北方園藝（）： ·研究論文 ·第一作者簡(jiǎn)介 ：辛董董 （），男 ，碩士研究生 ，研究方向?yàn)閳@藝植物生理特性及生物技術(shù)育種 。：責(zé)任作者 ：李桂榮 （），女 ，博士 ，副教授 ，現(xiàn)主要從事園藝植物育種與生物技術(shù)教學(xué)與科研等工作 。：基金項(xiàng)目 ：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 （）；河南省自然基金資助項(xiàng)目 （）；河南省高校重點(diǎn)科研資助項(xiàng)目 （）。收稿日期 ：甜瓜基因的表達(dá)分析辛 董 董，李 桂 榮，郭 衛(wèi) 麗，鄭 秋 云，耿 新 麗（河南科技學(xué)院 園藝園林學(xué)院，河南 新鄉(xiāng)；新疆鄯善葡萄瓜果研究所，新疆 鄯善）摘要 ：以 “哈密加格達(dá) ”甜瓜為試材 ，采用實(shí)時(shí)定量（）方法 ，研究了水楊酸 （）、乙烯利 （）和南瓜白粉病病原菌處理甜瓜葉片的基因的表達(dá)情況 ，以期為甜瓜基因的調(diào)控功能研究及甜瓜抗白粉病育種提供參考依據(jù) 。結(jié)果表明 ：處理抗病甜瓜葉片后 的、 個(gè)基因的表達(dá)上調(diào) ，基因表達(dá)量最大 ，處理感病甜瓜葉片、后的表達(dá)量上調(diào) ；處理抗病甜瓜葉片后、 個(gè)基因的表達(dá)量上調(diào)明顯 ，基因表達(dá)量最大 ，處理感病甜瓜葉片后基因的表達(dá)量最大 ；南瓜白粉病孢子處理抗甜瓜葉片后基因的表達(dá)量上調(diào)最明顯 ；南瓜白粉病孢子處理感病甜瓜葉片后基因的表達(dá)量上調(diào)明顯 ，綜上所述 ，在甜瓜葉片中、南瓜白粉病病原菌均可以誘導(dǎo)該基因的表達(dá) 。其中 ，、分別在處理抗病甜瓜葉片后和處理感病甜瓜葉片、后能夠響應(yīng)的誘導(dǎo) ；能夠響應(yīng)和南瓜白粉病孢子的誘導(dǎo) 。關(guān)鍵詞 ：甜瓜 ；甜瓜白粉病 ；基因 ；表達(dá)分析中圖分類(lèi)號(hào) ： 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ： 文章編號(hào) ：（）甜瓜白粉病是在瓜類(lèi)作物上廣泛發(fā)生的重要病害之一 ，在世界各地甜瓜主要生產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生 ，不論是露地還是保護(hù)地栽培 ，在甜瓜生產(chǎn)過(guò)程中預(yù)防不到位均將造成甜瓜植株葉片大面積枯死 ，導(dǎo)致甜瓜產(chǎn)量和品質(zhì)嚴(yán)重下降。目前在甜瓜生產(chǎn)上主要靠噴施農(nóng)藥防治甜瓜白粉病 ，這不僅在栽培上增加了勞動(dòng)力 ，并且增加防病成本，采用化學(xué)防病會(huì)造成環(huán)境污染 ，不利于生產(chǎn)有機(jī)果品 ，也不利于人與自然和諧共處 ，對(duì)生態(tài)環(huán)境造成破壞 ，更重要的是長(zhǎng)期使用化學(xué)殺菌劑易使病原菌產(chǎn)生抗藥性。因此 ，研究如何利用甜瓜抗病基因 ，篩選優(yōu)異抗病基因資源用于抗病新品種的培育 ，是從根本上解決甜瓜白粉病病害的一種有效途徑。植物中的絲裂原活化蛋白激酶 （）能夠被多種生物和非生物脅迫誘導(dǎo) ，參與植物生長(zhǎng) 、發(fā)育和脅迫應(yīng)答的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程 ，是信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)部的重要傳遞者 ，能將外界各種刺激信號(hào) （如高鹽脅迫 、低溫脅迫 ）傳導(dǎo)到細(xì)胞內(nèi) ，誘導(dǎo)相應(yīng)基因表達(dá) ，是一組能被不同的細(xì)胞外刺激 （如細(xì)胞因子 、神經(jīng)遞質(zhì) 、激素 、細(xì)胞應(yīng)激及細(xì)胞黏附 ）激活的絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶 。