草莓葉片再生體系的建立.pdf
<p>-6- 草莓葉片再生體系的建立 王 禹，于 飛，譚 巍，劉萬達 (黑龍江省農(nóng)科院園藝分院，黑龍江 哈爾濱 150069) 摘 要： 以草莓 紅顏和 章姬的葉片為外植體，研究暗培養(yǎng)時間、不同植物激素及濃度對不定芽 誘導(dǎo)的影響，不同植物激素種類濃度及繼代次數(shù)對不定芽增殖的影響，以及組培苗生根的最佳培養(yǎng)基。 結(jié)果表明：草莓葉片不定芽誘導(dǎo)的最適宜培養(yǎng)基為 MS+3 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2,4-D，暗培養(yǎng)天數(shù) 15 20 d；不定芽增殖的最適宜培養(yǎng)基為2 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA， 紅顏組培苗適宜繼代4代， 章姬組培苗適宜繼代5次；MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA生根效果最好。 關(guān)鍵詞：草莓；暗培養(yǎng)；不定芽再生；增殖系數(shù) 草莓屬于薔薇科草莓屬(Fragaria ananassa Duch.) 多年生草本植物，果實香嫩多汁、酸甜適口，富含多 種維生素、微量元素和有機酸，既可以鮮食也可以加 工成果汁、果醬及罐頭，是一種經(jīng)濟價值較高的水果， 在世界范圍內(nèi)被廣泛栽培，是當(dāng)今世界七大水果之一。 2011年我國草莓栽培面積及產(chǎn)量已躍居世界第一位。 隨著栽培面積的增大，對草莓優(yōu)質(zhì)種苗的需求量 呈上升趨勢。草莓種苗傳統(tǒng)的繁育方式為無性繁殖， 即匍匐莖繁殖和母株分株繁殖。在繁殖過程中極易感 染病毒，從而造成草莓品種的種性退化，出現(xiàn)果實變 小、品質(zhì)變劣、產(chǎn)量降低等現(xiàn)象 1 。草莓種苗繁育采 用組織培養(yǎng)方法可以解決以上缺點。草莓莖尖、匍匐 莖尖、葉片等均可通過培養(yǎng)獲得再生植株，且繁殖系 數(shù)高、生長周期短，可在短時間內(nèi)獲得大量無毒苗 木，可為商品化生產(chǎn)提供優(yōu)質(zhì)種苗。 1 試驗材料 本試驗采用草莓品種 紅顏和 章姬鮮嫩葉 片為外植體，采集地點為黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝 分院智能化溫室。試驗采用的培養(yǎng)基均為MS或1/2 MS+生長激素+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂，pH值5.8。 2 試驗內(nèi)容與方法 2.1 暗培養(yǎng)時間對不定芽誘導(dǎo)的影響 將采集的鮮嫩葉片用自來水流沖洗30 min，置 于超凈工作臺中，酒精消毒40 s，蒸餾水沖洗2次， 0.1%的升汞(添加吐溫34滴)消毒6 min，蒸 餾水沖洗3次，沿著主葉脈方向切成0.51 cm× 第一作者簡介：王 禹(1982-)，女，碩士，助理研究 員；從事植物組織培養(yǎng)研究。 項目來源：哈爾濱市青年后備人才A類(2016RAQYJ069)， 草莓莖尖超低溫脫毒與種苗繁育。 0.51 cm大小，葉正面朝下，接種到MS+3 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2,4-D不定芽再生培養(yǎng)基上。暗 培養(yǎng)時間分別為10 d、15 d、20 d、25 d，轉(zhuǎn)至光 照培養(yǎng)35 d、30 d、25 d、20 d，分別調(diào)查不定芽 再生情況。 2.2 不同生長激素對不定芽誘導(dǎo)的影響 不定芽再生培養(yǎng)基生長激素采用TDZ、6-BA、 2,4-D。將接種完的葉片置于暗培養(yǎng)15 d，轉(zhuǎn)至光 照培養(yǎng)30 d，分別調(diào)查不定芽再生情況。 