34(1)99-108 中國生物防治學(xué)報 Chinese Journal of Biological Control 2018 年 2 月 收稿日期： 2017-09-25 基金項目：公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（ 201303025） ；國家重點研發(fā)計劃（ 2017YFD0201100） ；河北省財政專項（ F17C10007） ；河北省人才培養(yǎng)工程 作者簡介：趙衛(wèi)松，博士，助研， E-mail： zhaoweisong1985163.com； *通信作者，李社增，碩士，研究員， E-mail： shezengli163.com；馬平，博士，研究員， E-mail： pingma88126.com。 DOI: 10.16409/j.cnki.2095-039x.2018.01.012 防治番茄灰霉病的枯草芽胞桿菌 BAB-1粉塵劑研制 趙衛(wèi)松，鹿秀云，郭慶港，王培培，商俊燕，年冠臻，張曉云，董麗紅，李社增*，馬 平*（河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護研究所 /河北省農(nóng)業(yè)有害生物綜合防治工程技術(shù)研究中心 /農(nóng)業(yè)部華北北部作物有害生物綜合治理重點實驗室， 保定 071000） 摘要： 目前我國農(nóng)藥登記的微生物殺菌劑主要為水劑和可濕性粉劑兩種劑型。為了克服常規(guī)噴霧導(dǎo)致溫室大棚內(nèi)濕度增加給防病帶來的不利影響，本文以枯草芽胞桿菌 BAB-1 為有效成分開展了粉塵劑研究，通過對載體和助劑的篩選，明確了最佳的載體、助劑種類及其比例，最終確定 100 億 CFU/g 枯草芽胞桿菌BAB-1 粉塵劑的配方為：滑石粉 20%、分散劑 GY-D900 2%、菌株 BAB-1 原藥補足至 100%。該制劑具有很好的懸浮效果（ 30 min 時懸浮率 50%） 。室內(nèi)盆栽試驗表明，菌株 BAB-1 粉塵劑對番茄灰霉病防效達到 57.14% 71.43%，對黃瓜灰霉病的保護作用優(yōu)于治療作用，施用 1 次的防病效果分別為 48.80%和1.65%；溫室大棚試驗結(jié)果表明，該制劑在番茄大棚中施用 3 次后對灰霉病的防效達到 79.04%，對照化學(xué)藥劑嘧菌酯 800 倍水溶液的防效為 82.55%。該研究結(jié)果為枯草芽胞桿菌 BAB-1 粉塵劑的進一步產(chǎn)業(yè)化開發(fā)和應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。 關(guān) 鍵 詞： 枯草芽胞桿菌；相容性；粉塵劑；番茄灰霉??；防治效果 中圖分類號： S476 文獻標識碼： A 文章編號： 1005-9261(2018)01-0099-10 A Preparation of Bacillus subtitles BAB-1 DPC against Tomato Gray Mold ZHAO Weisong, LU Xiuyun, GUO Qinggang, WANG Peipei, SHANG Junyan, NIAN Guanzhen, ZHANG Xiaoyun, DONG Lihong, LI Shezeng*, MA Ping*(IPM Center of Hebei Province/Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crops in Northern Region of North China, Ministry of Agriculture/Institute of Plant Protection, Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences, Baoding 071000, China) Abstract: In present, wettable powder and aqueous solutions is the main types of microbial fungicide formulations in pesticide registration of China. Humidity was increased by the conventional spray method in greenhouse, in order to overcome the adverse effects for the disease prevention and control, Bacillus subtitles BAB-1 