南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 學(xué) 報 2018,41(3):422-428 http:/nauxb.njau.edu.cnJ o u r n a l o f N a n j i n g A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y DOI:10.7685/jnau.201706044 收 稿 日 期 :2017-06-29 基 金 項 目 : 江 蘇 省 農(nóng) 業(yè) 科 技 自 主 創(chuàng) 新 項 目CX(15)1015; 江 蘇 省 科 技 支 撐 計 劃 項 目(BE2013429) 作 者 簡 介 : 董 慧 杰, 碩 士 研 究 生。 * 通 信 作 者: 胡 春 梅, 副 教 授, 研 究 方 向 為 蔬 菜 分 子 生 物 學(xué) 與 遺 傳 育 種,E-mail:jjjhcmnjau.edu.cn。 董 慧 杰, 韓 克, 侯 喜 林, 等.6 種 不 結(jié) 球 白 菜 材 料 葉 片 抗 氧 化 活 性 的 比 較 及 花 青 苷 合 成 相 關(guān) 基 因 的 表 達(dá) 分 析J. 南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 學(xué) 報,2018, 41(3):422-428. 6 種 不 結(jié) 球 白 菜 材 料 葉 片 抗 氧 化 活 性 的 比 較 及 花 青 苷 合 成 相 關(guān) 基 因 的 表 達(dá) 分 析 董 慧 杰, 韓 克, 侯 喜 林, 張 志 碩, 胡 春 梅 * ( 南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 園 藝 學(xué) 院/ 作 物 遺 傳 與 種 質(zhì) 創(chuàng) 新 國 家 重 點(diǎn) 實 驗 室, 江 蘇 南 京210095) 摘 要 : 目 的 本 文 旨 在 比 較 不 結(jié) 球 白 菜 不 同 材 料 間 葉 片 總 花 青 苷 含 量 及 其 抗 氧 化 活 性, 探 究 花 青 苷 合 成 相 關(guān) 基 因 的 表 達(dá) 特 性。 方 法 以6 種 不 結(jié) 球 白 菜 材 料 為 試 材, 采 用DPPH(1,1- 二 苯 基-2- 三 硝 基 苯 肼) 法 和 鐵 離 子 還 原 能 力(FRAP) 法 檢 測 了 葉 片 提 取 液 抗 氧 化 活 性, 并 測 定 了 花 青 苷 合 成 相 關(guān) 結(jié) 構(gòu) 基 因( B r c F 3 H、 B r c D F R、 B r c A N S、 B r c C H I、 B r c C H S、 B r c U F G T) 和 調(diào) 節(jié) 基 因( B r c T T 8、 B r c T T G 1、 B r c M Y B 7 5、 B r c M Y B 9 0、 B r c G L 3、 B r c E G L 3 . 1、 B r c E G L 3 . 2) 的 表 達(dá) 水 平。 結(jié) 果 在6 種 不 結(jié) 球 白 菜 材 料 中, 深 紫 色 材 料NJZX1-4 的 總 花 青 苷 含 量 最 高, 為(801.5±57.4)g·g -1 。 6 種 材 料 葉 片 提 取 液 的DPPH 自 由 基 清 除 率 為 (49.31±3.91)%(84.94±6.20)%, 鐵 離 子 還 原 能 力 為(256.8±136.3)(1279.5±202.0)g·g -1 , 其 中 紫 色 材 料NJZX1-1 葉 片 的DPPH 自 由 基 清 除 率 和 鐵 離 子 還 原 能 力 最 強(qiáng), 且 總 花 青 苷 含 量 與DPPH 自 由 基 清 除 率 和 鐵 離 子 還 原 能 力 均 存 在 極 顯 著 正 相 關(guān)。 結(jié) 構(gòu) 基 因 B r c F 3 H、 B r c D F R、 B r c A N S 和 調(diào) 節(jié) 基 因 B r c T T 8 在6 種 材 料 中 的 表 達(dá) 量 與 總 花 青 苷 的 含 量 呈 正 相 關(guān)。 調(diào) 節(jié) 基 因 B r c M Y B 7 5 和 B r c T T G 1 在 紫 色 材 料NJZX1-4 葉 片 中 具 有 較 高 的 表 達(dá) 量, 而 B r c E G L 3 . 