34(5)722-728 中國生物防治學(xué)報(bào) Chinese Journal of Biological Control 2018 年 10 月 收稿日期： 2018-03-23 基金項(xiàng)目：國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（ 2016YFD0201000 ） ；中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（ CAAS-ASTIP-IVFCAAS） ；農(nóng)業(yè)部園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目 作者簡介： *共同第一作者，謝學(xué)文，博士，助理研究員， E-mail： xiexuewencaas.cn；揣紅運(yùn)，碩士研究生， E-mail： 805724482qq.com； *通信作者，研究員， E-mail： libaojucaas.cn。 DOI: 10.16409/j.cnki.2095-039x.2018.05.011 甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 WF-3微粉劑的研制及 對黃瓜炭疽病的防治效果 謝學(xué)文1*，揣紅運(yùn)1*，董瑞利1，楊 杰2，石延霞1，柴阿麗1，李寶聚1*（ 1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081； 2. 西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院，拉薩 850000） 摘要： 以甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 WF-3 為研究對象，通過對載體、潤濕劑、分散劑、保護(hù)劑的篩選，確定了甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌微粉劑的最佳配方。其最佳配方為：白炭黑 10%，潤濕劑 K12 2%，分散劑 NNO 2%，保護(hù)劑 CMC 0.5%，煅燒高嶺土 85.5%。測定結(jié)果表明，甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 WF-3 微粉劑含菌量 2.07×1010 cfu/g，分散指數(shù) 83.31%，潤濕時(shí)間 11.4 s， pH 6.8，雜菌率 2.6%，含水率 0.98%，細(xì)度通過率 98%（ 8.13 m），熱貯分解率為 4.02%，產(chǎn)品各項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)。盆栽條件下，甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 WF-3微粉劑對黃瓜炭疽病的保護(hù)效果優(yōu)于治療效果，防效分別為 77.38%和 72.69%。 關(guān) 鍵 詞： 甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌；微粉劑；黃瓜炭疽??；防治效果 中圖分類號(hào)： S476 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ： A 文章編號(hào)： 1005-9261(2018)05-0722-07 Preparation of Micropowder of Bacillus methylotrophicus WF-3 and Its Control Effect on Cucumber Anthracnose XIE Xuewen1*, CHUAI Hongyun1*, DONG Ruili1, YANG Jie2, SHI Yanxia1, CHAI Ali1, LI Baoju1*(1. Institute of Vegetables and Flowers, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 2. Tibet Autonomous Regional Academy of Agricultural Sciences, Lasa 850000, China) Abstract: By screening the carriers, wetting agents, dispersing agents and protection agents for Bacillus methylotrophicus WF-3, the optimal formulation were confirmed as follows: the content of filler carbon-white and calcined kaolin, dispersing agent NNO, wetting agent K12 and UV protection agents CMC were 10.0, 85.5%, 2.0%, 2.0% and 0.5%, respectively. The quality detection showed that the spores content of B. methylotrophicus WF-3 micropowder