was used as active ingredient to develop the dust powder concentrate (DPC). After carefully screening the suitable factors including carrier and additives, the optimal carrier, additive and their proportions were determined and employed for 1010 BAB-1 DPC formulation including talcum powder 20%, dispersing agent GY-D900 2%, up to 100% by BAB-1 technical material. This preparation of BAB-1 DPC had a excellent suspension rate more than 50% at 30 min. Pot experiment showed that the control efficacy of BAB-1 DPC was reached 57.14% to 71.43%, and the protective effect was superior to therapeutic action against tomato gray mold with control efficacy reached 48.80% and 1.65% after applying once, respectively. In greenhouse experiment, the control efficacy of BAB-1 DPC and chemical fungicide azoxystrobin 800-fold aqueous solution after applying 3 times were 79.04% and 82.55%, 100 中 國 生 物 防 治 學(xué) 報 第 34 卷 respectively. The research results provided a scientific basis for further industrial development and application of Bacillus subtitles BAB-1 DPC. Key words: Bacillus subtitles; compatibility; dust powder concentrate (DPC); tomato gray mold; control effect 灰霉病是由灰葡萄孢菌 Botrytis cinerea 引起的一類重要真菌病害1，在溫室大棚等保護地栽培蔬菜上危害尤為嚴重2,3。隨著保護地蔬菜種植面積的快速發(fā)展，經(jīng)濟價值較高的蔬菜如黃瓜、番茄等單一種植，灰霉病發(fā)生越來越重，常造成減產(chǎn) 20% 30%，甚至絕收4。該病害的防治歷來依賴于化學(xué)殺菌劑，但引起該病的病原菌寄主范圍廣、繁殖快且遺傳變異頻繁，極易對化學(xué)殺菌劑產(chǎn)生抗性，使得化學(xué)藥劑的防治效果不斷下降4-7，進一步造成農(nóng)民頻繁大劑量施用化學(xué)殺菌劑，導(dǎo)致防治成本不斷提高，同時導(dǎo)致高水平化學(xué)農(nóng)藥殘留。因此，研制開發(fā)高效環(huán)保的微生物殺菌劑成為植物保護工作者的研究熱點。 目前，微生物殺菌劑以其環(huán)境友好性和適應(yīng)性強在生防菌中得到越來越多的關(guān)注8,9。我國已成功開發(fā)并投入生產(chǎn)的以枯草芽胞桿菌為有效成分的制劑主要有萎菌凈、百抗、麥豐寧、紋曲寧等，涉及到的劑型包括可濕性粉劑、片劑、懸浮劑、粒劑10-16，其中主要以水劑和可濕性粉劑為主。據(jù)中國農(nóng)藥信息網(wǎng)統(tǒng)計，在防治番茄灰霉病上，我國登記的微生物殺菌劑主要成分包括枯草芽胞桿菌、木霉和熒光假單胞桿菌，登記制劑 13 個，其中 11 個制劑為可濕性粉劑， 2 個制劑為水分散粒劑，應(yīng)用方式均為噴霧使用。 已有許多文獻和生產(chǎn)實踐表明溫室大棚中作物灰霉病的發(fā)生與流行，直接與作物栽培環(huán)境的濕度密切相關(guān)17,18。化學(xué)殺菌劑和微生物殺菌劑，在作物灰霉病防治應(yīng)用中均采用噴霧處理，加大了溫室大棚中濕度，進一步加重了作物灰霉病的發(fā)生18-20。 