由于是培養(yǎng)細(xì)胞在受到生長(zhǎng)因子等絲裂原刺激時(shí)被激活而被鑒定的 ，因而得名。與其它信號(hào)分子組成級(jí)聯(lián)途徑 ，通過(guò)依次磷酸 化 將 逆 境 信 號(hào) 傳 遞 下 去 ，即。目前 ，科學(xué)家已從擬南芥、花生、棉花、丹參、煙草、亞麻等植 物 中 分 離 得 到基 因 ，研 究 表 明 ，基因與植物抗逆性有密切關(guān)系，但是 ，甜瓜基因還沒(méi)有相關(guān)方面報(bào)道 。近幾年植物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的研究多集中在擬南芥等模式植物中 ，而且級(jí)聯(lián)反應(yīng)途徑是參與植物耐鹽生理調(diào)控的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一 ，在瓜類(lèi)植物研究較少。一些瓜類(lèi)植物與擬南芥等進(jìn)化關(guān)系比較遠(yuǎn) ，因此 ，研究瓜類(lèi)植物的信號(hào)途徑 ，可以從抗逆植物入手 ，以全面了解不同習(xí)性植物的抗逆分子途徑。該研究選取抗白粉病的高代自交系和感病的甜瓜作為試驗(yàn)材料 ，通過(guò)水楊酸 （）、乙烯利（）和南瓜白粉病病原菌分別處理感病和抗病甜瓜 ，利用熒光定量方法分析了基因在葉片中的表達(dá)模式 ，進(jìn)而研究基因在病原真菌侵染過(guò)程中的表達(dá)規(guī)律 ，鑒定與抗病性最為相關(guān)的一個(gè)或多個(gè)基因 ，篩選甜瓜抗白粉病相關(guān)基因 ，以期為甜瓜的抗病育種提供思路。 材料與方法 試驗(yàn)材料供試甜瓜抗病品種 “哈密加格達(dá) ”（）及感病品種 （）種子由新疆鄯善葡萄瓜果研究所提供 ；水楊酸 （）、乙烯利 （）購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司 ；南瓜白粉病病原菌采自河南科技學(xué)院試驗(yàn)田中自然發(fā)病的南瓜病株 ，中國(guó)南瓜高抗白粉病自交系 和高感白粉病自交系 “九江轎頂 ”，保存于河南科技學(xué)院南瓜團(tuán)隊(duì) 。 試驗(yàn)方法 試驗(yàn)設(shè)計(jì)種子播種萌發(fā)獲得片真葉后 ，分別用·水楊酸 （）、·乙烯利 （）噴灑于甜瓜葉片表面 ，每個(gè)處理株苗 ，重復(fù)次 。將南瓜白粉病病原菌接種于培養(yǎng)基 ，培養(yǎng)周后 ，利用黑光燈照射培養(yǎng) ，誘導(dǎo)南瓜白粉病病原菌孢子的產(chǎn)生 。取南瓜白粉病病原 菌 分 生 孢 子 ，制 成 孢 子 濃 度 約 為×個(gè) ·懸浮液 ，噴灑于甜瓜葉片表面 ，分別處理、后 ，取其葉片 ，迅速置于液氮中冷凍后 ，放置在條件下進(jìn)行保存?zhèn)溆?。 總的提取利用通用植物快速提取試劑盒 的方法提取總。提取稀釋倍 ，測(cè)定值 ，計(jì)算濃度 。再取總進(jìn)行電泳 ，觀察條帶 。 反轉(zhuǎn)錄模板以為 模 板 ，參 照 的操作說(shuō)明書(shū)完成第一條鏈的合成 。 基因的篩選將稀釋到·。在離心管中依次加入上游引物 、下游引物 、· 、 做混合樣 ，分別取加入離心管中 ，之后分別加入經(jīng)過(guò)水楊酸（）、乙烯利 （）、南瓜白粉病病原菌在不同時(shí)間條件處理的感病和抗病甜瓜葉片的模板。