34(2)303-309 中國(guó)生物防治學(xué)報(bào) Chinese Journal of Biological Control 2018 年 4 月 收稿日期： 2017-10-12 基金項(xiàng)目：上海市科委科技支撐項(xiàng)目（ 16391902400） 作者簡(jiǎn)介：王承芳，碩士，農(nóng)藝師， E-mail： wangfang3307163.com； *通信作者，博士， E-mail： weilimaohotmail.com。 DOI: 10.16409/j.cnki.2095-039x.2018.02.019 哌珀霉素防治草莓炭疽病的研究 王承芳1，王偉民2，干華磊1，葉乃瑋1，陳 娟1，毛偉力1*（ 1. 上海萬(wàn)力華生物科技有限公司，上海 201203； 2. 上海市青浦區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，上海 201700） 摘要： 采用菌絲生長(zhǎng)速率法，用橘綠木霉 Trichoderma citrinoviride TR673 在液體發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的一種次級(jí)代謝物 哌珀霉素（ Peptaibols） ，對(duì)多種植物病原菌進(jìn)行了抑菌活性測(cè)試。結(jié)果顯示，哌珀霉素對(duì)草莓炭疽病的病原菌膠孢炭疽菌 Colletotrichum gloeosporioides 有較高的抑菌活性，其 EC50和 EC90分別為1.480 和 22.193 mg/L。將含有哌珀霉素的發(fā)酵粗提物制成含 12%哌珀霉素可濕性粉劑，在上海青浦和金山2 個(gè)地區(qū)，進(jìn)行防治草莓炭疽病的藥效試驗(yàn)。當(dāng) 12%哌珀霉素的施用量 450 g/hm2時(shí)，對(duì)草莓炭疽病的防治效果顯著高于其他施用量處理和 50%多菌靈可濕性粉劑的化學(xué)對(duì)照處理。在進(jìn)行“安全性評(píng)價(jià)”測(cè)試時(shí)發(fā)現(xiàn)，用濃度為 900、 1800、 3600 g/hm2的 12%哌珀霉素可濕性粉劑對(duì) 3 個(gè)草莓品種進(jìn)行施藥，不僅對(duì)生長(zhǎng)無(wú)影響，也無(wú)藥害產(chǎn)生。 關(guān) 鍵 詞： 哌珀霉素；草莓炭疽?。豢咕?；木霉菌 中圖分類(lèi)號(hào)： S476 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào): 1005-9261(2018)02-0303-07 Control Effect of Peptaibols against Strawberry Anthracnose WANG Chengfang1, WANG Weimin2, GAN Hualei1, YE Naiwei1, CHENG Juan1, MAO Weili1*(1. Shanghai WLH Biotech Corpration, Shanghai 201203, China; 2. Qingpu Agrotechnology Extension Service Center, Shanghai 201700, China) Abstract: By use of measuring the growth rate of fungal mycelium, many plant pathogens were antagonistically tested with a peptaibols, a secondary metabolite produced by the strain TR673 of Trichoderma citrinoviride during liquid fermentation process. The results showed that this peptaibols can strongly prevent the growth of Colletotrichum gloeosporioide, a causal pathogen of strawberry anthracnose. The values of its EC50and EC90were 1.4795 mg/L and 22.1937mg/L, respectively. A formulation of 12% peptaibols wettable powder (WP) was made from the crude extractings and used to conduct an efficacy test on preventing the disease of strawberry anthracnose in Qingpu and Jinshan areas of Shanghai. When the application rate of 12% peptaibols WP was450 g/hm2, control