34(6)937-944 中國(guó)生物防治學(xué)報(bào) Chinese Journal of Biological Control 2018 年 12 月 收稿日期： 2018-05-05 基金項(xiàng)目：河北省青年拔尖人才支持計(jì)劃（ 201619） ；河北省高等學(xué)校青年拔尖人才研究計(jì)劃（ BJ201608） 作者簡(jiǎn)介：郭繼平，博士，副教授， E-mail： guojiping888163.com； *通信作者，博士，副教授， E-mail： maaohan163.com。 DOI: 10.16409/j.cnki.2095-039x.2018.06.019 噴施菌劑后葡萄葉片真菌多樣性的 PCR-DGGE分析 郭繼平1，馬 光1*，張志強(qiáng)1，蘇長(zhǎng)青1，齊善厚2（ 1. 衡水學(xué)院生命科學(xué)系，衡水 053000； 2. 衡水學(xué)院校醫(yī)院，衡水 053000） 摘要： 為探討葡萄葉片噴施磚紅微桿菌 Y24 菌劑和解淀粉芽胞桿菌 N22 菌劑后其表面真菌多樣性的變化，本研究采用 PCR-DGGE 技術(shù)， 以樣品的基因組 DNA 為模板， 擴(kuò)增出大小約為 400 bp 的真菌 18S rDNA 高變區(qū)， DGGE 電泳后進(jìn)行圖譜分析，并對(duì)標(biāo)記條帶進(jìn)行切膠、回收、克隆和測(cè)序以研究真菌多樣性相關(guān)的特征數(shù)和菌群組成。 DGGE 圖譜分析表明，噴施磚紅微桿菌 Y24 菌劑的葉片樣品的豐富度指數(shù) S 最高，香農(nóng) -維納指數(shù) H最大，噴施解淀粉芽胞桿菌 N22 菌劑后的這兩個(gè)指標(biāo)與對(duì)照相比無(wú)明顯變化。對(duì) DGGE 圖譜上標(biāo)記出的 25 個(gè)條帶進(jìn)行測(cè)序比對(duì)，發(fā)現(xiàn)葡萄葉片上的真菌主要為非可培養(yǎng)鏈格孢（ Uncultured Alternaria alternata） 、枯葉格孢腔菌 Pleospora herbarum、近平滑假絲酵母 Candida parapsilosis 和非可培養(yǎng)真核生物等。噴施磚紅微桿菌 Y24 菌劑的特有的真菌類群包括非可培養(yǎng)真菌、隱球菌屬 Cryptococcus sp.和非可培養(yǎng)真核生物。葡萄葉片噴施磚紅微桿菌 Y24 菌劑后附生真菌種類變得更豐富，噴施解淀粉芽胞桿菌 N22 菌劑后與對(duì)照無(wú)顯著差別。 關(guān) 鍵 詞： 葡萄；細(xì)菌菌劑；真菌；多樣性； PCR-DGGE 中圖分類號(hào)： S432.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 1005-9261(2018)06-0937-08 Analysis of Fungal Diversity on Grape Leaves after Spraying Bacterial Agents by PCR-DGGE GUO Jiping1, MA Guang1*, ZHANG Zhiqiang1, SU Changqing1, QI Shanhou2(1. Department of Life Science, Hengshui University, Hebei 053000, China; 2. Hengshui University Hospital, Hengshui 053000, China) Abstract: PCR-DGGE technology was used to explore the variation of fungal diversity on the surface of grape leaves after spraying Microbacterium testaceum Y24 and Bacillus amyloliquefaciens N22 agents. The 18S rDNA high variation area of the fungus with the size of 400 bp was amplified with the sample genome DNA as the template. After DGGE, the map and the marker strips were analyzed. The bands were cut, reclaimed, cloned and sequenced to determine the characteristic value and composition of fungal diversity. The