且對多種土傳病原真菌有明顯的抑制作用，因此可作為有機(jī)液肥推廣使用 1,2。馬利平等 3,4的研究發(fā)現(xiàn)馬、牛和豬糞漚肥浸提液能顯著減少黃瓜霜霉病、白粉病以及青椒枯萎病的發(fā)生。 Diánez 等 5通過離體試驗(yàn)觀察到好氣葡萄渣堆肥提取液對寄生疫霉 Phytophthora parasitica、立枯絲核菌 Rhizoctonia solani、尖孢鐮刀菌 Fusarium oxysporum、大麗輪枝菌 Verticillium dahliae 等多種植物病原菌有顯著的抑制效果。 Naidu 等 6的研究發(fā)現(xiàn)，添加酵母提取物和腐殖酸能使油棕果實(shí)廢棄物堆肥提取液對二孢白粉菌 Golovinomyces cichoracearum 孢子萌發(fā)的抑制率提高到 85%，且對甜瓜白粉病的防治效果等同于殺真菌菌劑。但是目前 尚未見有關(guān)利用堆肥提取液來防治草莓土傳病害的相關(guān)研究報道。 受堆肥自身原料來源、腐熟程度以及提取方式的不同，應(yīng)用堆肥提取液來防治植物病害的效果仍存在爭議，且提取液中含有的抑菌活性物質(zhì)成分和功能微生物組成尚不清楚。本研究以菌糠堆肥（ compost of spent mushroom substrate， SMS）為原料，研究其液態(tài)提取物對草莓黃萎病的生物防治效果，并進(jìn)一步探討其抑菌機(jī)理，以期為高效、安全的功能性液體有機(jī)肥料的開發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。 1 材料與方法 1.1 供試材料 堆肥：由白靈菇 菌糠和牛糞腐熟而成，質(zhì)量比為 10:1。有機(jī)質(zhì)（ OM）： 45.83%；全氮（ TN）： 1.87%；全磷（ TP）： 1.24%；全鉀（ TK）： 0.96%。 病原菌：草莓黃萎病菌 Verticillium dahliae 購自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心。 草莓：品種為“波特拉”，由山西好樂農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司提供。 1.2 堆肥提取液的制備 原液：取勻質(zhì)化的堆肥和自來水（使用前通氣 10 h，以去除水中的氯酸根）按照 1:4（ w/v）的比例放入聚乙烯塑料桶中，充分混勻后持續(xù)通氣，使提取液的溶解氧（ DO）含量不低于 62.00%， 25 下暗培養(yǎng)3 d 后用雙層紗布過濾收集濾液，即為菌糠堆肥提取液。 無菌處理液： 1）高溫滅菌液，堆肥提取液在 121 下滅菌 20 min； 2）過濾除菌液，堆肥提取液先后用 0.45 和 0.22 m PES 材質(zhì)的濾膜過濾除菌。 1.3 對草莓黃萎病菌菌絲生長的抑制作用 菌餅的制備：挑取在試管斜面上保存的大麗輪枝菌轉(zhuǎn)接至 PDA 平板上， 25 恒溫培養(yǎng) 7 d，用直徑為 5 mm 的打孔器沿菌落邊緣打孔取菌餅備用。 抑菌試驗(yàn)采用打孔粘貼法。取預(yù)先融化并保溫至 45 50 的 PDA 培養(yǎng)基 20 mL，加入 2 mL 原液 或無菌處理液，充分混勻后倒平板。待凝固后在平板中央接種草莓黃萎病菌菌餅（ 5 mm），菌絲面朝上，置于 25 恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。對照用等量無菌水代替，其余操作均相同。當(dāng)對照組病原菌菌絲長滿整個培養(yǎng)平板時試驗(yàn)即停止，測量不同處理下病原真菌的菌落直徑，每處理設(shè) 3 個重復(fù)。菌絲生長抑制率（ %）（對照菌落直徑處理菌落直徑） /對照菌落直徑× 100。 296 中 國 生 物 防 治 學(xué) 報 第 34 卷 1.4 對大麗輪枝菌分生孢子萌發(fā)的影響 分生孢子懸液的制備：用 10 mL 無菌水沖洗并刮取培養(yǎng) 15 d 的黃萎病菌菌落， 4 層無菌紗布過濾除去菌絲，取濾液在 4000 r/min 下離心 10 min，棄上清液，將分生孢子重懸于無菌水中 7，重復(fù)該步驟兩次，并調(diào)節(jié)孢子濃度至 1× 105 cfu/mL。 取原液和無菌處理液分別在 4 、 2000 r/min 下離心 20 min，收集上清液備用。吸取 40 L 上清液和10 L 分生孢子懸液加入滅過菌的有凹圓載玻片上，將載玻片放在培養(yǎng)皿內(nèi)，皿底鋪無菌濕潤的濾紙保濕，置于 25 恒溫黑暗培養(yǎng)。每處理設(shè) 3 個重復(fù)，對照用等量無菌水代替。