書北方園藝（）： ·研究論文·第一作者簡介：王書珍（），女，博士，副教授，現(xiàn)主要從事植物遺傳學(xué)等研究工作。： 責(zé)任作者：汪愛華（），女，博士，高級(jí)農(nóng)藝師，現(xiàn)主要從事葉類蔬菜品種篩選和種質(zhì)改良等研究工作。：基金項(xiàng)目：湖北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（）；國家大宗蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系試驗(yàn)站資助項(xiàng)目（）；大別山特色資源開發(fā)湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心團(tuán)隊(duì)資助項(xiàng)目（）。收稿日期：生菜資源表型性狀變異及其與標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析王 書 珍，王 斌 才，黃 興 學(xué)，李 志 良，周 國 林，汪 愛 華（經(jīng)濟(jì)林木種質(zhì)改良與資源綜合利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黃岡師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 黃岡；武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)研究院 蔬菜科學(xué)研究所，湖北 武漢）摘要：從世界范圍內(nèi)搜集的多份生菜資源中篩選份優(yōu)質(zhì)資源作為研究對(duì)象，調(diào)查個(gè)表型性狀變異，并進(jìn)行分子標(biāo)記分析，探究表型性狀與標(biāo)記之間的相關(guān)關(guān)系，以期為生菜分子標(biāo)記輔助育種提供參考依據(jù)。結(jié)果表明：調(diào)查的份資源表型性狀均存在極顯著差異，平均變異系數(shù)最大的為株幅（）。個(gè)表型性狀將份生菜資源分成兩大類，份資源的遺傳距離變化范圍為。個(gè)多態(tài)性標(biāo)記在份生菜資源中擴(kuò)增的條帶數(shù)為，和的平均值分別為和，值變化范圍為。同樣，個(gè)標(biāo)記將份資源分成兩大類，份資源間的遺傳距離為，表型性狀聚類結(jié)果與標(biāo)記聚類結(jié)果不相關(guān)。以單一性狀聚類結(jié)果與標(biāo)記聚類結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析，大部分標(biāo)記均與表型性狀有相關(guān)性，且大部分引物組合表現(xiàn)為累積效應(yīng)。關(guān)鍵詞：生菜；表型性狀；標(biāo)記；關(guān)聯(lián)分析；種質(zhì)改良中圖分類號(hào)： 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： 文章編號(hào)：（）生菜（ ）屬菊科萵苣屬一二年生草本，別名葉用萵苣，包括散葉生菜、半結(jié)球生菜、結(jié)球生菜等，是世界范圍內(nèi)廣泛種植食用的低糖、低脂類蔬菜。生菜營養(yǎng)價(jià)值極高，富含多種維生素、礦物質(zhì)、有機(jī)酸、核黃素等活性成分，以及具有減肥功效的膳食纖維，能夠分解食物中亞硝胺等致癌物質(zhì)而被譽(yù)為“抗癌蔬菜”。隨著對(duì)生菜保健功能認(rèn)識(shí)的深入，人們對(duì)其品質(zhì)的要求逐漸提高，尤其是表型性狀。表型性狀多為數(shù)量性狀且受多基因互作影響，且形態(tài)學(xué)特征與分子標(biāo)記具有緊密聯(lián)系。（ ）是從功能基因內(nèi)開發(fā)的標(biāo)記，具有重復(fù)性強(qiáng)、共顯性等特點(diǎn)，能夠縮小目標(biāo)性狀相關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記的篩選范圍，在動(dòng)植物的遺傳多樣性檢測、和目標(biāo)基因定位、遺傳連鎖圖的構(gòu)建、雜種優(yōu)勢的預(yù)測、分子標(biāo)記輔助育種（ ，）等領(lǐng)域作用重大。