efficacy of strawberry anthracnose was significantly higher than other treatments including the chemical control of 50% carbendazim WP. A “Safety Evaluation Test” was conducted with 3 application rates (900, 1800, 3600 g/hm2) onto 3 varieties of strawberry. The results indicated that there were no side-effects on growth and chemical toxicity to the strawberries. Key words: peptaibols; strawberry anthracnose; antimicrobial peptides; Trichoderma spp. 由膠孢炭疽菌 Colletotrichum gloeosporioides 浸染引起的草莓炭疽病，主要危害草莓的匍匐莖、葉片和根頸等部位，造成局部病斑或全株枯萎壞死1,2。炭疽病的高發(fā)期通常在草莓的苗期和定殖初期，在高溫多雨的氣候條件下，發(fā)病率可高達(dá) 90%以上，造成毀滅性死苗，嚴(yán)重影響了草莓產(chǎn)量2-4。目前對(duì)草莓炭疽病的防治主要以農(nóng)田管理和化學(xué)防治為主。農(nóng)田管理包括土壤消毒、選育抗病品種、及時(shí)清園、加強(qiáng)栽培304 中 國(guó) 生 物 防 治 學(xué) 報(bào) 第 34 卷 管理等。常用的化學(xué)防治藥物有多菌靈、甲基托布津和咪鮮胺等藥劑3-5。由于農(nóng)田生態(tài)環(huán)境的持續(xù)惡化和長(zhǎng)期單一使用某種化學(xué)藥劑，導(dǎo)致草莓炭疽病原菌對(duì)多菌靈和乙霉威等化學(xué)藥劑產(chǎn)生了抗藥性，防治效果不明顯4。因此，開(kāi)發(fā)和篩選有效防治草莓炭疽病的新藥，對(duì)草莓種植業(yè)的健康發(fā)展極為重要。 木霉菌 Trichoderma spp.是一種重要的生防菌，其生防機(jī)制包括重寄生、競(jìng)爭(zhēng)作用、產(chǎn)生代謝胞外酶、抗生性次級(jí)代謝產(chǎn)物、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性、水解酶與植物的防衛(wèi)反應(yīng)等6,7。近年來(lái)，抗生性代謝產(chǎn)物在生物防治中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛8。根據(jù)代謝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，木霉菌產(chǎn)生的抗生性次級(jí)代謝物可分為六大類(lèi)：聚酮類(lèi)、肽及氨基酸類(lèi)、萜烯類(lèi)、含氮及雜環(huán)類(lèi)化合物類(lèi)、甾族類(lèi)和羥酸衍生物類(lèi)6。其中，多肽及氨基酸是木霉菌在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的主要抗生性次級(jí)代謝產(chǎn)物，也是目前研究的熱點(diǎn)之一7,8。 哌珀霉素（ Peptaibols）是一類(lèi)特殊肽類(lèi)抗生素的總稱(chēng)9。其結(jié)構(gòu)具有以下特點(diǎn)：（ 1）含有高比例的非蛋白質(zhì)氨基酸殘基或脂氨酸，尤其富含 -氨基異丁酸（ Aib）；（ 2）具有烷基化的 N 末端和羥基化的 C末端；（ 3）具有線(xiàn)性 -螺旋，分子量大多為 500 2000 Da，分子長(zhǎng)度在 5 20 殘基之間，多數(shù)為 15 20個(gè)殘基9-11。哌珀霉素具有兩親性的結(jié)構(gòu)，能夠有選擇性與細(xì)胞膜進(jìn)行結(jié)合形成跨膜孔道，破壞細(xì)胞膜的完整性，造成胞內(nèi)物質(zhì)外流而引起細(xì)胞的死亡9,10。哌珀霉素具有抗菌、抗病毒、抗線(xiàn)蟲(chóng)、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)植物抗性等多種生物學(xué)活性11-15。有研究發(fā)現(xiàn)哌珀霉素對(duì)水稻紋枯病菌 Rhizoctonia solani、黃瓜立枯病菌 R. solani、 黃瓜枯萎病菌 Fusarium oxysporum、西瓜枯萎病菌 F. oxysporum、水稻稻瘟病菌Magnaporthe oryzae 等多種病原真菌具有強(qiáng)抑制作用12-14。 Beven 和 Wroblewski15發(fā)現(xiàn)哌珀霉素可通過(guò)誘導(dǎo)柔膜細(xì)菌運(yùn)動(dòng)能力和螺旋的喪失等實(shí)現(xiàn)殺細(xì)菌作用。 