could come up to 2.07× 1010cfu/g, the pH value was 6.8, the rate of heterozygous bacteria was 2.6%, the water content was 0.98%, the fineness rate was 98% ( 8.13 m), the spore dispersion index was 83.31%, dispersing time was 11.4 s, and thermal decomposition rate of storage was 4.02%, which came up to the formulation standard. Pot experiment demonstrated that the protective effects of B. methylotrophicus WF-3 micropowder on cucumber anthracnose was better than the therapeutic effect, and the efficacies were 77.38% and 72.69%, respectively. Key words: Bacillus methylotrophicus; micropowder; Colletrichum orbiculare; biocontrol effect 由半知菌亞門真菌， 葫蘆科刺盤孢菌 Colletotrichum orbiculare sp.引起的黃瓜炭疽病是一種重要的真菌病害，植株染病后，被害葉片干枯，導(dǎo)致成熟期果實(shí)開裂，完全喪失商品價(jià)值，常造成減產(chǎn) 10% 20%，第 5 期 謝學(xué)文等：甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 WF-3 微粉劑的研制及對黃瓜炭疽病的防治效果 723 對黃瓜種植產(chǎn)業(yè)影響較大1。隨著設(shè)施黃瓜的大量種植，棚室內(nèi)溫、濕度小氣候環(huán)境十分有利于黃瓜炭疽病病菌的侵染與為害，使得炭疽病逐漸發(fā)展成為設(shè)施黃瓜生產(chǎn)的主要病害之一。目前，黃瓜炭疽病仍以化學(xué)防治為主，常用的殺菌劑包括嘧菌酯、三環(huán)唑、苯醚甲環(huán)唑等2，但由于該病原菌繁殖速度快，遺傳變異大，突變菌田間適應(yīng)能力強(qiáng)等原因，對上述殺菌劑已產(chǎn)生了不同程度的抗藥性，使得化學(xué)藥劑的防治效果不斷下降，增加了黃瓜炭疽病的防治難度3-5。因此，研發(fā)一種高效、低毒、低殘留，不污染環(huán)境的生物殺菌劑成為近年來的研究熱點(diǎn)。 生防細(xì)菌能夠在其生長發(fā)育過程中產(chǎn)生多種拮抗性的代謝產(chǎn)物，直接或間接的達(dá)到阻礙或殺死病原菌的效果6。甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 Bacillus methylotrophicus 是 2010 年在水稻根系土壤中首次分離得到，已有大量實(shí)踐證明甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌對黃瓜炭疽病、枯萎病、番茄青枯病、灰霉病、煙草黑脛病、香蕉枯萎病及水稻稻瘟病具有較強(qiáng)的抑制作用7-9，但在實(shí)用劑型方面研究較少。 微粉劑是在粉劑基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新劑型，含有原藥、填料或載體、分散劑、潤濕劑以及其他輔助助劑，經(jīng)氣流粉碎加工技術(shù)，使微粉劑粒徑達(dá)到 10 m 以下的粉狀制劑。市場上的微粉劑主要有“ DL（ Drift Less）”粉劑和“ FD（ Flow Dust）”粉劑10：即日本在 1979 年首次注冊的一種農(nóng)藥新型微粉劑（ DL粉劑）和在溫室中使用的一種專門的微粉劑（ FD 粉劑）。微粉劑施藥不需兌水，不會(huì)增加棚室濕度，省工省時(shí)，安全環(huán)保，提高了農(nóng)藥利用率，且施藥過程中，無高溫引起的農(nóng)藥損失，可以實(shí)現(xiàn)生物農(nóng)藥微粉劑的常溫施用。與生物農(nóng)藥可濕性粉劑、懸浮劑、水分散粒劑等相比，微粉劑粒徑小，分散性強(qiáng)，加工工藝簡單，操作方便且藥劑噴出后通過靜電吸附作用沉積在葉片正背面，提高了對病害的防治效果。關(guān)于生物農(nóng)藥菌劑，目前明亮等11、楊春平等12、趙彥兵等13分別對水分散粒劑、可濕性粉劑、懸浮劑配方進(jìn)行了篩選， 尚無生物農(nóng)藥微粉劑配方篩選的相關(guān)報(bào)道， 更無甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌微粉劑配方篩選的相關(guān)研究。甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌微粉劑施用過程中不增加棚室濕度，可以擴(kuò)大其對病害的防治效果14。本課題組在前期的研究工作中，已從黃瓜根系土樣中分離得到一株對黃瓜炭疽病菌 C. orbiculare 具有較強(qiáng)拮抗活性的菌株 WF-3，并經(jīng)分子生物學(xué)和 16S rDNA 分析鑒定為甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 B. methylotrophicus15。