2.3 不同生長激素對不定芽增殖的影響 將不定芽從葉片切下，切成直徑不超過1 cm的 叢狀，轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基上，生長激素采用TDZ、 6-BA、NAA，分別調(diào)查不定芽增殖情況，每30 d 繼代1次。 2.4 繼代次數(shù)對不定芽增殖的影響 草莓瓶內(nèi)增殖次數(shù)過多，會出現(xiàn)種性退化，導(dǎo)致 種苗品質(zhì)下降，因此應(yīng)選取適宜的繼代次數(shù)。將不定 芽從葉片切下，切成直徑不超過1 cm的叢狀，轉(zhuǎn)接 到增殖培養(yǎng)基上，每30 d繼代1次，繼代2次后調(diào) 查不定芽增殖情況。 2.5 不同生長激素對組培苗生根的影響 選取長成1 cm高的叢生芽，切成直徑不超過 1 cm的叢狀，轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上，生長激素采用 6-BA、IBA、NAA，分別調(diào)查組培苗生根情況。 3 結(jié)果與分析 3.1 適宜不定芽誘導(dǎo)暗培養(yǎng)時間 表1結(jié)果表明，暗培養(yǎng)15 d后光照培養(yǎng)30 d， 暗培養(yǎng)20 d后光照培養(yǎng)25 d，30 d時陸續(xù)有不定 芽產(chǎn)生，芽生長快，呈綠色；暗培養(yǎng)10 d后光照培 養(yǎng)35 d，暗培養(yǎng)25 d后光照培養(yǎng)20 d，45 d后仍 繼續(xù)產(chǎn)生不定芽，但芽發(fā)黃，生長速度慢。因此，草 莓葉片暗培養(yǎng)天數(shù)選擇1520 d最適宜。 -7- 中國園藝文摘 2018 年第 2 期 表1 暗培養(yǎng)時間對不定芽誘導(dǎo)的影響 品種 暗培養(yǎng)時間 不定芽再生比率(%) 不定芽生長勢 紅顏 暗培養(yǎng)10 d后光照培養(yǎng)35 d 37.3 40 d分化出不定芽，分化慢，芽呈黃綠色，外植體易形成 愈傷不產(chǎn)生不定芽 暗培養(yǎng)15 d后光照培養(yǎng)30 d 51.6 30 d分化出不定芽，分化快，芽呈綠色，外植體易形成愈 傷不產(chǎn)生不定芽 暗培養(yǎng)20 d后光照培養(yǎng)25 d 52.3 30 d分化出不定芽，分化快，芽呈綠色，外植體易形成愈 傷不產(chǎn)生不定芽 暗培養(yǎng)25 d后光照培養(yǎng)20 d 46.9 40 d分化出不定芽，分化慢，芽呈綠色，外植體易形成愈 傷不產(chǎn)生不定芽 章姬 暗培養(yǎng)10 d后光照培養(yǎng)35 d 50.8 40 d分化出不定芽，分化慢，芽呈綠色，外植體易形成愈 傷不產(chǎn)生不定芽 暗培養(yǎng)15 d后光照培養(yǎng)30 d 65.3 30 d分化出不定芽，分化快，芽呈綠色 暗培養(yǎng)20 d后光照培養(yǎng)25 d 66.7 30 d分化出不定芽，分化快，芽呈綠色 暗培養(yǎng)25 d后光照培養(yǎng)20 d 59.9 40 d分化出不定芽，分化慢，芽呈綠色 3.2 適宜不定芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基篩選 表2結(jié)果表明，隨著6-BA、TDZ濃度的升高， 不定芽分化速度加快，30 d時陸續(xù)有不定芽產(chǎn)生， 以MS+3 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2,4-D培養(yǎng)基 組合45 d時芽誘導(dǎo)率最高。45 d后各培養(yǎng)基組合仍 繼續(xù)產(chǎn)生不定芽，但芽發(fā)黃；6-BA、TDZ使用濃度 高，外植體形成大面積愈傷組織，且褐化嚴(yán)重，不易 分化不定芽。因此，不定芽誘導(dǎo)的最適宜培養(yǎng)基為 MS+3 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2,4-D。 