Yun 等16發(fā)現(xiàn)哌珀霉素對(duì)煙草花葉病毒 Tobacco mosaic virus 有強(qiáng)的抑制效果。 哌珀霉素主要由木霉菌代謝產(chǎn)生，目前已發(fā)現(xiàn)的 300 多種抗菌肽中，有 190 種由木霉菌產(chǎn)生，如長(zhǎng)枝木霉 T. longibranchiatum、橘綠木霉 T. citrinoviride、哈茨木霉 T. harzianum、擬康寧木霉 T. koningiopsis、綠色木霉 T. chlorosporum 等9。本文研究的哌珀霉素是由上海萬(wàn)力華生物科技有限公司（上海萬(wàn)力華）從橘綠木霉菌株 TR673 的發(fā)酵液中分離得到的。其全序列為 Aib-Ala-Aib-Ala-Aib-Ala-Gln-Aib-Val-Aib- Gly-Leu-Aib-Pro-Val-Aib-Val-Gln-Gln-Fol。全國(guó)農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)根據(jù)結(jié)構(gòu)和特性，將中文通用名命名為“哌珀霉素”。本文通過(guò)對(duì)該哌珀霉素以及 12%哌珀霉素可濕性粉劑（ WP）的生物活性進(jìn)行多方面的測(cè)試，為開(kāi)發(fā)一種新型的生物化學(xué)農(nóng)藥在植物病害特別是對(duì)草莓炭疽病的防治提供了可參考的依據(jù)。 1 材料與方法 1.1 供試菌株 腐霉 Pythiumap.aphanidermatum、禾谷鐮孢菌 Fusarium graminearum、灰葡萄孢 Botrytis cinerea、尖孢鐮刀菌 F. oxysporum、尖核盤(pán)菌 Sclerotinias sclerotiorum、膠孢炭疽菌 C. gloeosporioides、茄鏈格孢菌Alternaria solani、立枯絲核菌 Rhizctonia solani、大麗輪枝菌 Verticillium dahliae、 灰葡萄孢 B. cinerea 等，所有病原菌均由上海萬(wàn)力華生物科技公司分離、鑒定并保存。病原真菌采用 PDA（馬鈴薯 200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉 15 g 加水至 1000 mL，自然 pH）進(jìn)行培養(yǎng)。 1.2 供試草莓苗 供試草莓苗品種為章姬、紅顏、寧玉，均由上海市金山草莓研究所提供。 1.3 試驗(yàn)藥劑以及檢測(cè)方法 1.3.1 試驗(yàn)藥劑 50%多菌靈可濕性粉劑 （上海悅聯(lián)化工有限公司） ， 46%哌珀霉素粗提物為將菌株 TR673發(fā)酵液中的菌絲體通過(guò)酒精浸提、減壓干燥濃縮制成17； 12%哌珀霉素 WP 由 46%哌珀霉素粗提物，添加木質(zhì)素磺酸鈉、 NNO、硅藻土，經(jīng)過(guò)氣流粉碎而制成；哌珀霉素標(biāo)準(zhǔn)品（ WLHTC20150809 批次）經(jīng)LC-MS 測(cè)定，純度為 98%；乙腈（美國(guó) TEDIA 公司）；甲醇（美國(guó) TEDIA 公司）為色譜純；其余試劑均為分析純。 1.3.2 檢測(cè)方法 利用 CP64 型電子天平（美國(guó) OHAUS）精準(zhǔn)稱(chēng)取哌珀霉素標(biāo)準(zhǔn)品（ WLHTC20150809 批次） 10 mg，置于 50 mL 容量瓶中，先加 10 mL 純甲醇超聲溶解，然后以純甲醇稀釋定容至刻度線(xiàn)，制成哌珀霉素質(zhì)量濃度為 196 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，利用高效液相色譜儀 Agela LC-10F（包括 P2010 二元泵，第 2 期 王承芳等：哌珀霉素防治草莓炭疽病的研究 305 UV2000D 檢測(cè)器和 Agela 色譜工作站）通過(guò)外標(biāo)法進(jìn)行含量測(cè)定。液相色譜條件：色譜柱 Venusil MPC18（ 4.6 mm× 250 mm， 5 m）；流動(dòng)相乙腈:水（體積比 60:40）；流速 1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng) 205 nm；柱溫 40 ；進(jìn)樣量 20.0 L17。 1.4 室內(nèi)藥效測(cè)試 1.4.1 抑菌譜測(cè)定試驗(yàn) 采用菌絲生長(zhǎng)速率法18,19對(duì)橘綠木霉 Trichoderma citrinoviride 菌株 TR673 在液體發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的一種次級(jí)代謝物 哌珀霉素抑制病原真菌的活性進(jìn)行測(cè)定。精確稱(chēng)取 2.173 g 的46%哌珀霉素粗提物樣品，加入 2 mL 的 N,N-二甲基甲酰胺（分析純，國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司）溶解后，用水稀釋定容至 100 mL，配制成 10000 mg/L 的哌珀霉素母液備用。