本試驗(yàn)以甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 WF-3 為有效成分，通過對載體助劑的篩選，確定其微粉劑最佳配方，并測定其防治效果，為將其運(yùn)用于黃瓜炭疽病的防治提供依據(jù)。 1 材料與方法 1.1 供試材料 供試菌株： 甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 B. methylotrophicus WF-3 為本課題組從連作多年的黃瓜根際土樣中篩選得到16；黃瓜炭疽病菌 C. orbiculare（編號(hào)： HG10050502），經(jīng)鑒定該病原菌具有較強(qiáng)致病力，保存于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所。 供試藥劑： 25%咪鮮胺（ prochloraz）乳油，江蘇輝豐生物農(nóng)業(yè)股份有限公司。 供試載體：膨潤土（ Bentonite）、白炭黑（ Silica）、煅燒高嶺土（ Kaolin）、凹凸棒土（ Attapulgite）、滑石粉（ Talc）、硅藻土（ Diatomite），所有載體均由河北石家莊靈壽縣天昊礦產(chǎn)品加工廠提供。 供試助劑： 十二烷基硫酸鈉 （ Sodium dodecyl sulfate， K12） 、 烷基萘磺酸鹽 （ Alkyl naphthalene sulfonate，Morwet EFW）、異丙醛萘磺酸鈉（ Isopropyl aldehyde naphthalene sulfonate， Morwet IP）、酸性烷基硫酸鹽（ Acid alkyl sulfate， W2001）、磺酸鹽（ Sulfonate， W2002）、木質(zhì)素磺酸鹽（ Lignosulfonate， DM02）、烷基萘磺酸縮聚物 （ Alkylnaphthalene sulfonic acid polycondensate， Morwet D-425） 、 萘磺酸鹽類 （ Naphthalene sulfonate， D10）、聚羧酸鹽類（ Carboxylates， T36）、萘磺酸鈉鹽甲醛縮合物（ Formaldehyde condensates of sodium naphthalene sulfonate salt， NNO），所有助劑均由南京捷潤科技有限公司提供。 保護(hù)劑：抗壞血酸（ Vitamin C， VC）、熒光素鈉（ Fluorescein sodium）、羧甲基纖維素（ Carboxymethyl cellulose， CMC），所有保護(hù)劑均由南京捷潤科技有限公司提供。 1.2 甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 WF-3 發(fā)酵液的制備 種子液：將菌株 WF-3 活化后轉(zhuǎn)接到 pH 為 7.0 的 NB（葡萄糖 10 g、牛肉膏 5 g、蛋白胨 10 g、 NaCl 15 g、蒸餾水 1000 m L， pH 7.0 7.2）液體培養(yǎng)基中，裝液量為 125 mL/250 mL，置于 28 、 126 r/min 振蕩培 724 中 國 生 物 防 治 學(xué) 報(bào) 第 34 卷 養(yǎng) 24 h。 發(fā)酵液：取 5 mL 菌株 WF-3 種子液轉(zhuǎn)接到裝液量為 125 mL/250 mL NB 液體培養(yǎng)基中，置于 28 、126 r/min 振蕩培養(yǎng) 48 h，制成芽胞含量為 5× 1010cfu/mL 發(fā)酵液。 1.3 指標(biāo)測定 pH 測定參照 GB/T1601-1993 農(nóng)藥 pH 的測定方法進(jìn)行； 細(xì)度測定參照 （ GB/T 16150-1995） 用 BT-9300Z型激光粒度分布儀測定甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌微粉劑的粒徑大小；含水量測定參照（ GB/T 1600-1989）。 參照中華人民共和國農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn) NY/T2293.1-2012（ 5.3），采用平板菌落計(jì)數(shù)法，測定制劑的活菌總數(shù)（或芽胞含量），同時(shí)稱取 1 g 待測樣品用 10 mL 無菌蒸餾水制成 10 倍稀釋液，取 1.0 mL 稀釋液放入水浴鍋中 80 條件下水浴 15 min，之后冷卻至室溫，用無菌水梯度稀釋至 106倍，取 50 L 涂布于NA 固體培養(yǎng)基 （葡萄糖 10 g、 牛肉膏 5 g、 蛋白胨 10 g、 瓊脂粉 20 g、 NaCl 15 g、 蒸餾水 1000 mL， pH 7.07.2）上于 30 培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 36 h 左右，觀察菌落生長情況統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)并按照公式：芽胞含量（ cfu/g）100× 20×平均每皿菌落數(shù)×稀釋倍數(shù) /10，計(jì)算母粉中芽胞含量。 