2 和 B r c M Y B 9 0 基 因 在 所 有 材 料 中 均 無 表 達(dá)。 結(jié) 論 不 結(jié) 球 白 菜 不 同 材 料 間 花 青 苷 含 量 和 抗 氧 化 活 性 存 在 顯 著 差 異, 且 紫 色 材 料 富 含 的 花 青 苷 在 高 抗 氧 化 性 方 面 發(fā) 揮 了 重 要 作 用。 此 外,3 個 結(jié) 構(gòu) 基 因 和3 個 調(diào) 節(jié) 基 因 的 表 達(dá) 水 平 與 總 花 青 苷 含 量 密 切 相 關(guān), 在 調(diào) 控 不 結(jié) 球 白 菜 葉 片 著 色 過 程 中 起 重 要 作 用。 關(guān) 鍵 詞 : 不 結(jié) 球 白 菜; 花 青 苷; 抗 氧 化 活 性; 結(jié) 構(gòu) 基 因; 調(diào) 節(jié) 基 因 中 圖 分 類 號 :S634.3 文 獻(xiàn) 標(biāo) 志 碼 :A 文 章 編 號 :1000-2030 (2018 )03-0422-07 Comparisonofanthocyaninsantioxidantactivitiesandthe expressionanalysisofgenesrelatedtoanthocyaninsbiosynthesis intheleavesofsixnon-headingChinesecabbagematerials DONGHuijie,HANKe,HOUXilin,ZHANGZhishuo,HUChunmei * (CollegeofHorticulture/StateKeyLaboratoryofCropGeneticsandGermplasmEnhancement, NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China) Abstract:ObjectivesTheaimofthisstudywastocomparetheantioxidantactivityoftotalanthocyaninscontentintheleavesof differentnon-heading Chinese cabbage materials,and to investigate the expression patterns of genes related to anthocyanins biosynthesisinthesematerials.MethodsWeusedsixmaterialsofnon-headingChinesecabbages,andmeasuredtheantioxidant activitiesofleaves by using DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)and FRAP(ferric reducing ability of plasma)methods. In addition,wedeterminedtheexpressionlevelsofrelatedstructuralgenes( B r c F 3 H, B r c D F R, B r c A N S, B r c C H I, B r c C H S, B r c U F G T)and regulatorygenes( B r c T T 8, B r c T T G 1, B r c M Y B 7 5, B r c M Y B 9 0, B r c G L 3, B r c E G L 3 . 1, B r c E G L 3. 2)relatedtoanthocyaninsbiosynthesis. ResultsAmongsixmaterials,totalanthocyaninscontentwasthehighestinthedeeppurplematerialNJZX1-4,whichwas(801.5± 57.4)g·g -1 .DPPHfreeradicalscavengingratesofsixmaterialswere(49.31±3.91)%-(84.94±6.20)%,andFRAPvalueswere (256.8±136.3)-(1279.5±202.0)g·g -1 ,whichwashigherinpurplematerialNJZX1-1thanthoseofothermaterials.Thecorrela- tionamongtotalanthocyaninscontent,DPPHradicalscavengingrateandFRAP antioxidantcapacitywereextremelysignificant. Moreover,we found that the expression of anthocyanins structural genes( B r c F 3 H, B r c D F R and B r c A N S)and regulatory genes ( B r c T T 8)werepositivelycorrelatedwiththecontentoftotalanthocyanins. Regulatorygenes B r c E G L 3. 