將母液加水梯度稀釋成哌珀霉素含量為 500、 50、 5 mg/L 的藥液。取 1 mL 配制好的藥液和 9 mL 培養(yǎng)基加入到直徑為 9 cm 的滅菌培養(yǎng)皿中，混合均勻制成含量為 50、 5、 0.5 mg/L 哌珀霉素的 PSA（馬鈴薯 200 g、蔗糖 20 g、瓊脂粉 15 g，加水至 1000 mL，自然 pH）平皿。以含 2% N,N-二甲基甲酰胺的水溶液作為對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù) 3 次。將病原菌在 PDA 上培養(yǎng) 96 h（ 25 ），用無(wú)菌打孔器在菌落邊緣取直徑為 5 mm 的菌塊，放置到含哌珀霉素的 PSA（馬鈴薯 200 g、蔗糖 20 g、瓊脂粉 15 g，加水至 1000 mL，自然 pH）平皿和空白平皿的中央， 25 條件下培養(yǎng)，至對(duì)照處理的菌落生長(zhǎng)到接近平皿邊緣時(shí)，采用十字交叉法量取病原菌的直徑，計(jì)算各處理對(duì)菌落的生長(zhǎng)抑制率。生長(zhǎng)抑制率（ %）（對(duì)照菌落直徑藥劑處理菌落直徑） /（對(duì)照菌落直徑菌餅直徑）× 100。 1.4.2 室內(nèi)活性測(cè)定試驗(yàn) 采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定哌珀霉素對(duì)膠孢炭疽菌 C. gloeosporioides 的抑制情況進(jìn)行測(cè)定。按照 1.4.1 方法，配制哌珀霉素含量為 125.0、 62.50、 31.250、 15.625、 7.813、 3.906、 1.953、0.976 mg/L的含藥 PSA平板。 以 50%多菌靈可濕性粉劑為對(duì)照藥劑， 稱(chēng)取 2 g 50%多菌靈 WP溶于 2 mL 0.1 mol/L的鹽酸溶液，后加水稀釋定容至 100 mL，配置成 10 g/L 的多菌靈母液，按照配制哌珀霉素的含藥平板的配制方法，配制多菌靈含量分別為 250.0、 125.0、 62.50、 31.250、 15.625、 7.813、 3.906、 1.953 mg/L 的含藥 PSA 平板。以 2 mmol/L 的鹽酸溶液為對(duì)照，計(jì)算抑菌率。 1.4.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 將抑菌率轉(zhuǎn)換成抑菌機(jī)率值（ Y），殺菌劑質(zhì)量濃度轉(zhuǎn)換成對(duì)數(shù)值（ X），按濃度對(duì)數(shù)與機(jī)率值回歸法求得不同殺菌劑對(duì)供試菌株的毒力回歸方程 Y aX b。數(shù)據(jù)的整理應(yīng)用 Excel 軟件，毒力回歸方程、相關(guān)系數(shù) r， EC50和 EC90由 DPS 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)分析獲得，同時(shí)計(jì)算出相對(duì)毒力指數(shù)。 TB/A）× 100， T 為相對(duì)毒力指數(shù)， A 為試驗(yàn)藥劑的 EC50或 EC90， B 為標(biāo)準(zhǔn)藥劑的 EC50或 EC90。 1.5 田間藥效試驗(yàn) 2015 和 2016 年在上海市金山區(qū)草莓研究中心和上海市青浦區(qū)白鶴草莓研究所，分別進(jìn)行了 12%哌珀霉素 WP 防治草莓炭疽病的田間藥效試驗(yàn)20。所有試驗(yàn)均選用對(duì)炭疽病高度敏感的草莓品種紅顏進(jìn)行。試驗(yàn)共設(shè) 5 個(gè)處理， 分別為 12%哌珀霉素 WP 225、 450、 900 g/hm2、 50%多菌靈 WP 900 g/hm2和清水對(duì)照 （ CK） ，每個(gè)小區(qū) 20 m2， 4 個(gè)重復(fù)隨機(jī)排列。第一次施藥時(shí)間在炭疽病的發(fā)病初期，每隔 10 d 施用 1 次，連續(xù)施用 3 次。用噴霧器將藥液均勻噴灑在草莓苗上，藥液使用量為 750 kg/hm2，對(duì)照處理區(qū)噴等量的清水。調(diào)查方法參照農(nóng)藥田間藥效試驗(yàn)準(zhǔn)則（一）（ GB T 17980.19-2000），在最后一次施藥 14 d 后，對(duì)草莓炭疽病的發(fā)病情況進(jìn)行調(diào)查，每個(gè)小區(qū)隨機(jī)取 5 個(gè)點(diǎn)，每點(diǎn) 5 株，每株取 20 片葉片進(jìn)行病情指數(shù)統(tǒng)計(jì)。炭疽病的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為 0 級(jí)：無(wú)病斑； 1 級(jí)：病斑面積占整個(gè)葉面積的 5%以下； 3 級(jí)：病斑面積占整個(gè)葉面積的 6% 10%； 5 級(jí)：病斑面積占整個(gè)葉面積的 11% 25%； 7 級(jí)：病斑面積占整個(gè)葉面積的 26% 50%； 9級(jí)：病斑面積占整個(gè)葉面積的 51%以上。