之后每隔 6 h 于 40 倍顯微鏡下觀察各處理分生孢子的萌發(fā)情況，即在每個視野中隨機(jī)檢查 100 個分生孢子，以芽管長度超 過孢子直徑長度一半作為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn) 8。萌發(fā)率（ %）（萌發(fā)孢子數(shù) /總孢子數(shù)）× 100；孢子萌發(fā)抑制率（ %）（對照孢子萌發(fā)率處理孢子萌發(fā)率） /對照孢子萌發(fā)率× 100。 1.5 對盆栽草莓的防病促生效果研究 在山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院日光溫室內(nèi)進(jìn)行。選取 2 葉 1 心的健康草莓幼苗，移栽入裝有 500 g（ 121 滅菌 1 h）進(jìn)口泥炭土的盆缽中，緩苗 14 d 后以傷根灌注法接種大麗輪枝菌孢子懸液（濃度為 1× 107 cfu/mL），接種量為 50 mL/株。試驗(yàn)共設(shè) 5 個處理：（ 1） T1，接病原菌 3 d 前施堆肥提取液；（ 2） T2，接病原菌當(dāng)天施堆肥提取液；（ 3） T3，接病原菌 3 d 后施堆肥提取液；（ 4） T4，待病情爆發(fā)后施堆肥提取液；（ 5）CK，施等量清水為對照。施用量為 200 mL/株，之后每隔 7 d 灌根 1 次，共處理 13 次。每處理 3 次重復(fù)，每重復(fù)種植 10 盆， 試 驗(yàn)盆缽采用完全隨機(jī)排列。 1.5.1 溫室病情調(diào)查和統(tǒng)計 處理 90 d 后，調(diào)查病葉發(fā)生情況，對植株進(jìn)行病情分級。 0 級：健株，葉片無病狀； 1 級：不超過 25%葉片表現(xiàn)病狀，顏色為黃色或有不規(guī)則形的黃色病斑； 2 級： 26% 50%葉片顯病狀，顏色變?yōu)辄S色或黃褐色，葉片邊略有卷 枯 ； 3 級： 51% 75%葉片表現(xiàn)病狀，少數(shù)葉片凋落； 4 級：76%以上葉片發(fā)病，嚴(yán)重時甚至整株枯死。病情指數(shù) （各級病株數(shù)×相應(yīng)病級） /（總株數(shù)×最高病級）× 100；防治效果（ %）（對照病情指數(shù)處理病情指數(shù)） /對照病情指數(shù)× 100。 1.5.2 草莓植株生物學(xué)性狀測定 每處理隨機(jī)挖取 10 株草莓苗，調(diào)查株高，莖粗，中心展開葉往外數(shù)第 3葉的葉柄長、葉柄粗、葉面積、葉綠素相對含量，以及莖葉干重和根干重。 1.6 對草莓植株抗氧化系統(tǒng)的影響 選取 4 葉期，長勢一致、健壯的草莓幼苗進(jìn)行移栽。試驗(yàn)共設(shè) 4 個處理： 1）施清水對照（ CK）； 2）單施堆肥提取液（ T）； 3）施清水 72 h 后接種草莓黃萎病菌（ V）； 4）施堆肥提取液 72 h 后接種草莓黃萎病菌（ T V）。每個處理重復(fù) 3 次，每個重復(fù) 10 株幼苗。黃萎病菌孢子懸液的接種量為 20 mL/株，孢子濃度為 1× 107 cfu/mL。處理后第 0、 2、 4、 6、 8、 10、 12、 14 d 隨機(jī)取相同部位的草莓葉片，用去離子水沖洗干凈后以濾紙吸干表面水分，每個重復(fù)精確稱取 0.5 g，用液氮快速冷凍后置于 -80 超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?過氧化物酶（ POD）活性測定采用愈創(chuàng)木酚法，以每分鐘 470 nm 處 OD 值變化 0.01 為 1 個酶活性單位（ U） 9；多酚氧化酶（ PPO）活性測定采用鄰苯二酚法，以每分鐘 420 nm 處 OD 值變化 0.01 為 1 個酶活性單位（ U） 10；丙二醛（ MDA）含量測定采用硫代巴比妥酸比色法 11。 1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 采用 Excel 2010 對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。以 SPSS 21.0 統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行方差分析，并用 Duncans 多重比較法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。 