枯草芽胞桿菌 BAB-1 是河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護研究所植物病害生物防治實驗室篩選到的對番茄灰霉病具有很好防治效果的菌株，已獲得中國發(fā)明專利授權(quán)（專利證號： ZL200710121275.0）。以該菌株為有效成分開發(fā)了 80 億 CFU/mL 枯草芽胞桿菌懸浮劑（登記證號： PD20150190）已在新沂中凱農(nóng)用化工有限公司實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。為了克服常規(guī)噴霧導(dǎo)致溫室內(nèi)濕度增加給番茄灰霉病防治帶來的不利影響，著重研究非噴霧應(yīng)用的制劑非常必要。然而目前有關(guān)粉塵劑的研制與應(yīng)用方面的報道較少。因此，本研究擬以菌株 BAB-1 為有效成分，開展用于溫室大棚中噴粉使用的粉塵劑研究，以期為枯草芽胞桿菌 BAB-1 粉塵劑的進一步開發(fā)和應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。 1 材料與方法 1.1 供試材料 枯草芽胞桿菌 Bacillus subtilis BAB-1 和番茄灰霉病菌 Botrytis cinerea，均由河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護研究所植物病害生物防治實驗室分離、鑒定和保存。其中菌株 BAB-1 于 2007 年保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為 CGMCC No. 2099。 LB 培養(yǎng)基用于枯草芽胞桿菌 BAB-1 的培養(yǎng)， PDA 培養(yǎng)基用于灰霉病菌的培養(yǎng)。載體及助劑：輕質(zhì)碳酸鈣、高嶺土、膨潤土、滑石粉均購自天津市奧湛醫(yī)科醫(yī)藥銷售有限公司，陶土購自上海源葉生物科技有限公司；助劑主要包括 MF、 GY-WS01、GY-D800、 GY-D06、 GY-D10、 GY-D900、 GY-DM02 均購自北京廣源益農(nóng)化學(xué)有限責(zé)任公司，木質(zhì)素磺酸鈉購自上海源葉生物科技有限公司，十二烷基苯磺酸鈉（ DBS）、十二烷基硫酸鈉（ SDS）均購自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司， GF/A 玻璃微纖維濾紙（ 10 cm× 10 cm， Whatman）。 1.2 枯草芽胞桿菌 BAB-1 原藥的制備 將枯草芽胞桿菌 BAB-1 在 LB 培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)進行活化，然后挑取單菌落在克氏瓶（ LB 培養(yǎng)基）中劃線接種， 35 培養(yǎng) 7 d 用作發(fā)酵種子。將準備好的發(fā)酵種子（ 4 瓶）克氏瓶培養(yǎng)的枯草芽胞桿菌BAB-1 菌苔用無菌刮鏟刮下，每瓶用 100 mL 無菌水配置成孢子懸浮液（濃度為 108 cfu/mL），接入 1 t 種子發(fā)酵罐， 31 培養(yǎng) 12 h 后作為種子液轉(zhuǎn)入 5 t 生產(chǎn)發(fā)酵罐， 31、 180 r/min 培養(yǎng) 48 h， 即得到菌株 BAB-1發(fā)酵液。在發(fā)酵液中添加 10%陶土（粒徑 26.67 m）進行噴霧干燥得到菌株 BAB-1 原藥。采用平板菌落計數(shù)法檢測菌株 BAB-1 原藥中活菌含量為 2× 1010CFU/g。 第 1 期 趙衛(wèi)松等：防治番茄灰霉病的枯草芽胞桿菌 BAB-1 粉塵劑研制 101 1.3 載體或助劑與枯草芽胞桿菌 BAB-1 的生物相容性 在試驗質(zhì)量濃度（ 1%、 2%、 3%和 4%）范圍內(nèi)，供試助劑與 LB 培養(yǎng)液混合時存在完全溶解、產(chǎn)生顏色和不溶解（產(chǎn)生沉淀） 3 種情況。（ 1）生長量測定法：針對助劑與 LB 培養(yǎng)液完全溶解的處理，采用生長量測定法評價助劑與枯草芽胞桿菌 BAB-1 的相容性。參考孫朝華等21方法，并略作修改。將保存的菌株 BAB-1 轉(zhuǎn)接到 LB 平板上活化，經(jīng)劃線分離培養(yǎng) 24 h 后，挑取單菌落接種于 LB 培養(yǎng)液中，在 30 、180 r/min 的搖床里培養(yǎng) 24 h，作為后續(xù)試驗的種子液。在 250 mL 三角瓶中，將 1%的種子液接種于含有上述質(zhì)量濃度助劑的 100 mL 培養(yǎng)液中，在 pH 7.0、 30 和 180 r/min 振蕩培養(yǎng) 24 h。利用酶標儀測定 OD600的吸收值來表示菌株 BAB-1 的生長量。