反應(yīng)程序 ：預(yù)變性，然后進(jìn)行以下循環(huán) ，變性，退火，延伸，共個(gè)循環(huán) 。最后延伸，保持 。實(shí)時(shí)定量引物如表所示 ，引物由奧科鼎盛生物有限公司合成 。采用的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行基因檢測(cè) 。表 實(shí)時(shí)定量特異引物序列 編號(hào)序列（） 甜瓜基因片段的擴(kuò)增取一個(gè)的離心管依次加 入、上游引物 、下游引物 、模 板 、 ，充分混勻 ，在孔板子里分別加北方園藝月 （下 ）入混合樣 ，再分別加入 模板 ，按照上述反應(yīng)體系每個(gè)處理的模板重復(fù)次 。在已經(jīng)加好反應(yīng)液的孔板子上附上膜 。離心后取出 。反應(yīng)程序 ：預(yù)變性，然后進(jìn)行以下循環(huán) ，變性，退火，延伸，。 數(shù)據(jù)分析實(shí)時(shí)定量試驗(yàn)數(shù)據(jù)均為次重復(fù)的平均值 ，采用 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理 ，采 用 軟 件 進(jìn) 行做圖 。 結(jié)果與分析 甜瓜總的提取由圖可知 ，總呈現(xiàn)出條清晰可區(qū)分的條帶 ，個(gè)條帶的亮度比值為，表明未降解 ，可以用于后續(xù)試驗(yàn) 。注 ：樣品處理時(shí)間分別為 、。： ，圖 乙烯利處理感病甜瓜葉片總 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果 甜瓜基因在、和南瓜白粉病病原菌孢子誘導(dǎo)條件下表達(dá)特性分析 誘導(dǎo)甜瓜基因在感病和抗病甜瓜葉片中的表達(dá)分析由圖可知 ，處理對(duì)抗病甜瓜的葉片的和基因的表達(dá)有顯著影響 ，與相比 ，處理、后 ，種基因的表達(dá)量均上調(diào) ，其中 ，基因表達(dá)量最高 ，與相比 ，分別增加、倍 ；基因次 之 ；基 因 表 達(dá) 量 最 小 。表 明、 種基因能夠響應(yīng)的誘導(dǎo) 。由圖可知 ，感病甜瓜的葉片經(jīng)處理后 ，基因的表達(dá)量上調(diào) ，其 中 ，在、處理后表達(dá)量分別達(dá)到最大 ，與相比 ，基 因 分 別 增 加、倍 ，、基因的表達(dá)變化不大 ，表明基因能夠響應(yīng)的誘導(dǎo) 。圖 熒光定量分析 處理抗病甜瓜葉片后的基因表達(dá) 圖 熒光定量分析 處理感病甜瓜葉片后的基因表達(dá) 誘導(dǎo)甜瓜基因在感病和抗病甜瓜葉片中的表達(dá)分析由圖可知 ，抗病甜瓜葉片經(jīng)過(guò)處理、后基因相對(duì)表達(dá)量上調(diào)明顯 ，與 第 期北方園藝處理相比 ，抗病甜瓜葉片經(jīng)處理、后基因相對(duì)表達(dá)量分別增 加 了、倍 ；基因在處理后表達(dá)量上調(diào)明顯 ，與處理相比 ，相對(duì)表達(dá)量增加了倍 ，表明、 個(gè)基因均可以響應(yīng)的誘導(dǎo) 。由圖可知 ，經(jīng)處理后 ，感病甜瓜葉片和 種基因的相對(duì)表達(dá)量均上調(diào) ，其中在處理、后相對(duì)表達(dá)量上調(diào)明顯 ，處理后上調(diào)最明顯 ，與處理相比 ，感病甜瓜葉片經(jīng)過(guò)處理后基因相對(duì)表達(dá)量增加了倍 ，并且基 因 的 表 達(dá) 量 優(yōu) 于基 因 ，、 個(gè)基因均可以響應(yīng)的誘導(dǎo) 。