DGGE map analysis showed that the species richness, Shannon Wiener index of the leaf samples spraying Y24 was the highest, and the two indexes of samples spraying N22 was not significantly changed compared with those of the control. The sequence alignment of 25 bands marked on the DGGE map showed that the fungi on the grape leaves were mainly unculturable Alternaria alternata, Pleospora herbarum, Candida parapsilosis and unculturable eukaryotes. The specific fungal groups of leaf spraying Y24 were unculturable fungi, Cryptococcus sp. and unculturable eukaryotes. The fungal diversity on leaves treated with Y24 was more abundant than the control and N22 agent, and there was no difference between N22 and control. Key words: grape leaves; bacteria agent; fungi; diversity; PCR-DGGE 植物與周圍環(huán)境生物的相互作用在自然界中普遍存在，其中以植物與微生物的互作為重要形式之 938 中 國(guó) 生 物 防 治 學(xué) 報(bào) 第 34 卷 一1。植物葉片上生存著大量不同性質(zhì)的微生物，如細(xì)菌、真菌、酵母菌等，其中真菌是與植物密切相關(guān)的微生物群體2。葉圍真菌種類和數(shù)量分布因地理緯度、氣候條件、植物種類和季節(jié)的不同而有明顯差異3。葉圍上的有益微生物和有害微生物種群同時(shí)存在于這個(gè)微環(huán)境中，它們與植物葉片共同生存，組成了獨(dú)特的微生物群落，形成植物微生物生態(tài)體系4。葉圍微生物通過(guò)不穩(wěn)固的、可逆的、非特異的“聯(lián)合”或“粘附”方式附著，與植物主要是以電子交換形式互作，對(duì)于植株的長(zhǎng)勢(shì)、抗性及產(chǎn)量具有重要意義5。 微生物群落分析技術(shù)是利用遺傳指紋技術(shù)，確定在特定環(huán)境中生存的微生物群落的結(jié)構(gòu)和多樣性，并監(jiān)測(cè)不同時(shí)間群落變化的一種技術(shù)。利用這些技術(shù)也可以進(jìn)行種屬鑒定。目前，微生物群落分析的幾種分子生物學(xué)方法中，末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（ T-RFLP）和變性梯度凝膠電泳（ PCR-DGGE）是最常用的兩種方法6-8。 葡萄不僅是人們非常喜愛的果品之一，而且還是重要的釀酒資源，其栽培面積更是遍布全球各地。葡萄霜霉病和白腐病是影響葡萄產(chǎn)量和品質(zhì)的主要病害。在這些病害的防治過(guò)程中，為解決常年使用化學(xué)農(nóng)藥帶來(lái)的病原菌抗藥性、環(huán)境污染及農(nóng)藥殘留等問(wèn)題，生物防治方法在葡萄病害防治中的應(yīng)用越來(lái)越多9-11。在葡萄霜霉病的生物防治中所用的菌劑有枯草芽胞桿菌 B-FS01 可濕性粉劑12、黃麻鏈霉菌 NF0919 發(fā)酵上清液、枯草芽胞桿菌 DJ-6 可濕性粉劑13和菌體含量為 1×107個(gè) /mL 的磚紅微桿菌發(fā)酵液14。葡萄白腐病的生物防治中所用的菌劑有解淀粉芽胞桿菌 BJ-6 發(fā)酵液10，淡紫灰鏈霉菌 G4 發(fā)酵液15，枯草芽胞桿菌PT2與廣譜拮抗菌 QM34 的混合培養(yǎng)發(fā)酵液16。說(shuō)明磚紅微桿菌和解淀粉芽胞桿菌在葡萄霜霉病及葡萄白腐病的生物防治中已有試驗(yàn)研究確定有效， 但是這些生防菌株用的都是發(fā)酵液， 所以對(duì)其生防菌劑的研究、生產(chǎn)和應(yīng)用也是將來(lái)的研究方向之一。 良好的生物防治菌劑不僅對(duì)病菌有良好的拮抗作用， 而且應(yīng)對(duì)植株的正常微生物種群影響較小。 