2and B r c M Y B 9 0hadno expressionin all materials,and B r c M Y B 7 5 and B r c T T G 1 were highly expressed in the deep purple leaf material NJZX1-4. ConclusionsThereweresignificantdifferencesintotalanthocyaninscontentandantioxidantactivityamongdifferentnon-heading 第3 期 董 慧 杰, 等:6 種 不 結(jié) 球 白 菜 材 料 葉 片 抗 氧 化 活 性 的 比 較 及 花 青 苷 合 成 相 關(guān) 基 因 的 表 達(dá) 分 析 Chinesecabbagematerials,andanthocyaninsplayedanimportantroleinantioxidantactivitiesinleaves.Theexpressionlevelsof threeanthocyaninsstructuralgenesandthreeregulatorygeneshadcloserelationwiththeaccumulationofanthocyaninsinleaves, indicatingthatthesegenesmightplayanimportantroleinregulatingthecoloringprocessinleavesofnon-headingChinesecabbage. Keywords:non-headingChinesecabbage;anthocyanins;antioxidantactivity;structuralgenes;regulatorygenes 不 結(jié) 球 白 菜( B r a s s i c a r ap assp. c hi n e ns i s) 因 其 適 應(yīng) 性 廣、 營 養(yǎng) 豐 富、 栽 培 方 便 和 生 長 周 期 短, 而 受 到 人 們 的 青 睞。 紫 色 不 結(jié) 球 白 菜 葉 片 上、 下 表 皮 具 有 較 大 的 顏 色 差 異, 通 常 上 表 皮 呈 深 紫 色 或 亮 紫 色, 下 表 皮 紫 色 分 布 不 均 勻, 富 含 花 青 苷 1-2 。 花 青 苷 主 要 存 在 于 植 物 液 泡 中, 使 植 物 花、 葉 片、 果 實、 種 子 等 呈 現(xiàn) 不 同 色 彩 3 。 研 究 表 明, 花 青 苷 是 最 理 想 的 抗 自 由 基 物 質(zhì), 具 有 很 強(qiáng) 的 抗 氧 化 性 4 和 抗 癌 及 預(yù) 防 心 血 管 疾 病 等 作 用 5-6 。 花 青 苷 的 抗 氧 化 性 與 活 性 酚 羥 基 有 關(guān), 酚 羥 基 具 有 很 強(qiáng) 的 抗 氧 化 活 性, 使 花 青 苷 具 有 清 除 各 種 活 性 氧 自 由 基 的 能 力 7-8 。 植 物 花 青 苷 生 物 合 成 途 徑 屬 于 類 黃 酮 生 物 合 成 途 徑 分 支 之 一, 其 生 物 合 成 過 程 不 僅 受 結(jié) 構(gòu) 基 因 的 作 用,還 受 相 關(guān) 調(diào) 節(jié) 基 因 的 影 響 9-10 。 在 植 物 花 青 苷 合 成 途 徑 中, 結(jié) 構(gòu) 基 因 直 接 參 與 花 青 苷 和 中 間 代 謝 產(chǎn) 物 的 合 成 與 貯 藏, 主 要 包 括 查 爾 酮 合 酶 基 因( C H S)、 查 爾 酮 異 構(gòu) 酶 基 因( C H I)、 黃 烷 酮3- 羥 化 酶 基 因( F 3 H) 和 類 黃 酮3- 羥 化 酶 基 因( F 3 H)、NADPH 依 賴 性 二 氫 黃 酮 醇 還 原 酶 基 因( D F R)、 無 色 花 青 苷 雙 加 氧 酶 / 花 青 苷 合 成 酶 基 因( L D O X / A N S) 和 類 黃 酮-3- O- 葡 糖 基 轉(zhuǎn) 移 酶 基 因( U F 3 G T)。 