每個濃度 3 次重復(fù)，以不添加助劑菌株 BAB-1 的生長量為對照。（ 2）毒性平板法：針對助劑與 LB 培養(yǎng)基產(chǎn)生沉淀或顏色的問題，采用平板培養(yǎng)法評價助劑與枯草芽胞桿菌 BAB-1 的相容性。參考李姝江等11方法，并略作修改。稱取一定質(zhì)量的供試助劑按照 1%、 2%、 3%、4%的質(zhì)量濃度分別加入到 LB 培養(yǎng)基中，制得固體平板，劃線接種菌株 BAB-1，培養(yǎng) 24 h 后考察其生長情況。每個濃度 3 次重復(fù)，以不添加助劑菌株 BAB-1 生長情況為對照。篩選出對菌株生長沒有影響的載體和助劑。 以沉降率為評價指標，將不同載體與 BAB-1 原藥混合對其懸浮效果進行評價，參考李寶聚等23評價方法，即噴粉 30 min 后沉降率 50%，認為在空氣中能夠達到很好的懸浮效果。通過將不同載體與菌株BAB-1 原藥混合后的沉降率進行測定，篩選最佳載體。根據(jù)載體與枯草芽胞桿菌 BAB-1 的生物相容性和粒徑測定結(jié)果， 將 3 種載體與 BAB-1 混合后分別記作配方 A（滑石粉+ BAB-1 原藥） 、 配方 B（皂土+ BAB-1原藥）和配方 C（陶土 BAB-1 原藥）。 1.4 枯草芽胞桿菌 BAB-1 粉塵劑的加工與配比優(yōu)化 將上述獲得的菌株 BAB-1 原藥、相容性好的載體、助劑分別經(jīng)氣流粉碎機（江陰新友機械制造有限公司）處理后，按照一定比例置于 SYH 三維混合機中（上海塵鑫粉體設(shè)備有限公司）混合均勻加工成不同的粉塵劑。 其配比如下 （按質(zhì)量百分比計， w/w） ： 載體 20%、 潤濕劑 0 2%、 分散劑 0 2%、 菌株 BAB-1原藥補足至 100%。利用平板菌落計數(shù)法測定其含菌量。 1.5 樣品加工后主要質(zhì)量指標檢測 1.5.1 粒徑測定 利用激光粒度分布儀（ BT-9300HT，丹東百特儀器有限公司）測定粒徑的大小。首先使用碳酸鈣標樣對儀器進行校正，選定背景值，然后將循環(huán)池用蒸餾水清洗干凈后加入待測樣品，遮光率調(diào)整到 10% 20%停止加樣，打開超聲波分散 3 min，使其充分混勻。記錄樣品在 D10、 D50、 D90、 D98時的粒徑大小，每個樣品 3 次重復(fù)。 1.5.2 沉降率測定 參考周勁松等22方法，并稍作修改。采用稱重法評價懸浮效果，將一定面積的玻璃微纖維濾紙平鋪于密閉空間地面，通過計算密閉空間地面濾紙上的沉降量，折算出總面積的沉降量，最終得到噴粉試驗后的沉降率。 1.6 枯草芽胞桿菌 BAB-1 粉塵劑對灰霉病的防治效果評價 1.6.1 室內(nèi)效果評價 通過離體葉片法和盆栽法開展枯草芽胞桿菌 BAB-1 粉塵劑對灰霉病防治效果研究。 離體葉片法：選擇大小、葉齡基本一致的健康番茄葉片，去除葉片表面灰塵，用蘸水的脫脂棉包裹住葉柄保濕，置于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中。在溫室放置干凈的紙板，將裝有葉片的培養(yǎng)皿置于其上，打開培養(yǎng)皿，開始噴粉作業(yè)，在噴粉完成后的 30、 60 和 120 min，蓋上培養(yǎng)皿，置于 25 恒溫培養(yǎng) 24 h，在所有葉片的葉背葉脈處接種活化培養(yǎng)的灰霉菌（ 5 mm）， 25 恒溫光照 /黑暗（ 16 h/8 h）培養(yǎng) 3 5 d 觀察發(fā)病情況。以未噴粉塵劑的葉片為對照，每個處理 4 次重復(fù)，每次重復(fù) 20 個葉片。測量橢圓形病斑的長直徑和短直徑，按照以下公式計算發(fā)病面積和防治效果。發(fā)病面積 ab/4，其中 a 和 b 分別為長直徑和短直徑；防治效果（ %）空白對照的發(fā)病面積處理的發(fā)病面積 /空白對照的發(fā)病面積× 100。 盆栽法：選擇子葉平展、整齊一致的黃瓜苗作為試驗材料。保護作用：先噴施粉塵劑后接種病原菌。選擇長出 2 3 片葉子的黃瓜苗置于溫室中進行噴粉作業(yè)，待枯草芽胞桿菌 BAB-1 粉塵劑沉降 24 h 后，置于人工氣候箱中 25 恒溫光照保濕培養(yǎng) 24 h，然后接種活化培養(yǎng)的灰霉菌（ 5 mm），重新置于 25 恒溫光照保濕培養(yǎng) 3 5 d，觀察發(fā)病情況。治療作用：先接種病原菌后噴施粉塵劑。在黃瓜苗子葉中央接102 中 國 生 物 防 治 學(xué) 報 第 34 卷 種活化培養(yǎng)的灰霉菌（ 5 mm），在 25 恒溫光照保濕培養(yǎng) 24 h 后，置于溫室中進行噴粉作業(yè)，沉降24 h，重新置于人工氣候箱中， 25 恒溫光照保濕培養(yǎng) 3 5 d，觀察發(fā)病情況。