病情指數(shù)（各級(jí)發(fā)病數(shù)×相對(duì)級(jí)數(shù)值） /（調(diào)查總數(shù)× 9）×100；防治效果（ %）（空白對(duì)照病情指數(shù)藥劑處理病情指數(shù)） /空白對(duì)照病情指數(shù)× 100。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用鄧肯氏新復(fù)極差法（ DMRT）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 1.6 12%哌珀霉素 WP 安全性試驗(yàn) 以推薦的田間使用最高劑量 900 g/hm2為安全性測(cè)定的最低劑量，按 1、 2、 4 倍的劑量梯度，即 12%哌珀霉素 WP 900、 1800 和 3600 g/hm2以及清水處理（ CK），共計(jì) 4 個(gè)處理，對(duì)照處理區(qū)噴等量的清水。每個(gè)小區(qū) 20 m2， 4 個(gè)重復(fù)隨機(jī)排列。選擇長(zhǎng)勢(shì)均勻的紅顏、章姬、寧玉 3 個(gè)品種草莓，進(jìn)行安全性試驗(yàn)測(cè)定。 2016 年 2 月 19 日進(jìn)行整株噴霧處理。試驗(yàn)方法參照農(nóng)藥對(duì)作物安全性評(píng)價(jià)準(zhǔn)則21。用藥后306 中 國(guó) 生 物 防 治 學(xué) 報(bào) 第 34 卷 7、 14 和 21 d，按照目測(cè)觀察法和生長(zhǎng)速率檢測(cè)法（ 5）分別進(jìn)行 12%哌珀霉素 WP 對(duì)草莓生長(zhǎng)情況影響的調(diào)查。 （ 1）目測(cè)觀察法。藥害分級(jí)方法：“ ”表示無(wú)藥害；“”表示輕度藥害，不影響植株正常生長(zhǎng)；“”表示明顯藥害但可復(fù)原，不會(huì)造成植株明顯矮化、黃化或畸形；“”表示高度藥害，影響植株正常生長(zhǎng)，造成不可恢復(fù)的矮化、黃化或畸形等；“”表示嚴(yán)重藥害、植株死亡。 （ 2）生長(zhǎng)速率檢測(cè)法。方法參考農(nóng)藥對(duì)作物安全性評(píng)價(jià)準(zhǔn)則22。生長(zhǎng)速率 R L/D，統(tǒng)計(jì)分析每個(gè)重復(fù)隨機(jī)調(diào)查 10 株草莓秧苗株高，用鄧肯氏方差分析對(duì)平均數(shù)的差異顯著性進(jìn)行分析。 2 結(jié)果與分析 2.1 室內(nèi)藥效測(cè)試結(jié)果 殺菌譜的測(cè)試結(jié)果表明，哌珀霉素在 50 mg/L 濃度下對(duì)腐霉、核盤(pán)菌、膠孢炭疽菌、茄鏈格孢菌、立枯絲核菌、大麗輪枝菌的病原菌的離體抑菌率均在 50%以上。哌珀霉素對(duì)膠孢炭疽菌的抑菌活性高于對(duì)其他的病原菌，在濃度為 5 和 50 mg/L 時(shí)，對(duì)膠孢炭疽菌的離體抑制率分別為 71.8%和 95.2%（表 1）。 表 1 哌珀霉素殺菌譜測(cè)試結(jié)果 Table 1 The test results of petaibols antifungal spectrum 抑菌率 Antifungal rate (%) 測(cè)試靶標(biāo) Test targets 0.5 mg/L 5 mg/L 50 mg/L 腐霉 P. aphanidermatum 黃瓜猝倒病 14.4± 0.7 16.2± 0.7 75.4± 3.0 禾谷鐮孢 F. graminearum 小麥赤霉病 12.3± 0.8 17.4± 1.0 32.8± 1.9 灰葡萄孢 B. cinerea 葡萄灰霉病 11.5± 0.7 19.5± 1.2 47.3± 1.5 尖孢鐮刀菌 F. oxysporum 草莓根腐病 5.4± 0.9 12.7± 1.0 28.1± 1.3 尖孢鐮刀菌 F. oxysporum 西瓜枯萎病 8.9± 0.5 13.0± 1.7 33.5± 0.4 核盤(pán)菌 S. sclerotiorum 油菜菌核病 15.4± 1.1 28.7± 1.4 58.9± 1.0 膠孢炭疽菌 C. gloeosporioides 草莓炭疽病 30.4± 0.8 71.8± 1.3 95.2± 0.4 茄鏈格孢菌 A. solani 番茄早疫病 11.5± 1.2 23.3± 0.6 67.8± 0.8 立枯絲核菌 R. solani 辣椒立枯病 28.5± 0.9 56.7± 1.2 81.4± 0.8 大麗輪枝菌 V. dahliae 棉花黃萎病 16.7± 0.3 32.2± 2.2 65.5± 1.1 灰葡萄孢 B. cinerea 草莓灰霉病 9.2± 0.8 14.0± 0.8 42.4± 0.3 2.2 室內(nèi)活性測(cè)試 哌珀霉素抑制草莓炭疽病原菌絲生長(zhǎng)的毒力回歸方程為 Y 4.815 1.090X，相關(guān)系數(shù) r 0.993， EC50和 EC90分別為 1.480 和 22.194 mg/L。