與 植 物 花 青 苷 合 成 有 直 接 關(guān) 系 的 轉(zhuǎn) 錄 因 子 主 要 包 括R2R3-MYB、MYC(bHLH) 和WD40 三 類, 通 過 其 單 體 或 者 復(fù) 合 體 來 調(diào) 控 結(jié) 構(gòu) 基 因 的 表 達(dá), 進(jìn) 而 影 響 花 色 素 的 積 累。 目 前, 植 物 中 花 青 苷 的 研 究 多 集 中 在 其 組 分 研 究 上。 本 研 究 以6 種 不 同 著 色 程 度 的 不 結(jié) 球 白 菜 為 試 驗 材 料, 比 較 其 總 花 青 苷 含 量, 采 用DPPH 自 由 基 清 除 能 力 法(DPPH 法) 和 鐵 離 子 還 原 能 力 法(FRAP 法) 來 研 究 葉 色 差 異 的 不 結(jié) 球 白 菜 葉 片 的 抗 氧 化 活 性, 并 利 用 實 時 定 量 和 半 定 量 方 法 測 定 花 青 苷 合 成 相 關(guān) 結(jié) 構(gòu) 基 因 和 調(diào) 節(jié) 基 因 的 表 達(dá) 水 平, 為 進(jìn) 一 步 研 究 不 結(jié) 球 白 菜 中 花 青 苷 的 特 性 及 生 物 合 成 機(jī) 制 提 供 理 論 基 礎(chǔ)。 1 材 料 與 方 法 圖1 6 種 不 結(jié) 球 白 菜 材 料 葉 色 的 比 較 Fig.1 Comparisonofleafcolorinsixnon-headingChinesecabbagematerials a. 蘇 州 青Suzhouqing;b.NJZX1-0;c.NJZX2-1;d.NJZX1-1;e.NJZX2-2;f.NJZX1-4. 1.1 材 料 選 用6 種 不 結(jié) 球 白 菜 材 料( 圖1), 分 別 為 深 紫 色 的NJZX1-4( 常 規(guī) 紫 色 可 育 系), 紫 色 的NJZX1-1( 常 規(guī) 紫 色 不 育 系), 綠 色 的 蘇 州 青 和NJZX1-0( 由NJZX1-4 經(jīng) 化 學(xué) 誘 變 后 挑 選 出 的 可 穩(wěn) 定 遺 傳 的 綠 色 突 變 3 2 4 南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 學(xué) 報 第41 卷 單 株), 深 紫 色 單 株(NJZX2-2) 和 淺 紫 色 單 株(NJZX2-1) 由NJZX1-4( 母 本) 和NJZX1-0( 父 本) 雜 交 后F 1 代 經(jīng) 自 交 后 所 得F 2 代。 將 種 子 用 蒸 餾 水 沖 洗 干 凈, 室 溫 催 芽3d, 播 種 至 穴 盤。 幼 苗 長 到2 葉1 心 時 移 至 大 棚, 待 材 料 長 至7 葉 期 時 取 樣, 并 將 所 有 樣 品 置 于-80 保 存 備 用。 1.2 花 青 苷 的 提 取 與 測 定 參 照 王 小 青 等 11 的 方 法 并 略 有 改 動。 取 新 鮮 功 能 葉 片0.1g 用 液 氮 研 磨 后, 加 入1.5mL 酸 化 甲 醇 ( 含 體 積 分 數(shù)3% 的HCl), 適 當(dāng) 搖 晃 條 件 下 室 溫 浸 提10h; 常 溫10000r·min -1 離 心5min, 然 后 取 上 清 液 經(jīng) 0.22m 濾 膜 過 濾, 備 用。 采 用pH 值 示 差 法 測 定 總 花 青 苷 含 量, 具 體 步 驟 參 照 許 玉 超 等 12 的 方 法。 1.3 不 結(jié) 球 白 菜 葉 片 花 青 苷 抗 氧 化 活 性 測 定 DPPH 法: 參 照 殷 麗 琴 等 13 的 方 法 測 定DPPH 自 由 基 清 除 率, 生 物 學(xué) 重 復(fù)3 次。 FRAP 法: 參 照Benzie 等 14 的 方 法 測 定FRAP 值 并 略 有 改 動。 將FRAP 工 作 液 預(yù) 熱 至37, 提 取 的 甲 醇 粗 液150L, 加 入2850LFRAP 工 作 液, 暗 室 反 應(yīng)30min 后 測 定593nm 波 長 下 的 吸 光 值。 以 沒 食 子 酸 溶 液 作 為 標(biāo) 準(zhǔn) 樣 品 繪 制 標(biāo) 準(zhǔn) 曲 線 y=0 .0066 x+0 .1127( R 2 =0.9696)。 單 位 為g·g -1 。 重 復(fù)3 次。 