2 結(jié)果與分析 2.1 堆肥提取液對草莓黃萎病病原真菌的作用 2.1.1 對菌 絲生長的抑制作用 大麗輪枝菌在含不同處理液的培養(yǎng)基上的生長狀況如表 1 所示，菌絲在含原液培養(yǎng)平板上的生長速度顯著低于對照處理，且隨培養(yǎng)時間的延長抑制作用持續(xù)增強(qiáng)，到 15 d 時的菌絲生長抑制率達(dá)到了 92.43%； 121 高溫滅菌后，其對大麗輪枝菌的抑制作用減弱，相比原液處理下降了約84.42% 88.03%，但仍顯著高于過濾除菌后的抑制率；堆肥提取液用 0.22 m 的濾膜過濾后，基本喪失了 第 2 期 李欣欣 等 ： 堆肥提取液誘導(dǎo)草莓對黃萎病抗性及抑菌機(jī)理研究 297 表 1 堆肥提取液對大麗輪枝菌菌絲生長的抑制作用 Table 1 Inhibitory effect of compost tea on mycelial growth of V. dahliae in vitro 處理 Treatment 菌落直徑 Colony diameter (mm) 抑制率 Inhibition rate (%) 5 d 10 d 15 d 5 d 10 d 15 d 對照 Sterilized water control 29.07± 0.32 53.80± 0.20 70.93± 1.21 - - - 原液 Non-sterilized compost tea 5.10± 0.10 5.33± 0.42 5.37± 0.38 82.46± 0.34 a 90.09± 0.77 a 92.43± 0.53 a 高溫滅菌液 Heat-sterilized compost tea 25.33± 0.23 48.00± 0.50 62.57± 0.75 12.85± 0.79 b 10.78± 0.93 b 11.79± 1.06 b 過濾除菌液 Filter-sterilized compost tea 27.97± 0.31 51.90± 0.36 69.13± 1.03 3.80± 1.05 c 3.53± 0.67 c 2.53± 1.45 c 注：表中數(shù)據(jù)為平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差，同列帶不同字母的數(shù)據(jù)表示在 0.05 水平下差異顯著。下同。 Note: Data were mean± SD, within a column, data with different lowercase letters were significantly different according to Duncans multiple range test at 0.05 level. The same below. 對病原菌菌絲生長的抑制作用，抑制 率介于 2.53% 3.80%。 經(jīng) 培 養(yǎng)后在含原液的培養(yǎng)平板上布滿了不同類型的微生物菌落，其中不乏芽 胞 桿菌 Bacillus spp.、木霉菌 Trichoderma spp.、假單胞菌 Pseudomonas spp.和鏈霉菌 Streptomyces spp.等種類，它們通過競爭、拮抗、寄生和誘導(dǎo)植物抗性等作用能對病原菌起到很強(qiáng)的抑制作用；用微孔濾膜過濾除菌后，不僅微生物菌體被去除，發(fā)酵過程中產(chǎn)生的抗生素、細(xì)胞壁水解酶、腐殖酸等大分子量的化合物也會被截留出來，故對病原真菌菌絲生長起不到抑制作用；經(jīng)高溫滅菌處理后， 雖然微生物菌體被破壞，但液體中仍保留了某些大分子量、熱穩(wěn)定的微生物次級代謝產(chǎn)物或抑菌活性物質(zhì)，能破壞大麗輪枝菌生長點(diǎn)，引起菌絲消解（圖 1）。 同時在鏡檢時發(fā)現(xiàn)，在無菌水對照中，分生孢子呈橢圓形且無色透明，可由細(xì)胞兩端正常分化形成菌絲狀的芽管（圖 2A）。在原液和高溫滅菌液處理下，分生孢子和芽管多呈不規(guī)則畸形。分生孢子細(xì)胞腫脹變形（圖 2B）；芽管萌發(fā)受阻，在基部、中間及頂部發(fā)生局部膨大并扭曲變形，或在一端分化形成多個分支（圖 2C）。 A BC DA：無菌水對照 Sterilized water control； B：原液 Non-sterilized compost tea； C：高溫滅菌液 Heat-sterilized compost tea； D：過濾除菌液 Filter- sterilized compost tea 圖 1 不同處理對大麗輪枝菌菌絲生長的影響 Fig. 1 Inhibitory effect of different treatments on mycelial growth of V. dahliae A BCA：無菌水對照 Sterilized water control； B：原液 Non-sterilized compost tea； C：高溫滅菌液 Heat-sterilized compost tea 圖 2 不同處理下大麗輪枝菌分生孢子及芽管形態(tài) Fig. 2 Germinated conidia with germ tubes (magnification× 1000) 2.1.2 對分生孢子萌發(fā)的影響 大麗輪枝菌分生孢子的萌發(fā)率隨時間的延長不斷增加，并趨于穩(wěn)定。