雜菌率測定參照中華人民共和國農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)（ NY/T2293.1-2012）按照芽胞含量測定方法進(jìn)行測定，選擇 NA 培養(yǎng)基檢測樣品中的細(xì)菌雜菌，選擇 PDA 培養(yǎng)基檢測樣品中的真菌雜菌，然后統(tǒng)計(jì)總的可見雜菌菌落數(shù)量并按照公式：雜菌率（ %）（細(xì)菌雜菌菌落數(shù)的總和真菌雜菌菌落數(shù)的總和） /（細(xì)菌雜菌菌落數(shù)的總和真菌雜菌菌落數(shù)的總和有效成分甲基營養(yǎng)性芽胞桿菌菌落數(shù)總和）× 100，計(jì) 算雜菌率。 熱貯穩(wěn)定性測定加速貯存實(shí)驗(yàn)（ GB/T 19136-2003）：將 5 g 微粉劑加入到潔凈的安瓿瓶中，用酒精噴燈進(jìn)行封口，封口后分別稱重。稱重后將封好的安瓿瓶置于 GH-500 型隔水式培養(yǎng)箱中，（ 54± 2）貯存， 14 d 后取出安瓿瓶，稱重測量，并對菌含量進(jìn)行測定。 載體分散性測定17：稱取定量混合均勻的樣品后過 500 目篩，鋪平到分散器底部，接通電源并開始計(jì)時(shí)， 30 s 后停止，稱取分散后殘余粉體質(zhì)量，按照公式分散指數(shù)（ %）（樣品量殘余樣品量） /樣品量× 100，試驗(yàn)重復(fù) 3 次。 浮游指數(shù)17：將混合均勻的樣品在散粉箱內(nèi)散粉 30 s 后，再將浮游在箱內(nèi)的粗微粒子捕集到盛水的集塵管內(nèi)，在波長 610 nm 處測定透光率，按照公式浮游指數(shù) 100透光率。 1.4 載體的篩選 分別稱取膨潤土、白炭黑、煅燒高嶺土等載體 1 kg，每種載體中加入 3 L 芽胞含量為 5× 1010cfu/mL發(fā)酵液進(jìn)行吸附，自然條件下晾干，制備好的各母粉室溫貯藏。 14 d 后通過測定各制劑的菌落數(shù)，分散指數(shù)，浮游指數(shù)，密度等因素，確定最佳載體。試驗(yàn)設(shè) 3 次重復(fù)。 1.5 助劑及復(fù)配助劑配比篩選 在制備好的母粉中，分別添加 4%的 K12、 Morwet EFW 等助劑，即制得不同的制劑。測定各制劑的潤濕時(shí)間，比較潤濕性能的好壞：潤濕時(shí)間越短，潤濕性越好。測定分散性，比較各種制劑的分散效果：分散指數(shù)越高，分散性越好，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果選取最優(yōu)分散劑和潤濕劑。試驗(yàn)設(shè) 3 次重復(fù)。 將從助劑中篩選出的分散劑與潤濕劑，分別按質(zhì)量比 1:9、 2:8、 3:7、 4:6、 5:5、 6:4、 7:3、 8:2、 9:1 比例經(jīng)研磨機(jī)混合均勻，測定分散指數(shù)和潤濕時(shí)間，篩選出一種最佳助劑復(fù)配組合。 1.6 保護(hù)劑的篩選 將菌株 WF-3（菌含量為 5× 1010cfu/mL）的發(fā)酵液與篩選出的載體、助劑按優(yōu)化后的配比吸附晾干，加入 0.5%的保護(hù)劑（熒光素鈉、抗壞血酸、羧甲基纖維素）經(jīng)研磨機(jī)混合均勻，稀釋后涂布在 NA 平板上，置于 28 W 紫外燈下，距離 10 cm 處，照射 60 min 后計(jì)算芽胞含量18，以不加保護(hù)劑作為對照，試驗(yàn)設(shè) 3次重復(fù)。 1.7 微粉劑的加工與測定 按照優(yōu)化篩選出的最佳配方配成甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 WF-3 制劑，經(jīng)氣流粉碎機(jī)（ GYF-100，昆山密友粉碎設(shè)備有限公司）超微粉碎后制成微粉劑。采用平板菌落計(jì)數(shù)法記錄菌落數(shù)，測定經(jīng)超微粉碎后的WF-3 微粉劑對芽胞活性的影響。 第 5 期 謝學(xué)文等：甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 WF-3 微粉劑的研制及對黃瓜炭疽病的防治效果 725 1.8 甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 WF-3 微粉劑室內(nèi)盆栽防效 2017 年 8 月在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所溫室進(jìn)行盆栽防效測定試驗(yàn)。使用精量電動(dòng)彌粉機(jī)19測定甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 WF-3 微粉劑對黃瓜炭疽病的防治效果。試驗(yàn)共設(shè) 4 個(gè)處理：甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 WF-3 微粉劑按施藥劑量為 45 kg/hm2噴粉；對照藥劑 25%咪鮮胺乳油按施藥劑量為 112.5 L/hm2噴霧；清水對照。在噴藥前，將噴粉處理的黃瓜苗放置到一個(gè)密閉的空間以防止微粉飄散，噴粉結(jié)束 4 h 后，將噴粉處理的黃瓜苗與噴霧處理的黃瓜苗放置一起，以保證整個(gè)環(huán)境條件一致。 