多菌靈的毒力回歸方程為 Y 3.632 1.270X，相關(guān)系數(shù) r 0.984，EC50和 EC90分別為 11.943 和 121.899 mg/L。哌珀霉素對(duì)多菌靈的相對(duì)毒力指數(shù) T50和 T90分別為 8.072 和5.493。由此可見(jiàn)，哌珀霉素比多菌靈對(duì)膠孢炭疽菌的抑菌活性高（表 2）。 表 2 12%哌珀霉素 WP 對(duì)草莓炭疽病的抑菌活性 Table 2 Inhibitive effect of peptaibols on strawberry anthracnose 處理 Treaments 回歸方程 Regression equations 相關(guān)系數(shù) Correlation coefficientEC50(mg/L) 95%置信限 Confident limits EC90(mg/L) 95%置信限 Confident limits 12%哌珀霉素 peptaibols WP Y 4.815 1.090X 0.993 1.480 1.258 1.740 22.194 17.297 28.478 50%多菌靈 carbendazim WP Y 3.632 1.270X 0.984 11.943 9.554 16.123 121.899 110.92 168.221 2.3 田間小區(qū)試驗(yàn)結(jié)果 2015 年和 2016 年 2 年的田間藥效試驗(yàn)結(jié)果（表 3）顯示， 12%哌珀霉素 WP 對(duì)草莓炭疽病的防效隨著施藥量的增加而提高。當(dāng)施藥量增加到 450 和 900 g/hm2時(shí)，兩個(gè)處理對(duì)草莓炭疽病的防效無(wú)顯著差異，但均顯著高于 12%哌珀霉素 WP 225 g/hm2和 50%多菌靈 WP 的化學(xué)對(duì)照處理 （除 2015 年金山區(qū)） （ P 0.05） 。 第 2 期 王承芳等：哌珀霉素防治草莓炭疽病的研究 307 表 3 12%哌珀霉素 WP 對(duì)草莓炭疽病的防治效果 Table 3 12% Peptaibols WP against strawberry anthracnose in the field 防治效果 Control efficacy (%) 上海市青浦區(qū) Qingpu area of Shanghai City 上海市金山區(qū) Jinshan area of Shanghai City處理 Treaments 劑量 Amount (g/hm2) 2015 2016 2015 2016 225 52.00± 1.80 Bb 46.09± 1.10 Bb 47.92± 8.04 ABb 55.86± 5.34 BCb 450 66.33± 4.68 Aa 61.57± 1.34 Aa 68.45± 8.41 Aa 74.60± 7.58 Aa 12%哌珀霉素 peptaibols WP 900 71.67± 2.09 Aa 64.28± 1.35 Aa 59.23± 9.89 ABab 66.04± 2.58 ABa 50%多菌靈 carbendazim WP 900 53.67± 2.37 Bb 42.19± 1.89 Bb 43.45± 3.98 Bb 49.20± 5.34 Cb 注：同列數(shù)據(jù)后不同大寫(xiě)字母表示極顯著性差異（ P 0.01） ，不同小寫(xiě)字母表示差異顯著（ P 0.05） 。 Note: Data in the same column followed by the different capital letters indicated significantly difference at 0.01 level, the different lowercase letters indicated significantly difference at 0.05 level. ABA：空白對(duì)照 Control； B： 12%哌珀霉素 Peptaibols WP 圖 1 12%哌珀霉素 WP 防治草莓炭疽病田間試驗(yàn) Fig. 1 Field tests of controlling strawberry anthracnose with 12% peptaibols WP 2.4 安全性試驗(yàn) 2.4.1 目測(cè)觀察結(jié)果 用濃度為 900、 1800 和 3600 g/hm2的 12%哌珀霉素 WP，對(duì) 3 個(gè)品種（紅顏、章姬和寧玉）的草莓進(jìn)行噴灑。施藥 7 和 14 d 后， 3 個(gè)品種的草莓均未出現(xiàn)明顯的藥害癥狀。以田間推薦的最高使用劑量（ 900 g/hm2） 4 倍的用藥量，對(duì)草莓進(jìn)行施藥仍是安全的（表 4）。 