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甜瓜MAPK基因的表達(dá)分析_辛董董.pdf

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甜瓜MAPK基因的表達(dá)分析_辛董董.pdf

北方園藝(): ·研究論文 ·第一作者簡(jiǎn)介 :辛董董 (),男 ,碩士研究生 ,研究方向?yàn)閳@藝植物生理特性及生物技術(shù)育種 。:責(zé)任作者 :李桂榮 (),女 ,博士 ,副教授 ,現(xiàn)主要從事園藝植物育種與生物技術(shù)教學(xué)與科研等工作 。:基金項(xiàng)目 :國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 ();河南省自然基金資助項(xiàng)目 ();河南省高校重點(diǎn)科研資助項(xiàng)目 ()。收稿日期 :甜瓜基因的表達(dá)分析辛 董 董,李 桂 榮,郭 衛(wèi) 麗,鄭 秋 云,耿 新 麗(河南科技學(xué)院 園藝園林學(xué)院,河南 新鄉(xiāng);新疆鄯善葡萄瓜果研究所,新疆 鄯善)摘要 :以 “哈密加格達(dá) ”甜瓜為試材 ,采用實(shí)時(shí)定量()方法 ,研究了水楊酸 ()、乙烯利 ()和南瓜白粉病病原菌處理甜瓜葉片的基因的表達(dá)情況 ,以期為甜瓜基因的調(diào)控功能研究及甜瓜抗白粉病育種提供參考依據(jù) 。結(jié)果表明 :處理抗病甜瓜葉片后 的、 個(gè)基因的表達(dá)上調(diào) ,基因表達(dá)量最大 ,處理感病甜瓜葉片、后的表達(dá)量上調(diào) ;處理抗病甜瓜葉片后、 個(gè)基因的表達(dá)量上調(diào)明顯 ,基因表達(dá)量最大 ,處理感病甜瓜葉片后基因的表達(dá)量最大 ;南瓜白粉病孢子處理抗甜瓜葉片后基因的表達(dá)量上調(diào)最明顯 ;南瓜白粉病孢子處理感病甜瓜葉片后基因的表達(dá)量上調(diào)明顯 ,綜上所述 ,在甜瓜葉片中、南瓜白粉病病原菌均可以誘導(dǎo)該基因的表達(dá) 。其中 ,、分別在處理抗病甜瓜葉片后和處理感病甜瓜葉片、后能夠響應(yīng)的誘導(dǎo) ;能夠響應(yīng)和南瓜白粉病孢子的誘導(dǎo) 。關(guān)鍵詞 :甜瓜 ;甜瓜白粉病 ;基因 ;表達(dá)分析中圖分類(lèi)號(hào) : 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 : 文章編號(hào) :()甜瓜白粉病是在瓜類(lèi)作物上廣泛發(fā)生的重要病害之一 ,在世界各地甜瓜主要生產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生 ,不論是露地還是保護(hù)地栽培 ,在甜瓜生產(chǎn)過(guò)程中預(yù)防不到位均將造成甜瓜植株葉片大面積枯死 ,導(dǎo)致甜瓜產(chǎn)量和品質(zhì)嚴(yán)重下降。目前在甜瓜生產(chǎn)上主要靠噴施農(nóng)藥防治甜瓜白粉病 ,這不僅在栽培上增加了勞動(dòng)力 ,并且增加防病成本,采用化學(xué)防病會(huì)造成環(huán)境污染 ,不利于生產(chǎn)有機(jī)果品 ,也不利于人與自然和諧共處 ,對(duì)生態(tài)環(huán)境造成破壞 ,更重要的是長(zhǎng)期使用化學(xué)殺菌劑易使病原菌產(chǎn)生抗藥性。因此 ,研究如何利用甜瓜抗病基因 ,篩選優(yōu)異抗病基因資源用于抗病新品種的培育 ,是從根本上解決甜瓜白粉病病害的一種有效途徑。