在無菌 水對照中， 18 h 時的萌發(fā)率已達(dá) 95.67%（圖 3）。加入原液和無菌處理液后，芽管的萌發(fā)和伸長受到了不同程度的抑制，其中用原液處理后的抑制率顯著高于其 他 處理， 12 h 時的抑制率為 82.94%；其次為高溫298 中 國 生 物 防 治 學(xué) 報 第 34 卷 滅菌處理，抑制率 39.98% 55.40%；過濾除菌液對孢子萌發(fā)的抑制作用最弱， 24 h 時約有 87.00%的分生孢子已萌發(fā)，抑制率為 12.71%（圖 4）。 aaaaddddbbbbcccc01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 0 00 6 1 2 1 8 2 4培 養(yǎng) 時 間 I n c u b a t i o n t i m e ( h )萌發(fā)率Germinationrate(%)對 照 S t e r i l i z e d w a t e r c o n t r o l原 液 N o n - s t e r i l i z e d c o m p o s t t e a過 濾 除 菌 液 F i l t e r - s t e r i l i z e d c o m p o s t t e a高 溫 滅 菌 液 H e a t - s t e r i l i z e d c o m p o s t t e a圖 3 堆肥提取液對大麗輪枝菌分生孢子萌發(fā)的影響 Fig. 3 Influence of compost tea on conidial germination of V. dahliae aaaabbbbcccc01 02 03 04 05 06 07 08 09 01 0 06 1 2 1 8 2 4培 養(yǎng) 時 間 I n c u b a t i o n t i m e ( h )抑制率Inhibitionrate(%)原 液 N o n - s t e r i l i z e d c o m p o s t t e a高 溫 滅 菌 液 H e a t - s t e r i l i z e d c o m p o s t t e a過 濾 除 菌 液 F i l t e r - s t e r i l i z e d c o m p o s t t e a圖 4 堆肥提取液對大麗輪枝菌分生孢子萌發(fā)的抑制效果 Fig. 4 Effect of compost tea on inhibition of conidial germination of V. dahliae 2.2 堆肥提取液對盆栽草莓的防病促生效果 2.2.1 對草莓黃萎病的防治效果 施堆肥提取液與施清水對照相比，草莓黃萎病病情 指數(shù)顯著降低，其中以對照組的病情指數(shù)最高，處理 90 d 后達(dá) 75.00。不同施用時間對草莓黃萎病的防控效果存在顯著差異，預(yù)先用堆肥提取液灌根處理下的病情指數(shù)最低為 43.33，其防治效果高達(dá) 42.23%；其次為接菌當(dāng)天及接菌3 d 后施堆肥提取液處理，防效 分別 為 34.44%和 30.00%；接菌 20 d 時草莓外圍葉緣表現(xiàn)出發(fā)黃、卷曲、萎蔫等病癥，此時施堆肥提取液對黃萎病的防控效果最差，僅為 18.89%。由此可知，用堆肥提取液灌根能有效防治草莓黃萎病，且這種作用是預(yù)防性而非治療性的（表 2）。 表 2 不同處理對草莓黃 萎病的防治效果 Table 2 Disease index and control effect of different treatments on strawberry Verticillium wilt under greenhouse condition 處理 Treatment 病情指數(shù) Disease index 防治效果 Control effect (%) 對照 Water control 75.00± 4.33 a - 接病原菌 3 d 前施堆肥提取液 Compost tea applied 3 d prior to inoculation 43.33± 1.44 d 42.23± 1.92 a 接病原菌當(dāng)天施堆肥提取液 Compost tea applied simultaneously with inoculation 49.17± 2.89 c 34.44± 3.85 b 接病原菌 3 d 后施堆肥提取液 Compost tea applied 3 d after inoculation 52.50± 2.50 c 30.00± 3.33 b 病情爆發(fā)后施堆肥提取液 Compost tea applied after disease outbreak 60.83± 2.89 b 18.89± 3.85 c 2.2.2 對盆栽草莓生長狀況的影響 不同處理下草莓植株生長狀況存在顯著差異，對照組植株在黃萎病菌的脅迫下，生長發(fā)育受阻、株型較小，株高和莖粗僅為 11.67、 1.43 cm。