2.4.2 生長(zhǎng)速率測(cè)定結(jié)果 試驗(yàn)結(jié)果表明， 12%哌珀霉素 WP 在 900、 1800、 3600 g/hm2濃度條件下，章姬、紅顏、寧玉 3 個(gè)品種的草莓生長(zhǎng)速率無(wú)顯著差異，也無(wú)藥害癥狀出現(xiàn)（表 5）。 3 討論 隨著草莓種植面積不斷擴(kuò)大以及易感病品種的重茬種植，草莓炭疽病正在逐年加重，給草莓生產(chǎn)造成了嚴(yán)重影響2,3,23。目前生產(chǎn)上主要采用苯并咪唑類(lèi)、甲氧基丙烯酸醋（ QoIs）類(lèi)和當(dāng)醇脫甲基抑制劑類(lèi)（ DMIs）殺菌劑對(duì)草莓炭疽病進(jìn)行防治24。由于這些殺菌劑均具有高度的選擇性，作用位點(diǎn)單一，特別是在連續(xù)高劑量藥劑的壓力下，使草莓膠孢炭疽菌的抗藥性日益加重3,4,23,24。韓國(guó)興等3發(fā)現(xiàn)草莓炭疽病菌對(duì)多菌靈和乙霉威的抗藥性頻率分別為 92.1%和 93.7%。林婷24的研究發(fā)現(xiàn)，草莓炭疽病菌對(duì)甲基硫菌靈的抗藥性頻率高達(dá) 98.53%。然而，哌珀霉素主要是通過(guò)影響和破壞細(xì)胞質(zhì)膜，進(jìn)而抑制或殺死病原菌，其作用機(jī)理獨(dú)特11,24。病原菌要對(duì)哌珀霉素產(chǎn)生抗藥性，首先必須改變它們細(xì)胞膜的組成和結(jié)構(gòu)25。因此，作為一種極具應(yīng)用潛力的生物農(nóng)藥，進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)哌珀霉素，不但能減少化學(xué)農(nóng)藥的使用量，還能降低病原菌對(duì)使用藥品的抗藥性頻率。 308 中 國(guó) 生 物 防 治 學(xué) 報(bào) 第 34 卷 表 4 對(duì) 12%哌珀霉素 WP 在草莓上使用的目測(cè)安全性評(píng)價(jià)結(jié)果 Table 4 Safety evaluation of 12% peptaibols WP on strawberries through visual measurement 藥害分級(jí) Phytotoxicity evaluation 種 Strawberry varieties 處理 Treatments 制劑用量 Amount (g/hm2) 7 d 14 d 安全性評(píng)價(jià) Safety evaluation 900 安全 1800 安全 12%哌珀霉素 peptaibols WP 3600 安全 紅顏 清水對(duì)照 安全 900 安全 1800 安全 12%哌珀霉素 peptaibols WP 3600 安全 章姬 清水對(duì)照 安全 900 安全 1800 安全 12%哌珀霉素 peptaibols WP 3600 安全 寧玉 清水對(duì)照 安全 表 5 對(duì) 12%哌珀霉素 WP 在草莓上使用的生長(zhǎng)速率安全性評(píng)價(jià)結(jié)果 Table 5 The safety evaluation of 12% peptaibols WP on strawberries determined by the growth rate 生長(zhǎng)速率 The growth rate（ mm/d） 品種 Strawberry varieties 處理 Treatments 用量 Amount 7 d 14 d 21 d 900 7.37± 0.07 Aa 5.54± 0 Aa 5.08± 0.02 Aa 1800 7.40± 0.08 Aa 5.56± 0.07 Aa 5.08± 0.03 Aa 12%哌珀霉素 peptaibols WP 3600 7.33± 0.08 Aa 5.52± 0.03 Aa 5.06± 0.03 Aa 紅顏 清水對(duì)照 7.36± 0.08 Aa 5.54± 0.04 Aa 5.07± 0.03 Aa 900 7.33± 0.27 Aa 5.52± 0.21 Aa 5.06± 0.09 Aa 1800 7.33± 0.12 Aa 5.52± 0.06 Aa 5.10± 0.04 Aa 12%哌珀霉素 peptaibols WP 3600 7.30± 0.14 Aa 5.51± 0.07 Aa 5.05± 0.05 Aa 章姬 清水對(duì)照 7.30± 0.07 Aa 5.51± 0.04 Aa 5.05± 0.02 Aa 900 6.73± 0.12 Aa 5.22± 0.06 Aa 4.86± 0.04 Aa 1800 6.79± 0.08 Aa 5.25± 0.04 Aa 4.88± 0.03 Aa 12%哌珀霉素 peptaibols WP 3600 6.76± 0.14 Aa 5.24± 0.07 Aa 4.87± 0.05 Aa 寧玉 清水對(duì)照 6.78± 0.08 Aa 5.25± 0.04 Aa 4.88± 0.03 Aa 注：相同品種同列數(shù)據(jù)后不同大寫(xiě)字母表示極顯著性差異（ P 0.01） ，不同小寫(xiě)字母表示差異顯著（ P 0.05） 。 