每個處理 4 次重復(fù)，每次重復(fù) 20 株黃瓜苗。以接種灰霉病菌不噴菌株 BAB-1 粉塵劑的處理為空白對照，待其充分發(fā)病后調(diào)查各處理發(fā)病情況，按照上述公式計算發(fā)病面積和防治效果。 1.6.2 田間效果評價 2017 年于河北省定興縣華農(nóng)蔬菜專業(yè)合作社（河北省定興縣賢宇鎮(zhèn)龍華村）開展試驗。番茄品種荷蘭 8 號，長勢整齊。試驗共設(shè) 3 個處理：枯草芽胞桿菌 BAB-1 粉塵劑，孢子濃度為 100億 CFU/g； 25%嘧菌酯懸浮劑（英國先正達有限公司）；清水對照。每個處理 4 次重復(fù)，共設(shè) 12 個小區(qū)，每個小區(qū)面積 48 m2，隨機區(qū)組排列。首次施藥為第二穗花開花期。病害發(fā)生之前開始第一次開始噴粉施藥，以后每隔 7 10 d 噴施一次，粉塵劑每次用量為 15 kg/hm2， 25%嘧菌酯懸浮劑使用濃度為 800 倍水稀釋液，共施藥 3 次。 發(fā)病調(diào)查指標包括，病株數(shù)（發(fā)病率）、發(fā)病果、發(fā)病側(cè)枝、發(fā)病葉片數(shù)、發(fā)病主莖、發(fā)病花數(shù)。病株率是指小區(qū)面積內(nèi)發(fā)病植株占總株數(shù)的百分比；發(fā)病點是指小區(qū)面積內(nèi)植株發(fā)病的不同部位，包括果、葉、側(cè)枝、主莖、花。發(fā)病點率是指小區(qū)面積內(nèi)發(fā)病部位占總株數(shù)的百分比。 1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 應(yīng)用 SPSS 17.0 軟件，采用鄧肯氏新復(fù)極差多重比較法對試驗數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析。應(yīng)用 Excel軟件和 Sigmaplot 12.0 軟件進行數(shù)據(jù)的整理與初步計算分析。 2 結(jié)果與分析 2.1 載體或助劑對枯草芽胞桿菌 BAB-1 生長的影響 研究了助劑 MF、 GY-D800、 GY-D06、 GY-D10、 GY-D900、 GY-DM02、 GY-WS01、木質(zhì)素磺酸鈉、十二烷基苯磺酸鈉（ DBS）、十二烷基硫酸鈉（ SDS），載體皂土、滑石粉、陶土與枯草芽胞桿菌 BAB-1的生物相容性。針對助劑 GY-D800、 GY-D06、 GY-D900 和 SDS，通過生物量比較結(jié)果表明（圖 1 A-D）， AGY-D06 (%)CK1234OD6000.00.20.40.60.8BSDS (%)CK 1 2 3 4OD6000.00.20.40.60.8CGY-D800 (%)CK1234OD6000.00.20.40.60.81.01.21.41.6DGY-D900 (%)CK1234OD6000.00.20.40.60.81.01.21.41.6aaaaa baaaaabcddabcdd圖 1 部分助劑在不同濃度下枯草芽胞桿菌 BAB-1 的生長量 Fig. 1 The growth of B. subtilis BAB-1 with the different concentrations of some additives 第 1 期 趙衛(wèi)松等：防治番茄灰霉病的枯草芽胞桿菌 BAB-1 粉塵劑研制 103 助劑 GY-D06 和 SDS 在試驗濃度范圍內(nèi)對菌株 BAB-1 的生長表現(xiàn)出很強的抑制作用（圖 1A、 B），而除了濃度 4%時，助劑 GY-D800 和 GY-D900 均對菌株 BAB-1 的生長呈現(xiàn)出促進作用。助劑 GY-D800 和GY-D900 在添加濃度分別為 2%和 1%時，生長量達到最大，之后隨著添加濃度的增加生長量呈下降趨勢（圖 1C、 D）。方差分析結(jié)果表明（ P 0.05），助劑 GY-D800 和 GY-D900 添加濃度為 1%和 2%時，菌株 BAB-1 的生長無顯著差異，而與對照差異顯著。 同時，進一步采用毒性平板法研究載體或助劑與枯草芽胞桿菌 BAB-1 的生物相容性。研究結(jié)果表明，載體或助劑與枯草芽胞桿菌 BAB-1 的相容性存在區(qū)別。在試驗濃度范圍內(nèi)（ 1% 4%， w/v），除載體陶土在高濃度（ 3%和 4%）對菌株 BAB-1 生長有抑制作用外，皂土、滑石粉與菌株 BAB-1 相容性好，菌株BAB-1 均能夠較好的生長。