該研究以份生菜資源為研究對(duì)象，將葉形、株型等數(shù)據(jù)與分子標(biāo)記進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，以期篩選與表型性狀緊密關(guān)聯(lián)的標(biāo)記位點(diǎn)，為相關(guān)基因的克隆和分析做鋪墊，也為生菜的種質(zhì)改良提供參考依據(jù)。 材料與方法 試驗(yàn)材料武漢市蔬菜科學(xué)技術(shù)研究所年開始從世界各地引入份生菜資源，在前期溫室栽培及田間試驗(yàn)的研究基礎(chǔ)上，將形態(tài)及培育周期差異明顯的份資源作為研究對(duì)象。在試驗(yàn)基地（東經(jīng)°，北緯°）種植兩季，定植株行距為×，每個(gè)品種種植株，常規(guī)日常管理。年秋季，每個(gè)品種隨機(jī)選株健康葉片，放入硅膠中干燥，自封袋封存后于保存并用于標(biāo)記分析。 試驗(yàn)方法 表型形狀的調(diào)查份生菜資源（標(biāo)號(hào)），除去病害植株，選取長勢一致的植株，每個(gè)品種選取株，連續(xù)個(gè)種植期田間觀察葉色、葉型、葉形、葉緣、葉邊、結(jié)球與否、株型、長勢。測量株高、株幅，統(tǒng)計(jì)葉片數(shù)，測定最大葉面積，每份資源統(tǒng)計(jì)個(gè)個(gè)體的平均值。 基因組提取及擴(kuò)增采用改良的法提取生菜基因組，瓊脂糖凝膠電泳檢測完整度，經(jīng)紫外分光光度計(jì)測定的濃度，并將濃度稀釋至·，于保存?zhèn)溆?。引物是前期基于?shù)據(jù)庫登陸的生菜序列設(shè)計(jì)合成的，挑選其中對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)凝膠電泳分析后，最終篩選出對(duì)多態(tài)性高、譜帶清晰、重復(fù)性好的引物進(jìn)行試驗(yàn)（表）。采用的反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，體系含的× ，基因組，·正反向引物，滅菌去離子水補(bǔ)足剩余體積。擴(kuò)增程序?yàn)轭A(yù)變性，個(gè)擴(kuò)增循環(huán)（變性，最適退火溫度下退火，延伸），最后增加一個(gè)的延伸階段。擴(kuò)增產(chǎn)物采用的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，統(tǒng)計(jì)不同個(gè)體的基因型。表多態(tài)性引物信息 位點(diǎn)正向引物（） （）反向引物（） （）退火溫度（）重復(fù)基序 等位基因觀察雜合度期望雜合度多態(tài)性信息含量 （） （） （） （） （） （） （） （） （） （） （） （） （） （） 平均值 標(biāo)準(zhǔn)差 標(biāo)記與品質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析對(duì)個(gè)表型性狀進(jìn)行方差分析和聚類分析，計(jì)算各性狀的平均值、變異系數(shù)及重復(fù)力（）。根據(jù)電泳圖譜條帶的有無建立“”二元矩陣：有帶為，無帶為。采用并用軟件計(jì)算遺傳多樣性和連鎖不平衡。利用 軟件北方園藝月（上）計(jì)算每個(gè)標(biāo)記的多態(tài)性信息含量。采用軟件計(jì)算距離系數(shù)，聚類分析并建立聚類樹狀圖。根據(jù)遺傳距離矩陣分析標(biāo)記位點(diǎn)與形態(tài)性狀的相關(guān)性。 結(jié)果與分析 生菜表型性狀變異分析和聚類分析方差分析表明，個(gè)表型性狀在份生菜資源間差異達(dá)到極顯著水平，表明生菜表型變異大，遺傳多樣性豐富。株高、株幅、葉片數(shù)、最大葉等個(gè)表型性狀的變異系數(shù)（）在，變異最大的為株幅，最小的為葉片數(shù)。