1.4 總RNA 的 提 取 與 單 鏈cDNA 的 合 成 總RNA 的 提 取 參 照RNA 提 取 試 劑 盒 使 用 說 明 書(TaKaRa)。 單 鏈cDNA 的 合 成 參 照PrimeScriptRT reagentKitwithgDNAEraser 反 轉(zhuǎn) 錄 試 劑 盒(TaKaRa)。 1.5 實 時 熒 光 定 量PCR 利 用BeaconDesignerv7.9 軟 件 設(shè) 計 引 物, 引 物 序 列 如 表1 所 示。 A c t i n 基 因 作 為 內(nèi) 參 15 , 并 通 過 普 通 PCR 驗 證 引 物 的 特 異 性。 RT-qPCR 反 應(yīng) 采 用SYBR P r e m i x E x T aq 試 劑 盒, 以 稀 釋10 倍 的 單 鏈cDNA 作 為 模 板。 體 系 共20L, 含SYBR P r e m i x E x T a q10L,ddH 2 O7.2L, 模 板2L, 正、 反 引 物 各0.4L。 生 物 學(xué) 重 復(fù)3 次, 相 對 定 量 測 定 參 照 C T 法 16 。 表1 引 物 序 列 Table1 Primersequencesinthisstudy 引 物Primer 序 列Sequence(53) 用 途Usage B r c C H I-F/R TATTAAGGTGACGATGAAG/GAGAGAGCAAAGAGAATC RT-qPCR B r c C H S-F/R ATCCAGACTACTACTTCC/GACTTCAACAACCACAAT RT-qPCR B r c F 3 H-F/R CGAGCAGACTATCAATAG/ATATCTCTACTCATCTTTCTC RT-qPCR B r c D F R-F/R CATAAGACAAGGACAGTAT/CGGAGATAGTAAGAATCG RT-qPCR B r c A N S-F/R ACCTTCATTCTACACAAC/AATCCTTACCTTCTCCTT RT-qPCR B r c U F G T-F/R GTAATGTATCCGTGGTTAG/GGTAGAGGTTAAGAGGTT RT-qPCR B r c G L 3-F/R TCTATCTCTGCTTCTCAA/CTTCCTCGTCTTAATGTC RT-PCR B r c E G L 3 . 1-F/R GTGAAGAACTCAATAACTG/GTGAAGAACTCAATAACTG RT-PCR B r c E G L 3 . 2-F/R AGAGTGATATAGGAGAAGAT/TCGTATCATCAAGAATCG RT-PCR B r c T T 8-F/R CTGGAATCTACTCATCAC/GCATCTCATCTCTAACAA RT-PCR B r c T T G 1-F/R CACTCCACCATCATCTAC/GTCAAGAATCACAACCTTAT RT-PCR B r c M Y B 9 0-F/R ACCCATTTGAGTAAGAAA/GGTATAAGAGCAAGGAAT RT-PCR B r c M Y B 7 5-F/R GCTGTAATACCAAGATGA/AAGGAATAGAGGAATAACG RT-PCR A c t i n-F/R GTTGCTATCCAGGCTGTTCT/AGCGTGAGGAAGAGCATAAC RT-PCRorRT-qPCR 1.6 半 定 量PCR 以 單 鏈cDNA 作 為 模 板, 體 系20L:2×HiQPCRMix10L, 引 物 各1L, 模 板1L,ddH 2 O7L。 反 應(yīng) 程 序 為:962min;9630s,5730s,7230s,28 個 循 環(huán);7210min。 1.7 數(shù) 據(jù) 處 理 采 用MicrosoftExcel2007 和SPSS20.0 軟 件 對 數(shù) 據(jù) 進(jìn) 行 統(tǒng) 計 分 析, 以 - x± SD 表 示。 2 結(jié) 果 與 分 析 2.1 不 結(jié) 球 白 菜 葉 片 的 總 花 青 苷 含 量由 圖2 可 以 看 出: 不 結(jié) 球 白 菜 深 紫 色 材 料NJZX2-2 和NJZX1-4 葉 中 總 花 青 苷 含 量 較 高, 分 別 為 4 2 4 第3 期 董 慧 杰, 等:6 種 不 結(jié) 球 白 菜 材 料 葉 片 抗 氧 化 活 性 的 比 較 及 花 青 苷 合 成 相 關(guān) 基 因 的 表 達(dá) 分 析 圖2 6 種 不 結(jié) 球 白 菜 材 料 葉 片 中 總 花 青 苷 含 量 的 比 較 Fig.2 Comparisonoftotalanthocyanincontentof6 materialsinnon-headingChinesecabbageleaves不 同 大 寫 字 母 表 示 在0.01 水 平 差 異 顯 著。 