助劑與枯草芽胞桿菌 BAB-1 的相容性不同，助劑 MF、 GY-D10、 GY-D800、GY-D900 與菌株 BAB-1 相容性好；助劑 GY-D06、 GY-DM02、木質(zhì)素磺酸鈉在低濃度時（ 1%和 2%）與菌株 BAB-1 相容性好，隨著濃度的升高對菌株 BAB-1 的生長表現(xiàn)抑制作用；然而助劑 GY-WS01、 DBS、SDS 在試驗濃度 1% 4%時對菌株的生長均表現(xiàn)出抑制作用（圖 2、表 1）。 表 1 載體或助劑對枯草芽胞桿菌 BAB-1 的生物相容性評價 Table 1 Bio-compatibility evaluation between carriers or additives and B. subtilis BAB-1 相容性 Compatibility 相容性 Compatibility 助劑 Additives 1% 2% 3% 4% 載體或助劑 Carriers or additives 1% 2% 3% 4% MF 木質(zhì)素磺酸鈉 Sodium ligninsul fonate - - GY-WS01 - - - - 十二烷基苯磺酸鈉 DBS - - - - GY-D800 十二烷基硫酸鈉 SDS - - - - GY-D06 - - 皂土 Bentonite GY-D10 滑石粉 Talcum powder GY-D900 陶土 Figuline - - GY-DM02 - - 注： “”表示的是相容性好； “-”表示的是相容性差。 Note: “ ” represented good compatibility, “-” represented poor compatibility. 2.2 載體的篩選 研究結(jié)果表明，配方 A、配方 B 和配方 C 的沉降率分別為 42.69%、 70.20%和 48.34%，配方 B 的沉降率大于 50%，不符合粉塵劑的沉降要求，配方 A 優(yōu)于配方 C，無顯著差異，而與 B 有顯著差異。因此，選擇滑石粉作為枯草芽胞桿菌 BAB-1 粉塵劑制備的最佳載體（圖 3）。 2.3 分散劑的篩選 基于生長量測定法和毒性平板法篩選出與枯草芽胞桿菌 BAB-1 相容性好的 4 種分散劑 （ GY-D800、GY-D900、 GY-D10 和 MF）。按照分散劑 2%、滑石粉 20%、菌株 BAB-1 原藥補足至 100%，混勻，篩選制備菌株 BAB-1 粉塵劑的分散劑。試驗結(jié)果表明，含有分散劑 GY-D800、 GY-D900、 GY-D10和 MF 的粉塵劑的沉降率分別為 42.56%、 33.17%、 43.30%和 49.63%， 均小于 50%。 含有分散劑 GY-D800的粉塵劑沉降率與其他粉塵劑處理有顯著差異，而含有分散劑 GY-D800 與 GY-D10 的粉塵劑沉降率無顯著差異。因此，制備菌株 BAB-1 粉塵劑的最佳分散劑為 GY-D900，其次為 GY-D800 和 GY-D10（圖 4）。 2.4 不同樣品組分及其混合后的粒徑測定 關(guān)于粉塵劑粒徑的要求，參考李寶聚等23評價方法，粉碎細度要求 D90 53 m。載體陶土、滑石粉和皂土的 D90 粒徑分別為 21.86、 14.24 和 33.70 m，枯草芽胞桿菌 BAB-1 原粉的 D90 粒徑為 8.19 m。載體分別與枯草芽胞桿菌 BAB-1 混合后， D90 粒徑差異顯著，分別為 50.39、 31.68 和 67.14 m。載體滑石粉、分散劑 GY-D900 與枯草芽胞桿菌 BAB-1 混合后滿足粉塵劑的粒徑要求，以此組分開展粉塵劑的后續(xù)研究（表 2）。 104 中 國 生 物 防 治 學(xué) 報 第 34 卷 GY-DM02 GY-D900 十二烷基硫酸鈉 SDSGY-D800 GY-D06 MFGY-D10 GY-WS01 十二烷基苯磺酸鈉 DBS木質(zhì)素磺酸鈉Sodium ligninsul fonate皂土 Bentonite 滑石粉 Talcum powder陶土 Figuline注：每個圖中平板從上到下，從左到右分別代表的是載體或助劑在不同濃度（ CK、 1%、 2%、 3%和 4%）的 LB 平板上菌株的生長情況。 Note: The plates at each figure represent the growth of strain BAB-1 with carriers or additives in different concentrations (CK, 1%, 2%, 3% and 4%) from top to bottom, from left to right, respectively. 