植物中的絲裂原活化蛋白激酶 ()能夠被多種生物和非生物脅迫誘導(dǎo) ,參與植物生長(zhǎng) 、發(fā)育和脅迫應(yīng)答的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程 ,是信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)部的重要傳遞者 ,能將外界各種刺激信號(hào) (如高鹽脅迫 、低溫脅迫 )傳導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi) ,誘導(dǎo)相應(yīng)基因表達(dá) ,是一組能被不同的細(xì)胞外刺激 (如細(xì)胞因子 、神經(jīng)遞質(zhì) 、激素 、細(xì)胞應(yīng)激及細(xì)胞黏附 )激活的絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶 。由于是培養(yǎng)細(xì)胞在受到生長(zhǎng)因子等絲裂原刺激時(shí)被激活而被鑒定的 ,因而得名。與其它信號(hào)分子組成級(jí)聯(lián)途徑 ,通過(guò)依次磷酸 化 將 逆 境 信 號(hào) 傳 遞 下 去 ,即。目前 ,科學(xué)家已從擬南芥、花生、棉花、丹參、煙草、亞麻等植 物 中 分 離 得 到基 因 ,研 究 表 明 ,基因與植物抗逆性有密切關(guān)系,但是 ,甜瓜基因還沒(méi)有相關(guān)方面報(bào)道 。近幾年植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的研究多集中在擬南芥等模式植物中 ,而且級(jí)聯(lián)反應(yīng)途徑是參與植物耐鹽生理調(diào)控的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一 ,在瓜類(lèi)植物研究較少。一些瓜類(lèi)植物與擬南芥等進(jìn)化關(guān)系比較遠(yuǎn) ,因此 ,研究瓜類(lèi)植物的信號(hào)途徑 ,可以從抗逆植物入手 ,以全面了解不同習(xí)性植物的抗逆分子途徑。該研究選取抗白粉病的高代自交系和感病的甜瓜作為試驗(yàn)材料 ,通過(guò)水楊酸 ()、乙烯利()和南瓜白粉病病原菌分別處理感病和抗病甜瓜 ,利用熒光定量方法分析了基因在葉片中的表達(dá)模式 ,進(jìn)而研究基因在病原真菌侵染過(guò)程中的表達(dá)規(guī)律 ,鑒定與抗病性最為相關(guān)的一個(gè)或多個(gè)基因 ,篩選甜瓜抗白粉病相關(guān)基因 ,以期為甜瓜的抗病育種提供思路。 材料與方法 試驗(yàn)材料供試甜瓜抗病品種 “哈密加格達(dá) ”()及感病品種 ()種子由新疆鄯善葡萄瓜果研究所提供 ;水楊酸 ()、乙烯利 ()購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司 ;南瓜白粉病病原菌采自河南科技學(xué)院試驗(yàn)田中自然發(fā)病的南瓜病株 ,中國(guó)南瓜高抗白粉病自交系 和高感白粉病自交系 “九江轎頂 ”,保存于河南科技學(xué)院南瓜團(tuán)隊(duì) 。 試驗(yàn)方法 試驗(yàn)設(shè)計(jì)種子播種萌發(fā)獲得片真葉后 ,分別用·水楊酸 ()、·乙烯利 ()噴灑于甜瓜葉片表面 ,每個(gè)處理株苗 ,重復(fù)次 。將南瓜白粉病病原菌接種于培養(yǎng)基 ,培養(yǎng)周后 ,利用黑光燈照射培養(yǎng) ,誘導(dǎo)南瓜白粉病病原菌孢子的產(chǎn)生 。取南瓜白粉病病原 菌 分 生 孢 子 ,制 成 孢 子 濃 度 約 為×個(gè) ·懸浮液 ,噴灑于甜瓜葉片表面 ,分別處理、后 ,取其葉片 ,迅速置于液氮中冷凍后 ,放置在條件下進(jìn)行保存?zhèn)溆?。 總的提取利用通用植物快速提取試劑盒 的方法提取總。提取稀釋倍 ,測(cè)定值 ,計(jì)算濃度 。再取總進(jìn)行電泳 ,觀察條帶 。 反轉(zhuǎn)錄模板以為 模 板 ,參 照 的操作說(shuō)明書(shū)完成第一條鏈的合成 。 基因的篩選將稀釋到·。