這個(gè)性狀的重復(fù)力（）均比較高，變化范圍為，其中重復(fù)力最低的是葉片數(shù)，最高的是株幅（表）。表各品種間表型性狀變異 編號(hào)表型性狀平均值 最大值 最小值 標(biāo)準(zhǔn)差 變異系數(shù)（） 重復(fù)力 株高 株幅 葉片數(shù) 最大葉面積 葉色多為深綠、綠色、淺綠，其次還有翠綠、暗綠、綠白、深紫紅色；葉型多為扇形、長圓形、近圓形，其次為圓形、長扇形、狼耳尖形葉；葉形多為皺縮、微皺、較光滑、特皺縮，其次還有近全緣、近光滑、較皺縮。份生菜資源的葉緣為全緣，其余份為近全緣。份為半結(jié)球資源，份不結(jié)球，份為結(jié)球。葉邊有折疊、波浪折疊、稀鋸齒波浪、稀波浪、密尖刺波浪折疊、微波浪、鋸齒波浪、尖刺狀、鈍齒狀、鈍尖狀波浪折疊等類型。株型份為散狀，份為緊湊型，份為較緊湊型。份資源長勢中等，份長勢旺盛，份特旺盛，份長勢較弱。圖個(gè)表型性狀聚類結(jié)果 份生菜資源被分為兩大類，、等份生菜被分到第一類中，第二大類僅僅包括、等份資源（圖）。在相關(guān)系數(shù)為處，第一類的份資源被分為類，分別包 第期北方園藝?yán)ǚ莺头葙Y源。表型性狀相似的資源被聚到一起，聚類結(jié)果與地理起源并不完全一致。 引物多態(tài)性分析在所設(shè)計(jì)合成的個(gè)標(biāo)記中，個(gè)標(biāo)記是多態(tài)性的，擴(kuò)增條帶數(shù)為，平均每個(gè)位點(diǎn)為（表）。引物和擴(kuò)增的等位基因最多，均為個(gè)等位基因。、標(biāo)記擴(kuò)增的等位基因最少，僅為個(gè)。觀察雜合度（）和期望雜合度（）的變化范圍分別為和，平均值分別為和。多態(tài)性信息含量值變化范圍為，平均為，值最高的是位點(diǎn)，最低的是位點(diǎn)。個(gè)標(biāo)記將份資源分成兩大類，第一大類僅包括和等份資源，其余的份被聚成第二大類。在相關(guān)系數(shù)處，第二大類又被分為類，分別包括份和份生菜資源（圖）。圖生菜資源標(biāo)記的聚類結(jié)果 表型性狀與標(biāo)記關(guān)聯(lián)分析將表型性狀的距離矩陣與分子標(biāo)記聚類的距離矩陣進(jìn)行相關(guān)性分析，得到擬合方程 ，二者的相關(guān)系數(shù)為 ，即相關(guān)性不顯著，個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)反映的差異與各材料的表型性狀無相關(guān)性。將每個(gè)表型性狀進(jìn)行聚類，每對(duì)引物也進(jìn)行單獨(dú)聚類，再將每個(gè)表型性狀距離矩陣與每對(duì)引物聚類的距離矩陣進(jìn)行相關(guān)性分析。在進(jìn)行的個(gè)兩兩相關(guān)分析中，各表型性狀與引物達(dá)到極顯著相關(guān)（）水平的引物數(shù)在對(duì)，相關(guān)系數(shù)范圍為。標(biāo)記與葉色的相關(guān)系數(shù)最大，達(dá)到。與葉形和株高性狀達(dá)到顯著相關(guān)水平的引物最多，均為對(duì)，分別是、和、（表）。僅發(fā)現(xiàn)個(gè)標(biāo)記分別與葉色（）、結(jié)球（）、葉片數(shù)（）等表型性狀顯著相關(guān)。引物與葉型、葉形、葉緣、葉邊、結(jié)球等個(gè)表型性狀相關(guān)，同樣引物也與葉緣、葉邊、株型、株幅、最大葉面積等個(gè)性狀相關(guān)聯(lián)。然而，、等個(gè)引物與個(gè)表型性狀均無相關(guān)性。 討論與結(jié)論連鎖不平衡（ ，）是不同基因座位上等位基因的非隨機(jī)組合，關(guān)聯(lián)分析以連鎖不平衡為基礎(chǔ)，無須構(gòu)建作圖群體，鑒定群體內(nèi)目標(biāo)性狀與遺傳標(biāo)記或候選基因關(guān)系的分析方法。