圖 2 載體或助劑與枯草芽胞桿菌 BAB-1 的生物相容性（毒性平板法） Fig. 2 The bio-compatibility between carriers or additives and B. subtilis BAB-1 by method of toxicity plate 2.5 枯草芽胞桿菌 BAB-1 粉塵劑的室內(nèi)防效評價 菌株 BAB-1 粉塵劑沉降 30、 60 和 120 min 時，葉片灰霉病的發(fā)病面積分別為 1.20、 0.60 和 0.40 cm2，對照發(fā)病面積為 1.40 cm2，防病效果分別為 14.29%、 57.14%和 71.43%。 枯草芽胞桿菌 BAB-1 粉塵劑對黃瓜灰霉病的保護效果和治療效果分別為 48.80%和 1.65%，保護作用優(yōu)于治療作用（表 3）。 第 1 期 趙衛(wèi)松等：防治番茄灰霉病的枯草芽胞桿菌 BAB-1 粉塵劑研制 105 配方 FormulaABC沉降率Sedimentation rate (%)020406080100aab圖 3 不同載體與枯草芽胞桿菌 BAB-1 混合的沉降效果 Fig. 3 Sedimentation effects of different carriers mixed with B. subtilis BAB-1 分散劑 DispersantsGY-D800 GY-D900 GY-D10 MF0102030405060ab bc圖 4 不同分散劑與枯草芽胞桿菌 BAB-1 混合后的沉降效果 Fig. 4 Sedimentation effects of different dispersants mixed with B. subtilis BAB-1 表 2 不同組分及其混合后的粒徑 Table 2 Particle size of different components and its mixture 粒徑 Particle size (m) 樣品名稱 Sample name D10 D50 D90 D98 陶土 Figuline 1.66± 0.35 8.34± 1.04 21.86± 1.49 30.35± 1.68 滑石粉 Talcum powder 1.24± 0.42 5.56± 0.52 14.24± 1.88 20.54± 1.57 皂土 Bentonite 1.65± 0.18 7.58± 1.76 33.70± 2.13 54.58± 3.44 GY-D900 43.80± 1.34 107.72± 4.98 244.84± 3.19 384.61± 3.86 BAB-1 原藥 BAB-1 technical material 0.69± 0.11 2.75± 0.34 8.19± 0.83 11.56± 2.17 陶土 GY-D900 BAB-1 原藥 Figuline GY-D900 BAB-1 technical material 7.66± 0.19 17.29± 0.71 50.39± 0.73 b 61.26± 0.87 滑石粉 GY-D900 BAB-1 原藥 Talcum powder GY-D900 BAB-1 technical material 1.67± 0.29 10.56± 0.43 31.68± 0.86 a 48.55± 0.35 皂土 GY-D900 BAB-1 原藥 Bentonite GY-D900 BAB-1 technical material 9.68± 0.95 19.24± 0.76 67.14± 0.49 c 83.43± 0.42 CK 30 min 60 min 120 min圖 5 枯草芽胞桿菌 BAB-1 粉塵劑對灰霉病防治效果 Fig. 5 Control effect on Botrytis cinerea by B. subtilis BAB-1 DPC 表 3 枯草芽胞桿菌 BAB-1 粉塵劑對灰霉病的保護和治療作用 Table 3 Protective and curative effect of B. subtilis BAB-1 DPC against B. cinerea 保護作用 Protective effect 治療作用 Curative effect 處理 Treatment 病情指數(shù) Disease index 防治效果 Control effect (%) 病情指數(shù) Disease index 防治效果 Control effect (%)枯草芽胞桿菌 BAB-1 粉塵劑 B. subtilis BAB-1 DPC 30.84± 3.26 48.80± 2.78 98.35± 1.47 1.65± 1.04 空白 CK 60.24± 2.15 - 100.00± 0.00 - 106 中 國 生 物 防 治 學(xué) 報 第 34 卷 2.6 枯草芽胞桿菌 BAB-1 粉塵劑的溫室大棚試驗 枯草芽胞桿菌 BAB-1 粉塵劑對番茄灰霉病具有很好的防治效果。 