經(jīng)堆肥提取液處理過的植株，其生長狀況顯著優(yōu)于對照，以 T1 處理的促生作用最為明顯，其株高、莖粗、葉柄長、葉柄粗、葉面積、葉綠素相對含量分別比對照增加了 41.65%、 37.61%、 44.73%、 29.37%、 48.39%和 17.90%。處理 90 d 時， T1處理的地上部和地下部干重相比對照提高了 57.14%和 73.94%；其次為 T2、 T3 處理，分別提高了 43.39%、54.55%和 33.07%、 40.61%；以 T4 處理的增重最少。綜合以上分析，根施堆肥提取液能促進(jìn)葉綠素的合成，有助于改善草莓植株的營養(yǎng)生長狀況 （表 3）。 2.3 堆肥提取液對草莓葉片內(nèi)防御酶系的影響 2.3.1 對過氧化物酶活性的影響 本研究分別用堆肥提取液、黃萎病菌孢子懸液以及清水刺激草莓根部，并檢測草莓葉片內(nèi)防御酶活性的變化。大量研究已證明大麗輪枝菌侵染植株后會 引起防御酶活性的提高 12。 草 第 2 期 李欣欣 等 ： 堆肥提取液誘導(dǎo)草莓對黃萎病抗性及抑菌機(jī)理研究 299 表 3 不同處理對盆栽草莓植株的促生作用 Table 3 Growth promoting effect of different treatments on strawberry plant by pot experiment 測定指標(biāo) Plant characteristic 處理 Treatment CK T1 T2 T3 T4 株高 Plant height (cm) 測定值 Measured value 增率 Growth rate CK (%) 11.67± 0.82 e - 16.53± 0.96 a 41.65 15.23± 0.97 b 30.50 14.09± 0.88 c 20.74 13.11± 0.81 d 12.34 莖粗 Stem diameter (mm) 測定值 Measured value 增率 Growth rate CK (%) 14.33± 0.62 e - 19.72± 0.78 a 37.61 18.74± 0.95 b 30.77 17.61± 0.88 c 22.89 16.50± 0.85 d 15.14 葉柄長 Petiole length (cm) 測定值 Measured value 增率 Growth rate CK (%) 6.93± 0.96 e - 10.03± 0.55 a 44.73 9.41± 0.58 b 35.79 8.80± 0.55 c 26.98 7.89± 0.59 d 13.85 葉柄粗 Petiole diameter (mm) 測定值 Measured value 增率 Growth rate CK (%) 2.69± 0.34 d - 3.48± 0.12 a 29.37 3.25± 0.17 b 20.82 3.15± 0.21 bc 17.10 2.97± 0.17 c 10.41 葉面積 leaf area (cm2) 測定值 Measured value 增率 Growth rate CK (%) 21.43± 3.21 d - 31.80± 1.93 a 48.39 28.30± 1.79 b 32.06 27.82± 2.53 b 29.82 25.45± 2.46 c 18.76 葉綠素相對含量 SPAD 測定值 Measured value 增率 Growth rate CK (%) 53.53± 1.20 e - 63.11± 1.68 a 17.90 61.07± 1.85 b 14.09 59.49± 1.72 c 11.13 57.16± 1.84 d 6.78 莖葉干重 Steam and leaf dry weight (g) 測定值 Measured value 增率 Growth rate CK (%) 3.78± 0.20 e - 5.94± 0.33 a 57.14 5.42± 0.24 b 43.39 5.03± 0.37 c 33.07 4.47± 0.38 d 18.25 根干重 Root dry weight (g) 測定 值 Measured value 增率 Growth rate CK (%) 1.65± 0.10 e - 2.87± 0.19 a 73.94 2.55± 0.20 b 54.55 2.32± 0.29 c 40.61 1.93± 0.25 d 16.97 注： CK，清水對照； T1，接病原菌 3 d 前施堆肥提取液； T2，接病原菌當(dāng)天施堆肥提取液； T3，接病原菌 3 d 后施堆肥提取液； T4，病情爆發(fā)后施堆肥提取液。 