在離心管中依次加入上游引物 、下游引物 、· 、 做混合樣 ,分別取加入離心管中 ,之后分別加入經(jīng)過(guò)水楊酸()、乙烯利 ()、南瓜白粉病病原菌在不同時(shí)間條件處理的感病和抗病甜瓜葉片的模板。反應(yīng)程序 :預(yù)變性,然后進(jìn)行以下循環(huán) ,變性,退火,延伸,共個(gè)循環(huán) 。最后延伸,保持 。實(shí)時(shí)定量引物如表所示 ,引物由奧科鼎盛生物有限公司合成 。采用的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行基因檢測(cè) 。表 實(shí)時(shí)定量特異引物序列 編號(hào)序列() 甜瓜基因片段的擴(kuò)增取一個(gè)的離心管依次加 入、上游引物 、下游引物 、模 板 、 ,充分混勻 ,在孔板子里分別加北方園藝月 (下 )入混合樣 ,再分別加入 模板 ,按照上述反應(yīng)體系每個(gè)處理的模板重復(fù)次 。在已經(jīng)加好反應(yīng)液的孔板子上附上膜 。離心后取出 。反應(yīng)程序 :預(yù)變性,然后進(jìn)行以下循環(huán) ,變性,退火,延伸,。 數(shù)據(jù)分析實(shí)時(shí)定量試驗(yàn)數(shù)據(jù)均為次重復(fù)的平均值 ,采用 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理 ,采 用 軟 件 進(jìn) 行做圖 。 結(jié)果與分析 甜瓜總的提取由圖可知 ,總呈現(xiàn)出條清晰可區(qū)分的條帶 ,個(gè)條帶的亮度比值為,表明未降解 ,可以用于后續(xù)試驗(yàn) 。注 :樣品處理時(shí)間分別為 、。: ,圖 乙烯利處理感病甜瓜葉片總 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果 甜瓜基因在、和南瓜白粉病病原菌孢子誘導(dǎo)條件下表達(dá)特性分析 誘導(dǎo)甜瓜基因在感病和抗病甜瓜葉片中的表達(dá)分析由圖可知 ,處理對(duì)抗病甜瓜的葉片的和基因的表達(dá)有顯著影響 ,與相比 ,處理、后 ,種基因的表達(dá)量均上調(diào) ,其中 ,基因表達(dá)量最高 ,與相比 ,分別增加、倍 ;基因次 之 ;基 因 表 達(dá) 量 最 小 。表 明、 種基因能夠響應(yīng)的誘導(dǎo) 。由圖可知 ,感病甜瓜的葉片經(jīng)處理后 ,基因的表達(dá)量上調(diào) ,其 中 ,在、處理后表達(dá)量分別達(dá)到最大 ,與相比 ,基 因 分 別 增 加、倍 ,、基因的表達(dá)變化不大 ,表明基因能夠響應(yīng)的誘導(dǎo) 。圖 熒光定量分析 處理抗病甜瓜葉片后的基因表達(dá) 圖 熒光定量分析 處理感病甜瓜葉片后的基因表達(dá) 誘導(dǎo)甜瓜基因在感病和抗病甜瓜葉片中的表達(dá)分析由圖可知 ,抗病甜瓜葉片經(jīng)過(guò)處理、后基因相對(duì)表達(dá)量上調(diào)明顯 ,與 第 期北方園藝處理相比 ,抗病甜瓜葉片經(jīng)處理、后基因相對(duì)表達(dá)量分別增 加 了、倍 ;基因在處理后表達(dá)量上調(diào)明顯 ,與處理相比 ,相對(duì)表達(dá)量增加了倍 ,表明、 個(gè)基因均可以響應(yīng)的誘導(dǎo) 。由圖可知 ,經(jīng)處理后 ,感病甜瓜葉片和 種基因的相對(duì)表達(dá)量均上調(diào) ,其中在處理、后相對(duì)表達(dá)量上調(diào)明顯 ,處理后上調(diào)最明顯 ,與處理相比 ,感病甜瓜葉片經(jīng)過(guò)處理后基因相對(duì)表達(dá)量增加了倍 ,并且基 因 的 表 達(dá) 量 優(yōu) 于基 因 ,、 個(gè)基因均可以響應(yīng)的誘導(dǎo) 。