因此，對(duì)使用菌劑前后的微生物多樣性進(jìn)行分析是衡量菌劑效果的重要組成部分。在前期的研究中，分別篩選到對(duì)葡萄霜霉病和白腐病具有良好防治效果的磚紅微桿菌和解淀粉芽胞桿菌14,17。本研究通過(guò) PCR-DGGE研究噴施磚紅微桿菌和解淀粉芽胞桿菌兩種菌劑前后的葡萄葉片表面真菌多樣性的變化情況，為探討這 2種菌劑的生物防治機(jī)理并指導(dǎo)其在葡萄生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論支持。 1 材料與方法 1.1 菌劑制備 磚紅微桿菌 Y24 菌劑：將活化好的磚紅微桿菌 Y24 接入 YEPD 液體培養(yǎng)基中， 28 、 150 r/min 振蕩培養(yǎng) 72 h，當(dāng)發(fā)酵液中的活芽胞含量為 20 億芽胞 /mL 時(shí)，加入 1%吐溫 80 和 0.5%山梨醇。解淀粉芽胞桿菌 N22 菌劑：將活化好的解淀粉芽胞桿菌 N22 接入 NA 液體培養(yǎng)基中， 28 、 150 r/min 振蕩培養(yǎng) 72 h，當(dāng)發(fā)酵液中的活芽胞含量為 20 億芽胞 /mL 時(shí)，加入 1%吐溫 80 和 0.5%山梨醇。 1.2 葡萄植株的菌劑噴施和取樣 菌劑噴施試驗(yàn)在衡水市趙圈鎮(zhèn)葡萄種植園進(jìn)行，供試葡萄品種為巨峰，樹齡為 5 年的葡萄樹，將磚紅微桿菌 Y24 和解淀粉芽胞桿菌 N22 菌劑分別稀釋 100 倍，在葡萄幼果膨大期至著色期噴灑在果粒和葉面上，在 5 月 30 日 16:00 以后向葡萄植株均勻噴灑（包括葡萄葉片正反面和果實(shí)），直到有小液流滴下為止。每處理噴施 20 株， 3 次重復(fù)，對(duì)照組不噴灑稀釋菌液，其他條件與試驗(yàn)組一致，每間隔 10 d 噴灑一次，共噴灑 4 次， 7 月 10 日每處理組隨機(jī)采摘 20 個(gè)葡萄葉片進(jìn)行測(cè)定。 1.3 基因組 DNA 的提取和純化 將葉片的反正面均用無(wú)菌水沖洗 10 次，收集沖洗后的水溶液， 12000 r/min 離心 10 min，棄上清收集菌體，再按 Fast DNATM SPIN Kit For Soil 試劑盒（美國(guó) MP Biomedicals）說(shuō)明提取總 DNA，并采用 DNA凝膠回收試劑盒（天根生化科技北京有限公司）對(duì)基因組 DNA 進(jìn)行純化。 1.4 真菌 18S rDNA 高變區(qū)的 PCR 擴(kuò)增 以樣品基因組 DNA 為模板，采用真菌通用引物 GC-FR1 和 FF390 擴(kuò)增樣品 18S rDNA 高變區(qū)序列。利用引物 FF390（ 5-CGATAACGAACGAGACCT-3）和 GC-FR1（ 5-CGCCCGGGGCGCGCCCCGGG GCGGGGCGGGGGCGCGGGGGAICCATTCAATCGGTAI T-3）進(jìn) 行 PCR 擴(kuò)增，體系（ 25 L）為 ： 10× Ex 第 6 期 郭繼平等：噴施菌劑后葡萄葉片真菌多樣性的 PCR-DGGE 分析 939 Taq buffer 2.5 L； dNTP（ 2.5 mmol/L） 2 L； Ex Taq Polymerase（ 5 U/L） 0.25 L； GC-FR1（ 10 mmol/L）1 L； FF390（ 10 mmol/L） 1 L；模板 DNA 50 ng；補(bǔ) ddH2O 至 25 L。 PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?94 預(yù)變性5 min； 94 變性 30 min， 50 復(fù)性 30 s， 72 延伸 1 min， 35 個(gè)循環(huán)；最終 72 延伸 10 min。 PCR產(chǎn)物采用 OMEGA 公司 DNA Gel Extraction Kit 純化回收。 1.5 PCR 產(chǎn)物的變性梯度凝膠電泳分析 制備變形梯度為 20% 40%、濃度為 8%的聚丙烯酰胺凝膠，取 10 L PCR 產(chǎn)物進(jìn)行變形梯度凝膠電泳（ DGGE）分析，在 1× TAE 緩沖液中 150 V、 60 下電泳 7 h。變形梯度凝膠電泳（ DGGE）完畢后、采用銀染法染色，使用紫外凝膠系統(tǒng)拍照，并用 Quantity One 4.6.9 軟件分析結(jié)果。 1.6 DGGE 圖譜中優(yōu)勢(shì)條帶的回收與測(cè)序 用滅菌的手術(shù)刀切下待回收 DGGE 條帶，采用 OMEGA 公司 Poly-Gel DNA Extraction Kit 回收目的條帶。 