增率 CK（ %）為處理相比對照提高的百分率。同行帶不同字母的數(shù)據(jù)表示在 P 0.05 水平下差異顯著。 Note: CK, water control; T1, compost tea applied 3 d prior to inoculation; T2, compost tea applied simultaneously with inoculation; T3, compost tea applied 3 d after inoculation; T4, compost tea applied after disease outbreak. Growth rate CK (%) represented the percentage increase of the treatment compared with the control. Within a row, values with different letters are significantly different according to Duncan´s multiple range test at P 0.05. 莓幼苗接種黃萎病菌后， POD 活性大小隨時間變化呈先上升后下降的趨勢，并在接病后第 6 d 達(dá)到峰值，為 806.67 U/（ g·min） （圖 5）；受病原菌脅迫時，預(yù)先用堆肥提取液灌根處理能顯著提高葉片的 POD 活性，在第 6 d 時升高至 1173.34 U/（ g·min） ，相比單施孢子懸液處理提高了 45.45%；單施堆肥提取液處理下的 POD 活性變化呈緩慢下降趨勢，且在初期（ 0 4 d）略高于施清水處理，分別是對照的 1.59、 1.32 和1.44 倍，在中后期（ 6 14 d）同對照相比差異不顯著 （圖 5） 。 2.3.2 對多酚氧化酶活性的影響 不接種病原菌時，單施堆肥提取液與施清水對照相比，草莓葉片內(nèi)的PPO 活性變化趨勢較為平緩且 無 顯著差異，變化范圍為 216.67 366.67 U/（ g·min） ；受到病原菌侵染時，葉片內(nèi)的 PPO 活性迅速升高，并在第 6 d 時達(dá)到最大值，為 1131.67 U/（ g·min） ，隨后逐漸下降；自接入病原菌的第 2 d 起，預(yù)先用堆肥提取液灌根處理下的 PPO 活性顯著高于其 他 組處理，相比單施黃萎病菌孢子懸液處理提高了約 36.50% 81.57%。綜上所述，在未受到病原菌侵染時，單施堆肥提取液并不能激活植株自身防御反應(yīng)；挑戰(zhàn)接種病原菌后，預(yù)先用堆肥提取液灌根能顯著提高植株體內(nèi)防御相關(guān)酶系的表達(dá)，以阻止病原菌進(jìn)一步侵染（圖 5）。 2.3.3 對丙二醛含量的影響 在未受到病原菌脅迫時，單施堆肥提取液處理下草莓葉片內(nèi)的 MDA 含量與清水對照相比差異不大，不超過 3.99 mol/g，在進(jìn)行傷根處理后 10 d 內(nèi) MDA 含量呈上升 下降趨勢，此后趨于穩(wěn)定；黃萎病菌侵染導(dǎo)致草莓植株膜脂過氧化程度增高，葉片中 MDA 含量在接種后第 4 d 迅速升高至 6.48 mol/g，是清水對照的 1.71 倍；預(yù)先用堆肥提取液灌根能減輕細(xì)胞受損傷程度，在接種后第 2、4、 6 d 時葉片 MDA 含量較單施病原菌處理分別降低了 17.02%、 22.81%和 14.83%。說明施堆肥提取液 有助于抑制植株體內(nèi)細(xì)胞膜脂過氧化過程，減少細(xì)胞損傷從而減輕病情（圖 5）。 3 討論 許多研究結(jié)果表明，堆肥提取液作為一種有機(jī)改良劑，能有效地抑制某些葉傳和土傳病害，具有“肥藥合一”的作用。但具體是何種功能物質(zhì)成分或通過何種方式起到關(guān)鍵作用，目前尚無統(tǒng)一定論。一些研 300 中 國 生 物 防 治 學(xué) 報 第 34 卷 cbcccccaaaaaaaaa cbcccccbabbbbba2 . 53 . 03 . 54 . 04 . 55 . 05 . 56 . 06 . 57 . 07 . 50 2 4 6 8 1 0 1 2 1 4丙二醛含量ContentofMDA(mol/g)接 種 后 天 數(shù) D a y s a f t e r i n o c u l a t i o n ( d )C K V TT Vcccccccab