下 同。 Different capital letters indicate significant difference at 0.01 level.Thesameasfollows. (693.0±50.6) 和(801.5±57.4)g·g -1 , 極 顯 著 高 于 淺 紫 色 材 料NJZX1-1( P<0.01);NJZX2-1 葉 中 總 花 青 苷 含 量 為(279.7±56.5)g·g -1 , 且 極 顯 著 低 于NJZX1-1; 綠 色 材 料NJZX1-0 和 蘇 州 青 葉 中 總 花 青 苷 含 量 基 本 上 為0。 2.2 不 結(jié) 球 白 菜 葉 片 提 取 液 的 抗 氧 化 活 性 由 圖3 可 見:6 種 不 結(jié) 球 白 菜 材 料 葉 片 提 取 液 對DPPH 自 由 基 均 具 有 良 好 的 清 除 能 力, DPPH 自 由 基 清 除 率 為(49.31±3.91)%(84.94± 6.20)%, 變 異 系 數(shù) 為20.7%。 6 種 材 料 中 葉 片 提 取 液 的DPPH 自 由 基 清 除 率 由 大 到 小 依 次 為 NJZX1-1、NJZX1-4、NJZX2-2、NJZX2-1、NJZX1-0、 蘇 州 青, 且 紫 色 材 料 葉 片 的DPPH 自 由 基 清 除 率 極 顯 著 高 于 綠 色 材 料 葉 片。 葉 片 提 取 液 的 鐵 離 子 還 原 能 力 整 體 上 是 紫 色 葉 片 提 取 液 高 于 綠 色 葉 片( P<0.05)。6 種 材 料 葉 片 提 取 液 的FRAP 值 為(256.8±136.3)(1279.5±202.0)g·g -1 。 其 中, NJZX1-1 葉 片 提 取 液 的 鐵 離 子 還 原 能 力 最 強(qiáng), 而NJZX2-1 與NJZX1-0 差 異 不 顯 著。 相 關(guān) 性 分 析 表 明, 不 同 葉 色 白 菜 葉 片 中 總 花 青 苷 含 量 與 鐵 離 子 還 原 能 力 極 顯 著 相 關(guān), 相 關(guān) 系 數(shù) 為0.646, 與DPPH 自 由 基 清 除 率 也 極 顯 著 相 關(guān), 相 關(guān) 系 數(shù) 為0.829。 圖3 不 結(jié) 球 白 菜 葉 片 提 取 液 的DPPH 自 由 基 清 除 率 和FRAP 值 Fig.3 DPPHfreeradical-scavengingratesandthevaluesofFRAPoftheextractsfrom non-headingChinesecabbageleaves 不 同 小 寫 字 母 表 示 在0.05 水 平 差 異 顯 著。 Differentsmalllettersindicatesignificantdifferenceat0.05level. 2.3 不 結(jié) 球 白 菜 花 青 苷 合 成 途 徑 中 結(jié) 構(gòu) 基 因 的 表 達(dá) 特 性 由 圖4 可 見: 花 青 苷 合 成 途 徑 中 結(jié) 構(gòu) 基 因 B r c F 3 H、 B r c D F R 和 B r c A N S 的 表 達(dá) 水 平 在 紫 色 葉 片 中 極 顯 著 高 于 綠 色 葉 片, 且 在6 種 材 料 中 相 對 表 達(dá) 量 與 葉 片 總 花 青 苷 含 量 呈 正 相 關(guān)。 除 B r c U F G T 基 因 外 其 他5 個 結(jié) 構(gòu) 基 因 在 深 紫 色 材 料NJZX1-4 和NJZX2-2 中 均 有 較 高 的 表 達(dá) 量; B r c C H I 基 因 在 綠 色 的 蘇 州 青 中 的 表 達(dá) 量 顯 著 高 于 紫 色 材 料NJZX1-1, B r c C H S 基 因 在 蘇 州 青 中 的 表 達(dá) 量 顯 著 高 于 淺 紫 色 材 料NJZX2-1, 而 B r c U F G T 基 因 在 所 有 材 料 中 的 表 達(dá) 均 處 于 較 低 水 平。 2.4 不 結(jié) 球 白 菜 花 青 苷 合 成 途 徑 中 調(diào) 節(jié) 基 因 的 表 達(dá) 特 性 7 個 調(diào) 控 花 青 苷 的 調(diào) 節(jié) 基 因 在6 種 材 料 葉 片 中 的 表 達(dá) 結(jié) 果( 圖5) 顯 示: 調(diào) 節(jié) 基 因 表 達(dá) 具 有 特 異 性。 