圖 熒光定量分析 處理抗病甜瓜葉片后的基因表達(dá) 圖 熒光定量分析 處理感病甜瓜葉片后的基因表達(dá) 甜瓜基因在南瓜白粉病孢子誘導(dǎo)條件下的表達(dá)特征分析由圖可知 ，抗病甜瓜葉片經(jīng)病原菌處理后 ，、和 種基因的相對(duì)表達(dá)量分別在處理后達(dá)到最大 ，其中 ，基因的表達(dá)量上調(diào)最為明顯 ，與處理相比 ，增加倍 ；基因的相對(duì)表達(dá)量次之 ，基因的相對(duì)表達(dá)量最最低 。表明、 個(gè)基因均能夠響應(yīng)南瓜白粉病孢子的誘導(dǎo) 。由圖可知 ，南瓜白粉病病原菌孢 子 處 理 感 病 甜 瓜 葉 片、后、和 種基因的相對(duì)表達(dá)量逐漸增加 ，處理后均達(dá)到最大值 ；基因的表達(dá)量與處理相比 ，增加了倍 ，基因的表達(dá)量次之 ，圖 熒光定量分析南瓜白粉病病原菌誘導(dǎo)抗病甜瓜葉片后的 基因的表達(dá) 圖 熒光定量分析南瓜白粉病病原菌誘導(dǎo)感病甜瓜葉片后的 基因表達(dá) 北方園藝月 （下 ）基因的表達(dá)量最低 。其中 ，南瓜白粉病孢子處理感病 甜 瓜 葉 片后、和 種 基 因 的 表 達(dá) 量 分 別 降 低 ，表 明、 種基因均能夠響應(yīng)南瓜白粉病孢子的誘導(dǎo) 。 討論與結(jié)論基因在植物中能夠響應(yīng)各種生物以及非生物的脅迫 ，不僅可以通過(guò)磷酸化修飾被激活 ，而且還可以在水平上被激活 ，并且可以參與植物抵抗逆境脅迫的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程 。等研究表明 ，在植物干旱和熱脅迫時(shí) ，低濃度的在干旱和熱脅迫應(yīng)答過(guò)程中對(duì)過(guò)表達(dá) 的擬南芥有正調(diào) 控 作 用 。冷 脅 迫下 ，介導(dǎo)番茄低溫脅迫下的表達(dá) ，在擬南 芥 過(guò) 表 達(dá)能增強(qiáng)煙草的耐低溫性。在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中遭遇逆境是不可避免的 ，尤其是干旱 、病原菌 、溫差等嚴(yán)重影響植物生長(zhǎng)和產(chǎn)量 。甜瓜白粉病在瓜類(lèi)作物上廣泛發(fā)生 ，進(jìn)行篩選甜瓜優(yōu)異抗病基因資源用于抗病新品種的培育 ，是從根本上解決甜瓜白粉病病害的有效途徑 。級(jí)聯(lián)途徑是一類(lèi)傳遞胞外和胞內(nèi)信號(hào)到細(xì)胞響應(yīng)的重要蛋白激酶 ，其在植物的生物和非生物脅迫響應(yīng)中發(fā)揮著極為重要的作用。研究發(fā)現(xiàn) ，級(jí)聯(lián)系統(tǒng)在各種逆境反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。該研究利用熒光定量方法分析了、和南瓜白粉病病原菌誘導(dǎo)感病和抗病甜瓜基因在葉片中的表達(dá)模式 。試驗(yàn)結(jié)果表明 ，在甜瓜葉片中 ，基因參與由、和南瓜白粉病病原菌介導(dǎo)的植物抗病防衛(wèi)反應(yīng)的基本信號(hào)通路 。分析經(jīng)過(guò)、南瓜白粉病病原菌在不同處理時(shí)間條件下處理誘導(dǎo)基因的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn) ，與處理后相比 ，、南瓜白粉病病原菌處理誘導(dǎo)抗病甜瓜和 種基因的表達(dá)量均上調(diào) ，分別在、達(dá)到最大 ；、南瓜白粉病病原菌處理誘導(dǎo)感病甜瓜 種基因的表達(dá)量均上調(diào) ，分別在、達(dá)到最大 ；、南瓜白粉病病原菌處理誘導(dǎo)感病甜瓜基因的表達(dá)量均上調(diào) ，分別在、達(dá)到最大 。說(shuō)明基因?qū)τ诓煌奶幚頃r(shí)間響應(yīng)機(jī)制不同 。