將黃瓜炭疽病菌在 PDA 培養(yǎng)基（馬鈴薯 200 g、葡萄糖 20 g、瓊脂 20 g、蒸餾水 1000 mL）上培養(yǎng)22 d，用毛刷將孢子刷下，用血球計(jì)數(shù)板調(diào)配，獲得 1× 106孢子 /mL 懸浮液。待盆栽黃瓜苗長至 2 4 片真葉時(shí)進(jìn)行藥劑處理， 施藥 2 h 后待葉片表面晾干后采用葉面噴霧的方式接種 1× 106孢子 /mL 黃瓜炭疽病菌孢子懸浮液。接菌后將黃瓜苗放在相對濕度為 95%，溫度 25 30 保濕柜中保濕培養(yǎng) 24 h，之后轉(zhuǎn)入正常育苗溫室培養(yǎng)，每個(gè)處理 4 次重復(fù)，每次重復(fù) 10 株黃瓜苗。待清水對照充分發(fā)病后，參照 GB/T 17980.112-2004 進(jìn)行黃瓜炭疽病病情調(diào)查。 黃瓜炭疽病病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)： 0 級(jí)，無病； 1 級(jí)，病斑面積占整片葉面積的 5%以下； 3 級(jí)，病斑面積占整片葉面積的 6% 10%； 5 級(jí)，病斑面積占整片葉面積的 11% 25%； 7 級(jí)，病斑面積占整片葉面積的26% 50%； 9 級(jí)，病斑面積占整片葉面積的 50%以上。病情指數(shù) （各級(jí)病葉數(shù)×相對級(jí)數(shù)值） /（調(diào)查總?cè)~數(shù)× 9）× 100；防治效果（ %）（ CK PT） /CK× 100；發(fā)病率（ %）發(fā)病葉片數(shù) /調(diào)查總?cè)~片數(shù)× 100。式中 CK：空白對照區(qū)施藥后病情指數(shù)； PT：藥劑處理區(qū)施藥后病情指數(shù)20。 1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 SPSS 18.0 軟件分析處理， LSD 法做多重比較分析（ P 0.05）。 2 結(jié)果與分析 2.1 載體的篩選 載體在制劑中占據(jù)較大比例，因此載體對制劑的理化性質(zhì)影響很大。白炭黑制劑對甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 WF-3 芽胞活性影響較小且分散指數(shù)，浮游指數(shù)分別為 96.78%， 64.11；膨潤土、凹凸棒土和滑石粉制劑的芽胞含量較少， 分別為 0.88× 1010、 0.79× 1010和 0.94× 1010 cfu/g。 煅燒高嶺土芽胞含量為 2.12× 1010cfu/g，浮游指數(shù)為 53.22%，透光率為 45.67（表 1）。綜合考慮各制劑的分散性、漂浮性、密度及與菌株的生物相容性，確定最優(yōu)載體為白炭黑和煅燒高嶺土復(fù)配，白炭黑用量 10%，煅燒高嶺土用量補(bǔ)足至 100%。 表 1 載體對甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 WF-3 的影響 Table 1 Effects of filler on WF-3 處理 Treatment 分散指數(shù) Dispersion (%) 浮游指數(shù) Planktonic index (%) 透光率 Transmittance 芽胞含量 Spore content (× 1010cfu/g)凹凸棒土 Attapulgite 80.98± 0.88 c 28.55± 0.78 d 72.67± 0.30 a 0.79± 0.31 a 硅藻土 Diatomite 62.87± 1.10 d 41.88± 0.98 c 57.67± 0.31 b 2.63± 0.15 b 白炭黑 Silica 96.78± 0.48 a 64.11± 2.07 a 34.33± 0.33 d 2.07± 0.25 c 煅燒高嶺土 Kaolin 92.75± 0.31 b 53.22± 1.63 b 45.67± 0.88 c 2.12± 0.37 c 膨潤土 Bentonite 82.22± 0.30 c 31.88± 0.98 d 67.67± 0.32 e 0.88± 0.19 a 滑石粉 Talc 92.78± 1.14 b 35.67± 0.88 e 64.00± 1.53 e 0.94± 0.13 a 注：不同小寫英文字母表示在 0.05 水平上有顯著性差異，下同。 Note: Different small letters indicated significant difference at the 0.05 level. The same below. 2.2 助劑的篩選 由于大部分助劑具有雙重作用，因此本試驗(yàn)同時(shí)篩選樣品的潤濕劑和分散劑。不同助劑對樣品的潤濕性和分散性影響較大， K12、 W2001 的潤濕性較好，潤濕時(shí)間都在 10 s 以下，而它們的分散指數(shù)較低，在60%以下； DM02、 D10、 NNO 的分散指數(shù)較高，而它們的潤濕時(shí)間較長，都在 60 s 以上（表 2）。綜合考慮，選擇分散劑 NNO 與潤濕劑 K12 復(fù)配。 NNO 和 K12 隨著用量的變化而變化，當(dāng)分散劑與潤濕劑比726 中 國 生 物 防 治 學(xué) 報(bào) 第 34 卷 例為 5:5 時(shí)，分散指數(shù)為 81.61%，潤濕時(shí)間為 10 s，隨著助劑用量的增加，潤濕時(shí)間與分散指數(shù)在不斷增加，確定最佳配比為 5:5（表 3）。 