其 中, B r c G L 3 和 B r c E G L 3. 1 基 因 表 現(xiàn) 出 相 似 的 表 達(dá) 模 式, 即 在6 種 材 料 葉 片 中 均 有 表 達(dá) 且 在 材 料 間 差 異 不 明 顯。 此 外, B r c M Y B 75 基 因 和 B r c T T G 1 基 因 在 深 紫 色 材 料NJZX1-4 葉 片 中 有 較 高 表 達(dá), 而 B r c E G L3 . 2 基 因 和 B r c M Y B 9 0 基 因 在 所 有 材 料 的 葉 片 中 均 不 表 達(dá); B r c T T 8 基 因 在 所 有 材 料 中 表 現(xiàn) 不 同 的 表 達(dá) 水 平, 其 表 達(dá) 量 由 大 到 小 依 次 為NJZX2-2、NJZX1-4、NJZX1-1、NJZX2-1、 蘇 州 青、NJZX1-0, 與 花 青 苷 含 量 測 定 結(jié) 果 一 致。 5 2 4 南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 學(xué) 報 第41 卷 圖4 不 結(jié) 球 白 菜 花 青 苷 合 成 途 徑 中 結(jié) 構(gòu) 基 因 的 相 對 表 達(dá) 水 平 Fig.4 Relativeexpressionlevelsofthestructuralgenesoftheanthocyaninbiosynthesis innon-headingChinesecabbage 圖5 不 結(jié) 球 白 菜 花 青 苷 合 成 途 徑 中 調(diào) 節(jié) 基 因 的 表 達(dá) 量 Fig.5 Expressionleveloftheregulatorygenesoftheanthocyaninbiosynthesis innon-headingChinesecabbage 6 2 4 第3 期 董 慧 杰, 等:6 種 不 結(jié) 球 白 菜 材 料 葉 片 抗 氧 化 活 性 的 比 較 及 花 青 苷 合 成 相 關(guān) 基 因 的 表 達(dá) 分 析 3 討 論 紫 色 白 菜 類 葉 片 中 所 含 色 素 大 多 為 花 青 苷 類 化 合 物 17 。 紅 葉 芥 菜、 紫 紅 色 大 白 菜、 紅 菜 薹、 紫 色 小 白 菜 和 紫 結(jié) 球 甘 藍(lán)5 種 蕓 薹 屬 新 鮮 葉 片 花 青 苷 含 量 為130.0719.0g·g -118 。 本 研 究 中, 紫 色 不 結(jié) 球 白 菜 葉 片 中 花 青 苷 含 量 為0801.5g·g -1 , 綠 色 葉 片 基 本 不 含 花 青 苷; 其 中, 紫 色 不 結(jié) 球 白 菜NJZX1-4 葉 片 中 花 青 苷 含 量 明 顯 高 于 紅 葉 芥 菜(719.0g·g -1 )。 紫 色 白 菜 葉 片 中DPPH 自 由 基 清 除 率 和 鐵 離 子 還 原 能 力 (FARP 值) 均 顯 著 高 于 綠 色 葉 片, 且 葉 片 花 青 苷 含 量 與DPPH 自 由 基 清 除 率 和 鐵 離 子 還 原 能 力 基 本 呈 正 相 關(guān), 這 與 殷 麗 琴 等 13 研 究 結(jié) 果 一 致。 植 物 中 花 青 苷 生 物 合 成 受 結(jié) 構(gòu) 基 因 的 作 用。 Gong 等 19 研 究 發(fā) 現(xiàn) F 3 H 基 因 在 紅 色 紫 蘇 葉 片 中 表 達(dá), 而 在 綠 葉 材 料 中 不 表 達(dá),Sparvoli 等 20 在 葡 萄 中 也 發(fā) 現(xiàn) 類 似 結(jié) 果。 過 量 表 達(dá) D F R 1 基 因, 可 以 增 加 轉(zhuǎn) 基 因 植 株 中 花 青 苷 的 含 量 21-22 。 紫 色 羽 衣 甘 藍(lán) 中 D F R 和 A N S 的 表 達(dá) 明 顯 高 于 綠 色 材 料 23 。 在 本 研 究 中, 結(jié) 構(gòu) 基 因 B r c F 3 H、 B r c D F R 和 B r c A N S 在 紫 色 不 結(jié) 球 白 菜 葉 片 中 的 表 達(dá) 極 顯 著 高 于 綠 色 葉 片, 且 其 表 達(dá) 水 平 與 不 結(jié) 球 白 菜 葉 片 紫 色 著 色 程 度 呈 正 相 關(guān), 即 葉 片 花 青 苷 含 量 越 高, 基 因 的 表 達(dá) 量 越 高, 因 此 推 測 基 因 B r c F 3 H、 B r c D F R 和 B r c A N S 為 影 響 不 結(jié) 球 白 菜 花 青 苷 生 物 合 成 的 關(guān) 鍵 基 因。 