隨著時(shí)間延長(zhǎng)基因表達(dá)量也不同 。白粉病作為甜瓜的主要真菌性病害 ，抗白粉病基因的挖掘是目前研究的熱點(diǎn)之一。在甜瓜中有關(guān)抗白粉病基因的研究十分有限 ，該研究主要分析了、和南瓜白粉病病原菌誘導(dǎo)感病和抗病甜瓜葉片中基因的表達(dá)模式 。初步判斷其在甜瓜葉片中的表達(dá)模式 。今后可以甜瓜為試材 ，進(jìn)一步明確抗白粉病相關(guān)基因是如何通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控對(duì)白粉病的抗性 。參考文獻(xiàn)王迪 ，田麗美 ，李德澤 甜瓜白粉病苗期接種方法和接種濃度的研究 北方園藝 ，（）：李冰 ，趙玉龍 ，朱強(qiáng)龍 ，等 甜瓜白粉病抗病基因的定位及候選基因分析 中國(guó)蔬菜 ，（）：沈佳 ，壽偉松 ，張躍建 甜瓜果實(shí)主要數(shù)量性狀的配合力分析 中國(guó)瓜菜 ，（）：張計(jì)育 ，佟兆國(guó) ，高志紅 、和蘋(píng)果輪紋病病原菌誘導(dǎo)湖北海棠 基因的表達(dá) 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué) ，（）： ， ， ， （） ，：袁輝 ，楊勝 ，周文霞 級(jí)聯(lián)信號(hào)通路與長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，（）：姜翠茹 ，沈曉艷 ，王增蘭 擬南芥 磷酸酶在脅迫反應(yīng)中的新功能 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) ，（）：孔祥遠(yuǎn) ，陳冠旭 ，秦貴龍 ，等 花生 基因的篩選和鹽脅迫分析 華北農(nóng)學(xué)報(bào) ，（）：張雪穎 棉花 和 基因家族的全基因組鑒定和功能分析 南京 ：南京農(nóng)業(yè)大學(xué) ，劉俊丹參 基因的克隆及表達(dá)分析楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué) ，張興坦煙草 基因的功能研究重慶：重慶大學(xué) ，于瑩 ，陳宏宇 ，程莉莉 ，等亞麻 基因克隆及鹽堿脅迫下的表達(dá)分析 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) ，（）： ， ， ， ，：王苗苗 ，于杰 ，鐘云 ，等外源 誘導(dǎo)下 基因在采后柑橘果實(shí)抗綠霉病中的表達(dá)分析 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué) ，（）：郭慧敏 ，翟偉卜 ，鄭娜 ，等 基因家族成員在棉花抗黃萎病中 的 功 能 分 析 中 國(guó) 科 學(xué) ：生 命 科 學(xué) ，（）： ， ， ， 第 期北方園藝 ，（）： ， ， ， ， ， ，（）： ， ， ，（）： ， ， ， ， ，（）：姚軍 ，耿新麗 ，張翠環(huán) ，等對(duì)溫室甜瓜白粉病預(yù)防效果的影響 中國(guó)瓜菜 ，（）：，毛云 ，陳剛剛 ，王賢磊 ，等新疆甜瓜品種白粉病抗病基因初步定位 北方園藝 ，（）： ， ， ， ，（）： ， ， ， ，（）：于瑩 ，陳宏宇 ，程莉莉亞麻 基因克隆及鹽堿脅迫下的表達(dá)分析 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào) ，（）： ， ， ： ，（）： ， ， ， ， ，（）： ， ，（）：郭言言南瓜抗白粉病相關(guān)基因的分離及功能研究新鄉(xiāng) ：河南科技學(xué)院 ， ， ， ， ， （ ， ， ； ， ）： ， （） ， ， ， ， ， ， ， ， ：； ； 北方園藝月 （下 ）