以 2 L 回收產(chǎn)物為模板， FR1/FF390 為引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。 PCR 擴(kuò)增體系 （ 50 L） 為： 10× PCR buffer 5 L； dNTP（ 2.5 mmol/L） 3.2 L； rTaq（ 5 U/L） 0.4 L； FR1（ 10 mmol/L） 1 L； FF390（ 10 mmol/L）1 L；模板 DNA 1 L；補(bǔ) ddH2O 至 50 L。 PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?94 預(yù)變性 5 min； 94 變性 30 min，50 復(fù)性 30 s， 72 延伸 1 min， 35 個(gè)循環(huán)；最終 72 延伸 10 min。將重新擴(kuò)增的 DNA 片段切膠回收、純化后，連接到 pMD18-T 載體上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 DH5 感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽(yáng)性克隆，進(jìn)行序列測(cè)定。 1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 1.7.1 DGGE 圖譜分析 圖像用 Quantity One 4.6.2 進(jìn)行分析，并且根據(jù)輸出的電子圖譜進(jìn)行分析，在對(duì)不同樣品進(jìn)行基因型的差異分析，其中包括豐富度（ S）、香濃性-維納指數(shù) H、均勻度（ E） 3 個(gè)指標(biāo)，其計(jì)算公式如下： H =siPiP1lni； Eh H/Hmax H/lnS。 其中 Pi 是某一個(gè)樣品中（即每個(gè)泳道）屬于第 i 種的個(gè)體比例，如樣品總個(gè)數(shù)為 N，則第 i 種個(gè)體數(shù)為ni，那么 Pi ni/N； S 是某一個(gè)樣品中（即每個(gè)泳道）所有條帶的和。 1.7.2 DGGE 圖譜回收條帶的測(cè)序及分析 測(cè)得的序列在 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行相似性比較。將測(cè)序結(jié)果和代表性菌株的 rRNA 部分序列用程序 ClustalX 2.0.11 進(jìn)行序列比對(duì)測(cè)序， 采用 UPGMA 算法在軟件 Mega 6.06構(gòu)建進(jìn)化樹，分析親緣關(guān)系及相似性，對(duì)各樣品中真菌多樣性等指標(biāo)進(jìn)行分析。 2 結(jié)果與分析 2.1 真菌 18S rDNA 高變區(qū)的擴(kuò)增 以基因組 DNA 為模板，采用引物 GC-FR1 和 FF390 擴(kuò)增出的目的片段大小均約為 400 bp，條帶亮、特異（圖 1）。條帶經(jīng)過(guò) DNA 瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化回收后滿足 DGGE 電泳的條件。 2.2 處理組和對(duì)照組真菌的 DGGE 圖譜分析 對(duì)處理組和對(duì)照組的 18S rDNA 片段 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行變性梯度凝膠電泳，用凝膠成像分析系統(tǒng)和 Quantity one 分析軟件對(duì) DGGE 膠圖進(jìn)行條帶識(shí)別和圖譜分析。結(jié)果如圖 2 所示，噴施磚紅微桿菌Y24 菌劑的處理平均有 27 條條帶，噴施解淀粉芽胞桿菌 N22 菌劑的處理平均有 19 條條帶，對(duì)照平均有 16 條條帶。噴施磚紅微桿菌 Y24 菌劑與對(duì)照共有的條帶數(shù)是 4 條， 噴施解淀粉芽胞桿菌 N22 菌劑與對(duì)照共有的條帶數(shù)是 9 條。噴施磚紅微桿菌Y24 菌劑的處理特有的條帶是 11 條，噴施解淀粉芽胞桿菌 N22 菌劑的處理特有的條帶是 6 條。 與對(duì)照相比，噴施磚紅微桿菌 Y24 菌劑的電泳條帶更 圖 1 真菌 18S rDNA 高變區(qū)的擴(kuò)增 Fig. 1 Amplification of fungal 18S rDNA regions 940 中 國(guó) 生 物 防 治 學(xué) 報(bào) 第 34 卷 多，說(shuō)明噴施該菌劑后改變了葉片局部的微生態(tài)環(huán)境，使真菌菌群的種類更加豐富。