2.3 保護(hù)劑的篩選 當(dāng)甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌應(yīng)用到田間時(shí)，陽光中的紫外線會(huì)削弱活菌體的防治效果，然而保護(hù)劑能將陽光中的大部分紫外線吸收掉，將吸收的能量轉(zhuǎn)化為無害的能量散發(fā)到空氣中21。當(dāng)紫外照射 60 min 后，選用羧甲基纖維素作保護(hù)劑，含菌量均高于抗壞血酸和熒光素鈉，為 1.27× 1010cfu/g，且分散指數(shù)，潤濕時(shí)間基本無變化（表 4）。 表 2 助劑對樣品潤濕時(shí)間和分散指數(shù)的影響 Table 2 Effect of additives on the wetting time and dispersion of the sample 處理 Treatment 潤濕時(shí)間 Wetting time (s) 分散指數(shù) Dispersion (%) 芽胞含量 Spore content (× 1010cfu/g)D10 65.00± 11.02 b 98.20± 0.31 a 1.38± 1.97 b DM02 68.20± 18.02 c 82.26± 0.88 b 1.69± 1.22 a K12 6.40± 5.13 i 54.08± 2.79 g 1.98± 0.48 a Morwet D-425 44.00± 13.66 a 76.56± 0.33 d 1.78± 0.66 a Morwet EFW 49.20± 3.27 f 49.48± 1.06 h 1.83± 0.39 a Morwet IP 17.00± 13.98 g 50.95± 0.85 h 1.98± 1.26 a NNO 71.60± 10.88 d 87.19± 0.30 c 2.17± 0.58 a T36 41.60± 22.36 a 77.60± 0.42 d 1.25± 1.38 b W2001 7.00± 6.78 h 58.81± 0.70 f 1.04± 1.39 c W2002 94.40± 8.82 e 66.89± 1.88 e 2.06± 0.48 a 表 3 助劑復(fù)配對樣品潤濕時(shí)間和分散指數(shù)的影響 Table 3 Effect of compound additives on the wetting time and dispersion of the sample 質(zhì)量比 Mass ratio NNO:K12 細(xì)度 Fineness ( 10m, %) 潤濕時(shí)間 Wetting time (s) 分散指數(shù) Dispersion (%) 芽胞含量 Spore content (× 1010cfu/g) 1:9 100 4.10± 1.23 c 69.17± 0.89 b 1.98± 0.35 a 2:8 100 5.60± 1.93 c 72.06± 1.35 e 2.03± 0.21 a 3:7 100 7.00± 2.00 b 76.02± 0.67 a 2.06± 0.56 a 4:6 100 9.20± 1.63 b 77.04± 1.22 a 2.12± 0.13 a 5:5 100 10.00± 2.00 b 81.61± 0.92 d 2.05± 0.41 a 6:4 100 12.80± 1.36 b 83.10± 0.61 c 1.97± 0.24 a 7:3 100 15.40± 2.70 a 84.63± 0.42 c 1.93± 0.13 a 8:2 100 16.00± 2.85 a 85.31± 0.26 c 1.92± 0.04 a 9:1 100 17.80± 1.66 a 85.61± 0.93 c 1.91± 0.2 a 表 4 保護(hù)劑對樣品的影響 Table 4 Effects of protective agent on the sample 照射 60 min 后 After 60 min of irradiation 處理 Treatment 照射前芽胞含量 Spore content (× 1010cfu/g) 潤濕時(shí)間 Wetting time (s) 分散指數(shù) Dispersion (%) 芽胞含量 Spore contend (× 1010cfu/g)抗壞血酸 Vitamin C 2.12± 0.13 a 22.00± 0.94 c 78.07± 1.21 b 0.68± 0.13 c 熒光素鈉 Fluorescein sodium 2.04± 0.41 a 15.60± 1.33 b 85.86± 1.67 a 0.98± 1.12 b 羧甲基纖維素 Carboxymethyl cellulose 2.10± 0.19 a 11.40± 1.02 a 83.31± 0.96 a 1.27± 0.45 a 對照 Control 1.94± 0.28 d 30.00± 2.00 d 81.61± 0.92 a 0.32± 0.19 d 2.4 微粉劑的加工與測定 WF-3 制劑經(jīng)氣流粉碎機(jī)超微粉碎制成微粉劑后，細(xì)度通過率為 98%（ 8.13 m），采用平板菌落計(jì)數(shù)法測定其菌落數(shù)為 2.07× 1010cfu/g，未經(jīng)粉碎的 WF-3 制劑平均菌落數(shù)為 2.10× 1010cfu/g，處理組和對照組相比無顯著性差異22，甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 WF-3 制劑經(jīng)超微粉碎后孢子生物活性不受影響。 