Note: Data in the same column followed by the different uppercase letters indicated significantly difference at 0.01 level, the different lowercase letters indicated significantly difference at 0.05 level. 本研究的室內(nèi)活性測(cè)試結(jié)果顯示，哌珀霉素（ EC9022.194 mg/L）對(duì)草莓炭疽病的抑菌活性顯著優(yōu)于化學(xué)農(nóng)藥多菌靈（ EC90 121.899 mg/L）。大田藥效試驗(yàn)結(jié)果顯示， 12%哌珀霉素 WP 對(duì)草莓炭疽病的防治效果比預(yù)期的低（使用劑量 900 g/hm2，防治效果 59% 71%）。究其原因，可能與哌珀霉素的理化性質(zhì)以及所使用的劑型有關(guān)。在常溫下，哌珀霉素粗提物為油狀固體，不溶于水。通常情況下，同一種原藥加在不同劑型中，其藥效可能差異很大，因?yàn)槌行С煞种獾摹胺怯行С煞帧睍?huì)對(duì)其活性功效的釋放產(chǎn)生較大的影響27。有些原藥在有機(jī)溶劑中的溶解度大，適合加工成乳油劑或水乳劑，而在有機(jī)溶劑中溶解度低的原藥，則適合加工成可濕性粉劑或懸浮劑27。張金花等28的研究發(fā)現(xiàn)疏水性烯酰嗎啉，其水乳劑對(duì)黃瓜霜霉病田間藥效試驗(yàn)結(jié)果明顯優(yōu)于可濕性粉劑。因此，用 12%哌珀霉素 WP 作為防治草莓炭疽病的一種產(chǎn)品劑型，也許不能充分發(fā)揮哌珀霉素的抑菌活性功效。將進(jìn)一步深入研究哌珀霉素抑菌活性的作用機(jī)理，同第 2 期 王承芳等：哌珀霉素防治草莓炭疽病的研究 309 時(shí)優(yōu)化哌珀霉素的劑型配方，提高哌珀霉素在田間病害防治的效果，為產(chǎn)品的應(yīng)用與推廣，以及產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)打好基礎(chǔ)。 參 考 文 獻(xiàn) 1 向發(fā)云 , 韓永超 , 曾祥國(guó) , 等 . 湖北省草莓育苗期炭疽病病害調(diào)查 J. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) , 2012, 51(24): 5650-653 2 陳官菊 , 厲曉臘 , 金軼偉 , 等 . 草莓炭疽病的發(fā)生危害和藥劑防治 J. 浙江農(nóng)業(yè)科學(xué) , 2010(6): 1344-1346. 3 韓國(guó)興 , 禮茜 , 孫飛洲 , 等 . 杭州地區(qū)草莓炭疽病病原鑒定及其對(duì)多菌靈和乙霉威的抗藥性 J. 浙江農(nóng)業(yè)科學(xué) , 2009(6): 1169-1172 4 韓永超 , 曾祥國(guó) , 向發(fā)云 , 等 . 湖北省草莓炭疽病菌對(duì)咪鮮胺的敏感性 J. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào) , 2014, 16(5): 535-540 5 楊敬輝 , 陳宏州 , 肖婷 , 等 . 草莓炭疽病病原鑒定及其對(duì) 12 種殺菌劑的毒力測(cè)定 J. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào) , 2015, 28(6): 2527-2531 6 楊合同 , 唐文華 , Ryde M. 木霉菌與植物病害的生物防治 J. 山東科學(xué) , 1999, 12(4): 7-16. 7 陳凱 , 楊合同 , 李紀(jì)順 , 等 . 木霉菌產(chǎn)生的聚酮類(lèi)抗生性代謝產(chǎn)物 J. 中國(guó)生物防治學(xué)報(bào) , 2009, 25(2): 171-175。 8 陳捷 , 朱潔偉 , 張婷 . 木霉菌生物防治作用機(jī)理與應(yīng)用研究進(jìn)展 J. 中國(guó)生物防治學(xué)報(bào) , 2011, 27(2): 145-151. 9 宋曉妍 , 張玉忠 , 王元秀 . 木霉 peptaibols 抗菌肽的研究進(jìn)展 J. 微生物學(xué)報(bào) . 2011, 51(4): 438-444. 10 潘順 . 哈茨木霉菌發(fā)酵液中 peptaibols 類(lèi)抗菌肽的分離純化、鑒定及活性研究 D. 杭州 : 中國(guó)計(jì)量學(xué)院 , 2013. 11 宋曉妍 , 陳秀蘭 , 孫彩云 , 等 . 哌珀霉素類(lèi)抗菌肽 : 一類(lèi)特殊的肽類(lèi)抗生素 J. 生命的化學(xué) , 2005, 25(3): 184-186. 12 Daniel J F, Filho E R. 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