關(guān)聯(lián)分析已經(jīng)廣泛用于水稻、玉米、大北方園藝月（上）表單一葉形性狀與各引物的相關(guān)性分析 表型性狀相關(guān)的引物 相關(guān)引物數(shù) 單個(gè)引物最大相關(guān)系數(shù) 葉色 葉型 、 葉形 、 葉緣 、 葉邊、 結(jié)球 株型 、 長勢、 株高 、 株幅 、 葉片數(shù) 最大葉面積 、 麥、鴨、豬等經(jīng)濟(jì)物種性狀基因的定位研究。例如，賴勇等采用連鎖不平衡分析在大麥中找到了與株高、穗長、芒長、穗粒數(shù)等表型性狀緊密聯(lián)系的位點(diǎn)。然而，對(duì)于生菜品質(zhì)性狀與分子標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析尚鮮見報(bào)道。植物數(shù)量形狀受環(huán)境影響較大，表型性狀難以準(zhǔn)確測量其遺傳變異。根據(jù)葉色、葉型、葉形、葉緣、葉邊、結(jié)球與否、株型、長勢、株高、株幅、葉片數(shù)、最大葉面積的分類，從生菜種質(zhì)庫中抽取表型性狀差異顯著的份生菜資源作為參考材料，種植在環(huán)境條件一致的苗圃地，且采用完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，最大程度地消除了環(huán)境因素造成的個(gè)體表型差異。所選生菜資源的表型性狀存在豐富的遺傳多樣性，其中株高、株幅、葉片數(shù)、最大葉面積等個(gè)表型性狀的變異系數(shù)為，且各性狀在不同功能材料間存在極顯著差異，個(gè)性狀的重復(fù)力（）均大于，即此個(gè)性狀中遺傳因素占主導(dǎo)地位。個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)平均為，值變化范圍較大（），即所檢測的生菜資源遺傳變異比較豐富。劉超采用個(gè)標(biāo)記與個(gè)表型性狀的關(guān)聯(lián)研究中，相關(guān)系數(shù)達(dá)到 ，即極顯著相關(guān)性。該研究中，葉形和株高個(gè)性狀均與點(diǎn)緊密關(guān)聯(lián)，且表現(xiàn)為累積效應(yīng)，表明該性狀受多基因共同作用。葉色性狀與標(biāo)記的相關(guān)系數(shù)達(dá)到，因此開發(fā)更多的額標(biāo)記進(jìn)行范圍的基因組掃描和表型性狀關(guān)聯(lián)分析仍需進(jìn)行。該研究對(duì)于生菜表型性狀目的基因的克隆，以及生菜種質(zhì)資源的育種和品質(zhì)性狀改良意義重大。然而，關(guān)聯(lián)位點(diǎn)與性狀間關(guān)系及作用機(jī)理和方式尚不清楚，需后續(xù)的深入研究。參考文獻(xiàn) ， ， ，（）： ， ， ， ，（）：左力輝，張文林，邱彤，等新疆野蘋果葉形性狀變異及其與標(biāo)記關(guān)聯(lián)分析園藝學(xué)報(bào)，（）： ， ， ， ，： ， ， ， （ ） ，（）： ， ， ， （ ü） ，（）： ， ， ， 第期北方園藝（） ，（）： ， ， ， ，（）： ， ， ， ，（）： ， ， ， ： ，： ， ， ， ，（）：方梅霞，李瑩，徐海平，等及其受體基因多態(tài)性與鴨生長及屠體性狀的關(guān)聯(lián)性畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，（）：覃立立，蔡更元，張豪，等豬骨和皮脂性狀相關(guān)的篩查與關(guān)聯(lián)分析中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，（）： 賴勇，王鵬喜，范貴強(qiáng)，等大麥標(biāo)記遺傳多樣性及其與農(nóng)藝性狀關(guān)聯(lián)分析中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，（）：劉超籽用南瓜種質(zhì)資源遺傳多樣性研究哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)， ， ， ， ， ， （ ， ， ； ， ， ）： ， ， ， （） ， ， ， ， ， ， ， ： ； ； ； 北方園藝月（上）