并且各個(gè)處理的條帶相對(duì)強(qiáng)度和遷移率也不完全相同，說(shuō)明他們中既存在一些共有的真菌種群，又存在一些特有真菌。 對(duì)噴施磚紅微桿菌 Y24 菌劑、解淀粉芽胞桿菌 N22 菌劑以及噴清水的對(duì)照 3 種處理的豐富度指數(shù)、香農(nóng) -維納指數(shù)和均勻度進(jìn)行計(jì)算，將計(jì)算結(jié)果進(jìn)行了方差分析和多重比較（表 1）。噴施解淀粉芽胞桿菌N22 菌劑的處理與對(duì)照的豐富度 S、香農(nóng)-維納指數(shù) H沒(méi)有顯著差異，但噴施磚紅微桿菌 Y24 菌劑的處理在這兩個(gè)指數(shù)方面與另外兩個(gè)處理均有顯著差異。 噴施磚紅微桿菌 Y24 菌劑的葉片樣品的豐富度指數(shù) S 最高，香農(nóng)-維納指數(shù) H最大，說(shuō)明該處理葉片的附生真菌種類最豐富。與對(duì)照相比，噴施解淀粉芽胞桿菌N22 菌劑后的真菌群落多樣性無(wú)明顯變化，也進(jìn)一步反映出該葉片的微環(huán)境沒(méi)有受到太大的影響。物種均勻度 E 也稱為物種相對(duì)多度，是某個(gè)地區(qū)內(nèi)各個(gè)物種在數(shù)量上的一致程度。從表 1 可看出， 3 種處理在均勻度 E 方面有顯著差異。說(shuō)明噴施菌劑后還是改變葡萄葉片的微生態(tài)區(qū)系，進(jìn)而改變了真菌物種在葡萄葉片上的種類和數(shù)量。 CK CK CK Y24 Y24 Y24 N22 N22 N22圖 2 對(duì)照和處理組真菌的 DGGE 圖譜 Fig. 2 DGGE mapping of fungal in control and treatment groups 表 1 不同樣品中真菌特征指數(shù)的多重比較 Table 1 Multiple comparison of fungal characteristic index in different samples 樣品 Sample 豐富度 Richness S 香農(nóng)-維納指數(shù) Flavor-Wiener index H ' 均勻度 Homogeneity E CK 15.67 b 2.71 b 0.98 a Y24 27.33 a 3.19 a 0.97 b N22 19.33 b 2.81 b 0.95 c 注：表中不同小寫字母表示 P 0.05 采用 Duncan 法進(jìn)行多重比較的結(jié)果 Note: Different lowercase letters in the table indicated the results of multiple comparisons of Duncan at 0.05 level. 第 6 期 郭繼平等：噴施菌劑后葡萄葉片真菌多樣性的 PCR-DGGE 分析 941 2.3 真菌 DGGE 條帶的克隆、測(cè)序和分析 分別選取圖 2 中具代表性的條帶， 總共對(duì) 25 條條帶進(jìn)行了克隆和測(cè)序， 將得到的所有序列與 GenBank及 RDP 數(shù)據(jù)庫(kù)中的已有序列進(jìn)行比對(duì)分析，獲得各個(gè)序列的同源性信息。由表 2 可知，有 4 條帶沒(méi)有測(cè)出結(jié)果， 21 條條帶都以測(cè)出結(jié)果并進(jìn)行了比對(duì)分析，其中最大相似度均在 98%以上。研究發(fā)現(xiàn)葡萄葉片表面的真菌主要為非可培養(yǎng)鏈格孢（ Uncultured Alternaria alternata）、枯葉格孢腔菌 Pleospora herbarum、近平滑假絲酵母 Candida parapsilosis 和非可培養(yǎng)真核生物（ Uncultured eukaryote）等。與對(duì)照和噴施解淀粉芽胞桿菌 N22 菌劑的葡萄葉片相比，噴施磚紅微桿菌 Y24 菌劑的葡萄葉片的真菌種類更為豐富，其中特有的微生物類群有非可培養(yǎng)真菌（ Uncultured fungus）、隱球菌屬 Cryptococcus sp.和非可培養(yǎng)真核生物（ Uncultured eukaryote）。 利用每個(gè)序列得到一個(gè)同源性最高的菌株，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。由圖 3 可以看出，所測(cè)序列聚為 3 個(gè)大分支。一個(gè)分支是進(jìn)化比較高等的非可培養(yǎng)銀耳綱（ Uncultured tremellomycete）的真菌；另一個(gè)分支是單細(xì)胞真菌中的近平滑假絲酵母， 第 3 個(gè)分支包括多孢子菌屬 Pleospora herbarum、 非可培養(yǎng)鏈格孢 （ Uncultured Alternaria alternata）、隱球菌屬和非可培養(yǎng)真核生物等。