雙 子 葉 植 物 花 青 苷 的 生 物 合 成 不 但 受 結(jié) 構(gòu) 基 因 的 影 響, 還 受 轉(zhuǎn) 錄 因 子 的 調(diào) 控 作 用 24 。 植 物 花 青 苷 生 物 合 成 調(diào) 控 因 子 主 要 有 三 大 類, 包 括MYB 蛋 白、bHLH 蛋 白 和WD40 蛋 白,3 種 蛋 白 之 間 均 可 發(fā) 生 相 互 作 用,進(jìn) 而 形 成 二 元 復(fù) 合 物 或 者 相 互 作 用 成MYB-bHLH-WD40 三 元 復(fù) 合 物 共 同 調(diào) 控 基 因 表 達(dá) 25-26 。 在 擬 南 芥 中,WD-repeat 蛋 白TTG1 通 過 結(jié) 合bHLH 轉(zhuǎn) 錄 因 子(GL3、TT8 或EGL3) 和R2R3-MYB 轉(zhuǎn) 錄 因 子 (MYB75/PAP1、MYB90/PAP2、MYB113 或MYB114) 形 成WD-repeat/Mybs/bHLH 復(fù) 合 物 來 上 調(diào) 花 青 苷 合 成 后 期 基 因( D F R、 A N S 或 U F 3 G T) 的 表 達(dá) 27-28 。 本 研 究 中, 我 們 發(fā) 現(xiàn) 在 驗 證 的7 個 調(diào) 節(jié) 基 因 中, B r c G L 3、 B r c E G L 3 . 1 和 B r c T T 8 基 因 在 綠 色 和 紫 色 材 料 中 均 有 表 達(dá), 其 中 B r c T T 8 基 因 在 不 同 材 料 中 的 表 達(dá) 水 平 與 其 葉 片 著 色 程 度 相 關(guān), 即 花 青 苷 含 量 越 多, B r c T T 8 表 達(dá) 量 越 高。 另 外, B r c M Y B 75 和 B r c T T G 1 在 深 紫 色 材 料 NJZX1-4 葉 片 中 有 較 高 表 達(dá)。 本 試 驗 結(jié) 果 表 明 這 些 轉(zhuǎn) 錄 因 子 在 很 大 程 度 上 參 與 了 葉 片 中 花 青 苷 的 生 物 合 成 調(diào) 控, 但 其 是 如 何 通 過 調(diào) 節(jié) 結(jié) 構(gòu) 基 因 進(jìn) 而 調(diào) 控 花 青 苷 的 積 累, 有 待 進(jìn) 一 步 研 究。 參 考 文 獻(xiàn)References : 1 李 長 新. 紫 色 小 白 菜 花 青 素 理 化 性 質(zhì) 研 究D. 楊 凌: 西 北 農(nóng) 林 科 技 大 學(xué),2011. LiCX.ThestudyofphysicochemicalpropertyofanthocyanidininpurplepakchoiD.Yangling:NorthwestA&FUniversity,2011(inChinese withEnglishabstract). 2 徐 學(xué) 玲, 趙 岫 云, 王 丹, 等.HPLC-ESI-MS 分 析 紫 色 小 白 菜 中 花 青 苷 組 成 分 析J. 食 品 工 業(yè) 科 技,2014,35(11):278-281. XuXL,ZhaoXY,WangD,etal.HPLC-ESI-MSanalysisofthestructureandcontentofanthocyaninsinpurplepakchoiJ.Scienceand TechnologyofFoodIndustry,2014,35(11):278-277(inChinesewithEnglishabstract). 3 TanakaY,SasakiN,OhmiyaA.Biosynthesisofplantpigments:anthocyanins,betalainsandcarotenoidsJ.PlantJournalforCellandMolecular Biology,2008,54(4):733-749. 4 Pascual-TeresaSD,Sanchez-BallestaMT.Anthocyanins:fromplanttohealthJ.PhytochemistryReviews,2008,7(2):281-299. 5