第 5 期 謝學(xué)文等：甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 WF-3 微粉劑的研制及對黃瓜炭疽病的防治效果 727 2.5 性能測定 參照中華人民共和國農(nóng)藥粉劑及凌世海17農(nóng)藥劑型加工相關(guān)檢測方法進(jìn)行測定，結(jié)果顯示制備的甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 WF-3 微粉劑芽胞含量、 pH、雜菌率、粒徑、含水率、分散指數(shù)、潤濕時(shí)間、熱貯分解率均符合標(biāo)準(zhǔn)（表 5）。 表 5 甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 WF-3 微粉劑主要性能指標(biāo) Table 5 Main performance index of B. methylotrophicus WF-3 micropowder 性能指標(biāo) Performance 微粉劑標(biāo)準(zhǔn) Micropowder standard 測定結(jié)果 The measurement results 菌量 Amount of bacteria (cfu/g) - 2.07× 1010粒徑 Particle size (D98, m) 10 8.13 含水率 Water content (%) 1.5 0.98 分散指數(shù) Dispersion (%) 20 83.31 潤濕時(shí)間 Wetting time (s) 120 11.4 pH 5.5 7.0 6.8 雜菌率 Miscellaneous rate (%) 3 2.6 分解率 Decomposition rate (%) 5 4.02 2.6 甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 WF-3 微粉劑室內(nèi)盆栽防效 甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 WF-3 微粉劑（ 2.07× 1010cfu/g）按施藥劑量為 45 kg/hm2時(shí)，噴粉對黃瓜炭疽病的治療效果和保護(hù)效果分別為 72.69%和 77.38%；對照藥劑 25%咪鮮胺乳油按施藥劑量為 112.5 L/hm2時(shí)，噴霧對黃瓜炭疽病的治療效果和保護(hù)效果分別為 87.04%和 81.73%。 WF-3 微粉劑在室內(nèi)盆栽試驗(yàn)中對黃瓜炭疽病的保護(hù)效果和治療效果均超過 70%，且保護(hù)效果優(yōu)于治療效果（表 6）。 表 6 甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 WF-3 微粉劑對黃瓜炭疽病盆栽防治效果 Table 6 Control effect of B. methylotrophicus WF-3 micropowder against C. orbiculare in pot experiment 治療作用 Protective effect 保護(hù)作用 Curative effect 處理 Treatment 濃度 Concentration處理方式 Processing method 病情指數(shù) Disease index防治效果 Control efficacy (%)病情指數(shù) Disease index 防治效果 Control efficacy (%)甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 WF-3 微粉劑 B. methylotrophicus powder 2.0× 1010cfu/g 45 kg/hm2噴粉 14.24 72.69± 2.45 a 12.67 77.38± 1.54 a 25%咪鮮胺乳油 prochloraz EC 112.5 L/hm2噴霧 7.26 87.04± 3.12 b 11.16 81.73± 2.12 a 清水對照 Control - - 61.08 - 56.01 - 3 討論 早在 20 世紀(jì)，日本就開始研究農(nóng)藥微粉劑，微粉劑以其施藥不需兌水，不會(huì)增加棚室濕度的獨(dú)特優(yōu)勢，在生產(chǎn)上得到了廣泛的應(yīng)用23；甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 WF-3 作用方式直接，生物活性強(qiáng)，防治效果好，具有較強(qiáng)的促生長作用，且從 1995 年發(fā)現(xiàn)至今，尚未有對人畜有害的報(bào)道24，與其他芽胞桿菌相比，雖然都具有耐高溫、抗輻射等特點(diǎn)，但甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 WF-3 因其代謝產(chǎn)物的多樣性、對外界環(huán)境因子的多抗逆性和無污染無毒害等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于蔬菜病害防治。甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌微粉劑具有較強(qiáng)的空中懸浮效果和葉片附著性，從而對設(shè)施蔬菜病害有更好的防治效果。 生防菌的芽胞存活力是決定其最終防效的因素之一，選擇適合的載體和助劑是衡量生物農(nóng)藥微粉劑最佳配方的首要因素。本試驗(yàn)所研制的甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 WF-3 微粉劑芽胞含量為 2.07× 1010 cfu/g，符合芽胞桿菌粉劑含胞量行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（ NY/T2293.1-2012，含胞量指標(biāo) 1.0× 1010cfu/g）。張金鳳等25將白炭黑和高嶺土復(fù)配作為解淀粉芽胞桿菌 41B-1 可濕性粉劑的載體。劉振華等26在載體篩選中，將白炭黑和高嶺土復(fù)配作為最終多粘類芽胞桿菌可濕性粉劑的載體；助劑復(fù)配使用不僅能提高制劑的分散性，潤濕性，而且能夠增強(qiáng)其防治效果。李學(xué)紅等27采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌可濕性粉劑的助劑進(jìn)行篩728 中 國 生 物 防 治 學(xué) 報(bào) 第 34 卷 選，確定其最佳配方，且防治效果達(dá)到了 75%以上。然而有關(guān)制備生物農(nóng)藥微粉劑的載體和助劑的研究較少，本研究通過單因素試驗(yàn)，確定了甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 WF-3 微粉劑的最佳載體和助劑，即配方為白炭黑 10%、高嶺土 85.5%、十二烷基硫酸鈉（ K12） 2%、萘磺酸鈉鹽甲醛縮合物（ NNO） 2%，羧甲基纖維素（ CMC） 0.5%，研究結(jié)果與前人結(jié)論一致。 在室內(nèi)盆栽試驗(yàn)中，甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 WF-3 微粉劑對黃瓜炭疽病的保護(hù)作用優(yōu)于治療作用，防效分別為 77.38%和 72.69%，雖然略低于對照藥劑咪鮮胺的防效，但無顯著性差異，且長期采用化學(xué)農(nóng)藥防治，容易產(chǎn)生抗藥性，增加農(nóng)藥殘留量，污染環(huán)境；采用生物農(nóng)藥可濕性粉劑、懸浮劑、水分散粒劑噴霧防治，容易增加棚室濕度，促使病害發(fā)生，導(dǎo)致防治難度進(jìn)一步加大；采用甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌微粉劑噴粉防治不增加棚室濕度，不利于病害的發(fā)生與流行，不污染環(huán)境，對黃瓜炭疽病具有較好的防治效果。因此，甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 WF-3 微粉劑可作為防治黃瓜炭疽病的有效藥劑，這也表明甲基營養(yǎng)型芽胞桿菌 WF-3 微粉劑在黃瓜炭疽病防治方面具有較廣的應(yīng)用前景。 參 考 文 獻(xiàn) 1 李春藻 . 農(nóng)抗 120 防治黃瓜炭疽病和枯萎病 J. 中國生物防治 , 1990, 6(2): 63. 2 韓秀英 , 張小風(fēng) , 王文橋 , 等 . 不同殺菌劑對黃瓜炭疽病菌的抑制作用 C/中國植物病害化學(xué)防治學(xué)術(shù)研討會(huì) , 2006. 3 張舒亞 . 嘧菌酯對植物病原真菌的生物活性及抗藥性研究 D. 南京 : 南京農(nóng)業(yè)大學(xué) , 2002. 4 張傳清 , 周明國 . 間接作用化合物三環(huán)唑防治黃瓜炭疽病的作用機(jī)制 J. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) , 2009, 14(3): 49-53. 5 伏波 , 姚娟妮 , 高小寧 ,等 . 植物內(nèi)生枯草芽孢桿菌 Em7 菌株對葡萄灰霉病菌的抑菌活性 J. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報(bào) , 2016, 18(4): 465-471. 6 李長松 . 拮抗性細(xì)菌生物防治植物土傳病害的研究進(jìn)展 J. 中國生物防治學(xué)報(bào) , 1992, 8(4):168-172. 7 馮云利 , 奚家勤 , 馬莉 , 等 . 烤煙品種 NC297 內(nèi)生細(xì)菌中拮抗煙草黑脛病的生防菌篩選及種群組成分析 J. 云南大學(xué)學(xué)報(bào) (自然科學(xué)版 ), 2011, 33(4): 488-496. 8 黃霄 , 陳波 , 周登博 , 等 . 菌株 BM-24 的分離鑒定及對香蕉枯萎病菌的抑菌活性 J. 植物保護(hù)學(xué)報(bào) , 2013, 40(2): 121-127. 9 Shan H, Zhao M, Chen D, et al. 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