從系統(tǒng)發(fā)育樹可看出，聚在一個(gè)分支上的序列均是相近種屬， 該發(fā)育樹具有多個(gè)分支， 所以葡萄葉片噴施菌劑后表面的真菌多樣性仍然維持在較高的水平。 表 2 葡萄葉片真菌 DGGE 條帶測(cè)序結(jié)果 Table 2 Sequencing results of fungus DGGE bands in grape leaves 序列條帶編號(hào) No. of sequenced bands 比對(duì)結(jié)果 Blast results GeneBank 登錄號(hào) GeneBank access No. 相似度 Similarity 1 Uncultured fungus JX669452.1 99% 2 Pleospora herbarum AY741244.1 99% 3 Uncultured Alternaria alternata MF399530.1 98% 4 Pleospora herbarum AY741244. 99% 5 Uncultured eukaryote GU072347.1 99% 6 Uncultured Alternaria alternata MF399530.1 100% 7 Uncultured Alternaria alternata MF399530.1 99% 8 Uncultured Alternaria alternata MF399530.1 99% 9 Uncultured Alternaria alternata MF399530.1 99% 10 Pleospora herbarum AY741244. 99% 11 Uncultured fungus EF628535.1 98% 12 Cryptococcus sp. KM587000.1 100% 13 Uncultured Alternaria alternata MF399530.1 99% 14 Fungal sp. KT582240.1 99% 15 Uncultured Alternaria alternata MF399530.1 99% 19 Uncultured Alternaria alternata MF399530.1 99% 20 Uncultured tremellomycete AY934717.1 99% 22 Uncultured Alternaria alternata MF399530.1 99% 23 Candida parapsilosis AY426956. 98% 24 Uncultured eukaryote GU072347.1 99% 25 Uncultured Alternaria alternata MF399530.1 99% 2.4 聚類分析 利用 Quantity One 提供的 UPGMA 法，在 DGGE 圖譜的基礎(chǔ)上，繪出微生物群落的聚類分析圖。從圖 4 上可看出， 一共聚了 2 個(gè)大分支， 第一分支為 Y24 的 3 個(gè)樣品， 第 2 分支為 CK 和 N22 的各 3 個(gè)樣品。Y24 處理單獨(dú)在一個(gè)分支上， Y24 菌劑處理的葉片表面與對(duì)照及 N22 菌劑處理的葉片表面在真菌多樣性方 942 中 國(guó) 生 物 防 治 學(xué) 報(bào) 第 34 卷 Uncultured Alternaria alternata (MF399530.1)1362215925Fungal sp. (KT582240.1)3Pleospora herbarum (AY741244.1)4101Uncultured fungus (JX669452.1)Uncultured eukaryote (GU072347.1)12Cryptococcus sp.(KM587000.1)11Uncultured fungus (EF628535.1)23Candida parapsilosis(AY055857.1)20Uncultured tremellomycete (AY934717.1)214197852495231918498949100100100871004772937935539079530.2圖 3 葡萄葉片上真菌的系統(tǒng)發(fā)育分析 Fig. 3 Phylogenetic analysis of fungi on grape leaves 0.37 0.600.50 0.800.70 1.000.900.700.370.870.730.550.830.94Y24-3Y24-1Y24-2CK-1CK-3CK-2N22-3N22-2N22-1圖 4 處理和對(duì)照的聚類分析圖 Fig. 4 Cluster analysis of treatment and control 第 6 期 郭繼平等：噴施菌劑后葡萄葉片真菌多樣性的 PCR-DGGE 分析 943 面具有明顯差別。