圖 熒光定量分析 處理抗病甜瓜葉片后的基因表達(dá) 圖 熒光定量分析 處理感病甜瓜葉片后的基因表達(dá) 甜瓜基因在南瓜白粉病孢子誘導(dǎo)條件下的表達(dá)特征分析由圖可知 ,抗病甜瓜葉片經(jīng)病原菌處理后 ,、和 種基因的相對(duì)表達(dá)量分別在處理后達(dá)到最大 ,其中 ,基因的表達(dá)量上調(diào)最為明顯 ,與處理相比 ,增加倍 ;基因的相對(duì)表達(dá)量次之 ,基因的相對(duì)表達(dá)量最最低 。表明、 個(gè)基因均能夠響應(yīng)南瓜白粉病孢子的誘導(dǎo) 。由圖可知 ,南瓜白粉病病原菌孢 子 處 理 感 病 甜 瓜 葉 片、后、和 種基因的相對(duì)表達(dá)量逐漸增加 ,處理后均達(dá)到最大值 ;基因的表達(dá)量與處理相比 ,增加了倍 ,基因的表達(dá)量次之 ,圖 熒光定量分析南瓜白粉病病原菌誘導(dǎo)抗病甜瓜葉片后的 基因的表達(dá) 圖 熒光定量分析南瓜白粉病病原菌誘導(dǎo)感病甜瓜葉片后的 基因表達(dá) 北方園藝月 (下 )基因的表達(dá)量最低 。其中 ,南瓜白粉病孢子處理感病 甜 瓜 葉 片后、和 種 基 因 的 表 達(dá) 量 分 別 降 低 ,表 明、 種基因均能夠響應(yīng)南瓜白粉病孢子的誘導(dǎo) 。 討論與結(jié)論基因在植物中能夠響應(yīng)各種生物以及非生物的脅迫 ,不僅可以通過(guò)磷酸化修飾被激活 ,而且還可以在水平上被激活 ,并且可以參與植物抵抗逆境脅迫的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程 。等研究表明 ,在植物干旱和熱脅迫時(shí) ,低濃度的在干旱和熱脅迫應(yīng)答過(guò)程中對(duì)過(guò)表達(dá) 的擬南芥有正調(diào) 控 作 用 。冷 脅 迫下 ,介導(dǎo)番茄低溫脅迫下的表達(dá) ,在擬南 芥 過(guò) 表 達(dá)能增強(qiáng)煙草的耐低溫性。在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中遭遇逆境是不可避免的 ,尤其是干旱 、病原菌 、溫差等嚴(yán)重影響植物生長(zhǎng)和產(chǎn)量 。甜瓜白粉病在瓜類(lèi)作物上廣泛發(fā)生 ,進(jìn)行篩選甜瓜優(yōu)異抗病基因資源用于抗病新品種的培育 ,是從根本上解決甜瓜白粉病病害的有效途徑 。級(jí)聯(lián)途徑是一類(lèi)傳遞胞外和胞內(nèi)信號(hào)到細(xì)胞響應(yīng)的重要蛋白激酶 ,其在植物的生物和非生物脅迫響應(yīng)中發(fā)揮著極為重要的作用。研究發(fā)現(xiàn) ,級(jí)聯(lián)系統(tǒng)在各種逆境反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。該研究利用熒光定量方法分析了、和南瓜白粉病病原菌誘導(dǎo)感病和抗病甜瓜基因在葉片中的表達(dá)模式 。試驗(yàn)結(jié)果表明 ,在甜瓜葉片中 ,基因參與由、和南瓜白粉病病原菌介導(dǎo)的植物抗病防衛(wèi)反應(yīng)的基本信號(hào)通路 。分析經(jīng)過(guò)、南瓜白粉病病原菌在不同處理時(shí)間條件下處理誘導(dǎo)基因的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn) ,與處理后相比 ,、南瓜白粉病病原菌處理誘導(dǎo)抗病甜瓜和 種基因的表達(dá)量均上調(diào) ,分別在、達(dá)到最大 ;、南瓜白粉病病原菌處理誘導(dǎo)感病甜瓜 種基因的表達(dá)量均上調(diào) ,分別在、達(dá)到最大 ;、南瓜白粉病病原菌處理誘導(dǎo)感病甜瓜基因的表達(dá)量均上調(diào) ,分別在、達(dá)到最大 。說(shuō)明基因?qū)τ诓煌奶幚頃r(shí)間響應(yīng)機(jī)制不同 。