第 2 次施藥后 7 d 調(diào)查 （ 2017.01.10） ， 菌株 BAB-1 粉塵劑按照 15 kg/hm2施藥后的病株防效和發(fā)病防效均為 100%，對照藥劑 25%嘧菌酯懸浮劑800 倍水稀釋液的病株防效和發(fā)病防效分別為 66.29%和 82.61%，表明 BAB-1 粉塵劑使用濃度的防效高于對照藥劑，尤其是在對病株的防效方面。第 3 次施藥 7 d 后調(diào)查（ 2017.01.18）， BAB-1 粉塵劑的病株防效和發(fā)病點防效分別為 71.08%和 79.04%，對照藥劑 25%嘧菌酯懸浮劑 800 倍水稀釋液的病株防效和發(fā)病點防效分別為 75.93%和 82.55%。 不同調(diào)查時間 BAB-1粉塵劑和嘧菌酯處理的病株防效有顯著差異； BAB-1粉塵劑發(fā)病點防效之間存在顯著差異，呈現(xiàn)下降趨勢，而化學(xué)藥劑嘧菌酯的發(fā)病點防效無顯著差異。隨著用藥次數(shù)的增加和病害的發(fā)展，粉塵劑對灰霉病的防治效果有所下降，化學(xué)藥劑嘧菌酯仍表現(xiàn)出很好的防治效果（表 4）。 表 4 枯草芽胞桿菌 BAB-1 粉塵劑對番茄灰霉病的防治效果 Table 4 Control effects of B. subtilis BAB-1 DPC on B. cinerea 時間 Time 處理 Treatment 病株率 Diseased plant rate (%) 病株防效 Diseased plant control effect (%)發(fā)病點 Incidence rate (%) 發(fā)病點防效 Incidence of control effect (%)A 0.00± 0.00 100± 0.00 d 0± 0.00 100± 0.00 c B 2.08± 1.26 66.29± 3.17 a 2.08± 0.74 82.61± 4.92 b 2017.01.10 CK 6.17± 1.64 - 11.96± 2.37 - A 6.26± 1.18 71.08± 2.42 b 6.26± 1.24 79.04± 3.67 a B 5.21± 1.66 75.93± 4.83 c 5.21± 2.07 82.55± 6.73 b 2017.01.18 CK 21.64± 3.23 - 29.85± 2.86 - 注： A 表示的是枯草芽胞桿菌 BAB-1 粉塵劑， B 表示的是嘧菌酯 800 倍。 Note: A represented B. subtilis BAB-1 DPC, B represented azoxystrobin 800 folds. 3 討論 枯草芽胞桿菌以其環(huán)境適應(yīng)性和環(huán)境友好性在生防菌中得到越來越多的關(guān)注。微生物農(nóng)藥粉塵劑噴施后可以在空氣中產(chǎn)生更好的懸浮效果和更強的葉片附著性，從而可以對溫室作物病蟲害有更好的防治效果。 載體對制劑的潤濕性和懸浮率有主要影響12，而助劑不僅可以提高防效，延長貨架期，還能降低成本。已有研究表明，為了減弱載體和助劑對生防菌劑抑菌活性的影響，需要篩選與生防菌株具有較好相容性的載體和助劑。關(guān)于微生物與載體和助劑相容性的研究報道很多，錢一鑫等12通過對載體、分散劑、潤濕劑、穩(wěn)定劑、保護劑的篩選，確定了內(nèi)生解淀粉芽胞桿菌 X17 可濕性粉劑最佳配方。孫朝華等21研究發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素磺酸鈉對蘋果樹腐爛病生防菌解淀粉芽胞桿菌 TS-1203 的活性影響較小，可作為生防制劑開發(fā)的助劑。潘以樓等24研究了不同農(nóng)藥助劑對稻瘟病生防菌短短小芽胞桿菌 Bacillus pumilus TW-2 活性的影響，發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素磺酸鈉和篦麻油聚醚的影響最小。然而有關(guān)制備粉塵劑的載體和助劑的研究較少。本研究通過單因素試驗，確定了枯草芽胞桿菌 BAB-1 粉塵劑的最佳載體和分散劑及其比例，即配方為滑石粉 20%、分散劑 GY-D900 2%、原粉補足至 100%。研究結(jié)果與前人結(jié)論存在一定差異，其原因可能是不同劑型的特性決定和不同生防菌株生物學(xué)及生物化學(xué)特性不同。此外，本研究未篩選出與枯草芽胞桿菌 BAB-1 具有較好相容性的潤濕劑，應(yīng)進一步加強潤濕劑的篩選，增加藥劑對作物的附著性。同時，開展載體或助劑對芽孢形成的影響研究。 室內(nèi)生物活性測定結(jié)果及田間溫室大棚藥效試驗結(jié)果均顯示， 10