而噴施 N22 菌劑的處理和對(duì)照聚在一個(gè)分支上，所以菌劑 N22 的處理和對(duì)照在葉片表面真菌多樣性方面相似，這也和前面的 DGGE 圖譜的結(jié)果相對(duì)應(yīng)。 3 討論 20 世紀(jì) 40 年代以來(lái)，人們一直采用分離培養(yǎng)的方法來(lái)研究微生物多樣性，事實(shí)上，一些微生物經(jīng)常處于“活的非可培養(yǎng)狀態(tài)”18。通過(guò)實(shí)驗(yàn)室人工培養(yǎng)方法分離和描述的微生物物種數(shù)量?jī)H占估計(jì)數(shù)量的1% 5%，而其余 95% 99%的微生物類群仍未被分離和認(rèn)識(shí)19?，F(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的成熟，可以繞過(guò)純培養(yǎng)的手段來(lái)研究微生物的多樣性20，其中，變性梯度凝膠電泳（ DGGE）技術(shù)在微生物群落多樣性和種群動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)中得到廣泛應(yīng)用21。本研究中通過(guò) Genebank 比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn) 60%的條帶經(jīng)鑒定為非可培養(yǎng)真菌。張世偉等22對(duì)不同品種釀酒葡萄表皮微生物群落多樣性分析發(fā)現(xiàn)，得到的 21 個(gè)測(cè)序結(jié)果中，有 5 個(gè)是非可培養(yǎng)真菌，說(shuō)明非可培養(yǎng)真菌在葡萄植株上廣泛存在。在微生物群落多樣性的研究中，非培養(yǎng)法獲得的群落結(jié)構(gòu)更接近實(shí)際，其包含了可培養(yǎng)微生物和大量不可培養(yǎng)微生物的信息23，這也是將來(lái)要詳細(xì)探討的方向。 生物菌劑處理一定的材料后對(duì)菌群多樣性影響的研究有很多， 馬鋒敏等24研究了施用 4 種微生物菌劑對(duì)參后地土壤微生物群落代謝能力的影響，結(jié)果表明，哈茨木霉菌劑和益生元菌劑處理的微生物群落碳源利用率、 Shannon 指數(shù)、豐富度指數(shù)高于其他組和對(duì)照組。雷先德等25研究發(fā)現(xiàn)，常規(guī)化肥（ T1）處理的土壤微生物豐富度指數(shù)最低，香農(nóng) 威爾指數(shù)為 0.398，較 CK 0.498 有所下降，而施用微生物菌劑的各處理 （ T2 T5）為 0.547 0.983，土壤微生物多樣性指數(shù)明顯提高，以 T3 處理最好。劉長(zhǎng)莉等26采用 454 高通量技術(shù)檢測(cè)添加菌劑制作的堆肥樣品的菌群多樣性，發(fā)現(xiàn)添加菌劑制作的堆肥，其菌群多樣性更加豐富。韓美哲等27研究了蘇云金芽胞桿菌菌劑對(duì)棉花根際土壤細(xì)菌數(shù)量及多樣性的影響，發(fā)現(xiàn) Bt 菌劑對(duì)土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)無(wú)顯著影響，經(jīng)阿維菌素處理后棉花土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)整體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。在本研究中發(fā)現(xiàn)，葡萄葉片噴施磚紅微桿菌 Y24 菌劑后附生真菌種類變得更豐富，噴施解淀粉芽胞桿菌 N22 菌劑后與對(duì)照無(wú)顯著差別?？梢钥闯鑫⑸锞鷦┐蟛糠侄寄芴岣咛幚順悠返奈⑸锒鄻有?，但抗生素和一些化學(xué)農(nóng)藥及化肥的處理樣品后會(huì)降低微生物的多樣性，這也是我們國(guó)家目前大力提倡生物防治的原因所在。本研究可為在葡萄生產(chǎn)中真正應(yīng)用磚紅微桿菌和解淀粉芽胞桿菌生防菌劑提供前期的理論支持，實(shí)現(xiàn)增加綠色無(wú)公害產(chǎn)品份額和保護(hù)環(huán)境的雙贏。 參 考 文 獻(xiàn) 1 Stephanie B, Claire P C, Florence W D. 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