隨著時(shí)間延長(zhǎng)基因表達(dá)量也不同 。白粉病作為甜瓜的主要真菌性病害 ,抗白粉病基因的挖掘是目前研究的熱點(diǎn)之一。在甜瓜中有關(guān)抗白粉病基因的研究十分有限 ,該研究主要分析了、和南瓜白粉病病原菌誘導(dǎo)感病和抗病甜瓜葉片中基因的表達(dá)模式 。初步判斷其在甜瓜葉片中的表達(dá)模式 。今后可以甜瓜為試材 ,進(jìn)一步明確抗白粉病相關(guān)基因是如何通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控對(duì)白粉病的抗性 。參考文獻(xiàn)王迪 ,田麗美 ,李德澤 甜瓜白粉病苗期接種方法和接種濃度的研究 北方園藝 ,():李冰 ,趙玉龍 ,朱強(qiáng)龍 ,等 甜瓜白粉病抗病基因的定位及候選基因分析 中國(guó)蔬菜 ,():沈佳 ,壽偉松 ,張躍建 甜瓜果實(shí)主要數(shù)量性狀的配合力分析 中國(guó)瓜菜 ,():張計(jì)育 ,佟兆國(guó) ,高志紅 、和蘋(píng)果輪紋病病原菌誘導(dǎo)湖北海棠 基因的表達(dá) 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué) ,(): , , , () ,:袁輝 ,楊勝 ,周文霞 級(jí)聯(lián)信號(hào)通路與長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),():姜翠茹 ,沈曉艷 ,王增蘭 擬南芥 磷酸酶在脅迫反應(yīng)中的新功能 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) ,():孔祥遠(yuǎn) ,陳冠旭 ,秦貴龍 ,等 花生 基因的篩選和鹽脅迫分析 華北農(nóng)學(xué)報(bào) ,():張雪穎 棉花 和 基因家族的全基因組鑒定和功能分析 南京 :南京農(nóng)業(yè)大學(xué) ,劉俊丹參 基因的克隆及表達(dá)分析楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué) ,張興坦煙草 基因的功能研究重慶:重慶大學(xué) ,于瑩 ,陳宏宇 ,程莉莉 ,等亞麻 基因克隆及鹽堿脅迫下的表達(dá)分析 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) ,(): , , , ,:王苗苗 ,于杰 ,鐘云 ,等外源 誘導(dǎo)下 基因在采后柑橘果實(shí)抗綠霉病中的表達(dá)分析 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué) ,():郭慧敏 ,翟偉卜 ,鄭娜 ,等 基因家族成員在棉花抗黃萎病中 的 功 能 分 析 中 國(guó) 科 學(xué) :生 命 科 學(xué) ,(): , , , 第 期北方園藝 ,(): , , , , , ,(): , , ,(): , , , , ,():姚軍 ,耿新麗 ,張翠環(huán) ,等對(duì)溫室甜瓜白粉病預(yù)防效果的影響 中國(guó)瓜菜 ,():,毛云 ,陳剛剛 ,王賢磊 ,等新疆甜瓜品種白粉病抗病基因初步定位 北方園藝 ,(): , , , ,(): , , , ,():于瑩 ,陳宏宇 ,程莉莉亞麻 基因克隆及鹽堿脅迫下的表達(dá)分析 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) ,(): , , : ,(): , , , , ,(): , ,():郭言言南瓜抗白粉病相關(guān)基因的分離及功能研究新鄉(xiāng) :河南科技學(xué)院 , , , , , ( , , ; , ): , () , , , , , , , , :; ; 北方園藝月 (下 )

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