表2 生長激素對不定芽誘導(dǎo)的影響 品種 培養(yǎng)基組合 不定芽再生比率(%) 不定芽生長勢 紅顏 MS+1 mg/L TDZ+0.2 mg/L 2,4-D 28.6 30 d開始分化不定芽，芽呈綠色 MS+2 mg/L TDZ+0.2 mg/L 2,4-D 30.5 30 d開始分化不定芽，芽呈綠色 MS+3 mg/L TDZ+0.2 mg/L 2,4-D 33.6 30 d開始分化不定芽，芽呈綠色 MS+1 mg/L 6-BA+1 mg/L TDZ 17.3 40 d開始分化不定芽，芽呈黃綠色，外植體易 形成愈傷，不易分化不定芽 MS+1 mg/L 6-BA+2 mg/L TDZ 31.6 40 d分化出不定芽，芽呈黃綠色，外植體易形 成愈傷，不易分化不定芽 MS+2 mg/L 6-BA+2 mg/L TDZ 35.8 30 d分化出不定芽，芽呈黃綠色，外植體形成 大面積愈傷組織且褐化嚴(yán)重 MS+1 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2,4-D 30.4 30 d開始分化不定芽，芽呈綠色 MS+2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2,4-D 50.6 30 d開始分化不定芽，芽呈綠色 MS+3 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2,4-D 52.3 30 d開始分化不定芽，芽呈綠色 章姬 MS+1 mg/L TDZ+0.2 mg/L 2,4-D 38.6 30 d開始分化不定芽，芽呈綠色 MS+2 mg/L TDZ+0.2 mg/L 2,4-D 40.8 30 d開始分化不定芽，芽呈綠色 MS+3 mg/L TDZ+0.2 mg/L 2,4-D 43.6 30 d開始分化不定芽，芽呈綠色 MS+1 mg/L 6-BA+1 mg/L TDZ 18.3 40 d開始分化不定芽，芽呈黃綠色，外植體易 形成愈傷，不易分化不定芽 MS+1 mg/L 6-BA+2 mg/L TDZ 20.6 40 d分化出不定芽，芽呈黃綠色，外植體易形 成愈傷，不易分化不定芽 MS+2 mg/L 6-BA+2 mg/L TDZ 30.6 30 d分化出不定芽，芽呈黃綠色，外植體形成 大面積愈傷組織且褐化嚴(yán)重 MS+1 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2,4-D 32.4 30 d開始分化不定芽，芽呈綠色 MS+2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2,4-D 60.6 30 d開始分化不定芽，芽呈綠色 MS+3 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2,4-D 65.3 30 d開始分化不定芽，芽呈綠色 -8- 3.3 適宜不定芽增殖的培養(yǎng)基篩選 表3結(jié)果表明，隨著6-BA、TDZ濃度的升高， 不定芽增殖系數(shù)增高，增殖速度加快。雖然TDZ增 殖效果比6-BA好，但是會導(dǎo)致芽發(fā)黃，生長發(fā)育 不良。因此，不定芽增殖最適宜的培養(yǎng)基為2 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA。 表3 生長激素對不定芽增殖的影響 品種 培養(yǎng)基組合 不定芽增殖系數(shù) 不定芽生長勢 紅顏 MS+1 mg/L 6-BA 1.0 不定芽增殖慢，呈綠色 MS+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA 1.0 不定芽增殖慢，呈綠色，易產(chǎn)生根 MS+2 mg/L 6-BA 2.0 不定芽增殖快，呈綠色 MS+2 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA 3.6 不定芽增殖快，呈綠色 MS+3 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA 2.9 不定芽增殖快，呈黃綠色 MS+1 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA 1.3 不定芽增殖快，呈綠色 MS+2 mg/L TDZ 3.1 不定芽增殖快，呈綠色 MS+2 mg/L TDZ+0.3 mg/L NAA 3.9 不定芽增殖快，呈綠色 MS+3 mg/L TDZ+0.3 mg/L NAA 4.5 不定芽增殖快，呈黃綠色 章姬 MS+1 mg/L 6-BA 1.0 不定芽增殖慢，呈綠色 MS+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA 1.0 不定芽增殖慢，呈綠色，易產(chǎn)生根 MS+2 mg/L 6-BA 2.2 不定芽增殖快，呈綠色 MS+2 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA 4.3 不定芽增殖快，呈綠色 MS+3 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA 3.5 不定芽增殖快，呈黃綠色 MS+1 mg/L TDZ+0.1 mg/L NAA 1.6 不定芽增殖快，呈綠色 MS+2 mg/L TDZ 3.8 不定芽增殖快，呈黃綠色 MS+2 mg/L TDZ+0.3 mg/L NAA 4.9 不定芽增殖快，呈黃綠色 MS+3 mg/L TDZ+0.3 mg/L NAA 5.6 不定芽增殖快，呈黃綠色 3.4 繼代次數(shù)對不定芽增殖的影響 表4結(jié)果表明， 紅顏從繼代第5代開始不定 芽變細(xì)弱，第6代開始芽開始發(fā)黃；章姬從繼代 第6代開始不定芽變細(xì)弱，第7代開始芽開始發(fā)黃， 即使轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基上，苗依舊細(xì)弱，影響組培苗馴 化成活率。因此， 紅顏組培苗適宜繼代4代， 章 姬組培苗適宜繼代5次。 表4 繼代次數(shù)對不定芽增殖的影響 品種 繼代次數(shù) 不定芽增殖系數(shù) 不定芽生長勢 紅顏 3 3.6 不定芽健壯，呈綠色 4 3.6 不定芽健壯，呈綠色 5 2.9 不定芽細(xì)弱，呈綠色 6 2.0 不定芽細(xì)弱，呈黃綠色 7 2.0 不定芽細(xì)弱，呈黃綠色 章姬 3 4.3 不定芽健壯，呈綠色 4 4.3 不定芽健壯，呈綠色 5 4.3 不定芽健壯，呈綠色 6 3.2 不定芽細(xì)弱，呈綠色 7 2.0 不定芽細(xì)弱，呈黃綠色 3.5 適宜組培苗生根生長激素篩選 表5結(jié)果表明，MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA生根效果最好，低濃度的6-BA和NAA有益 于促進組培苗生根。 4 結(jié)論與討論 草莓葉片不定芽誘導(dǎo)的最適宜培養(yǎng)基為MS+ 3 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2,4-D，暗培養(yǎng)天數(shù)15 20 d， 紅顏不定芽誘導(dǎo)率可達到52.3%，章姬 不定芽誘導(dǎo)率可達到65.3%；不定芽增殖的最適宜培 養(yǎng)基為2 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA，紅顏 組培苗適宜繼代4代， 章姬組培苗適宜繼代5次； MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA生根效果 最好。 不定芽誘導(dǎo)過程中各處理在45 d后仍繼續(xù)產(chǎn)生 不定芽，但芽發(fā)黃，生長速度慢，因此，應(yīng)選擇45 d 內(nèi)出芽最快和苗生長良好的處理。6-BA、TDZ使用 濃度高，外植體易形成大面積愈傷組織，且褐化嚴(yán) 重，不易分化不定芽；雖然TDZ增殖效果比6-BA 好，但是會導(dǎo)致芽發(fā)黃，生長發(fā)育不良。培養(yǎng)基選擇 激素和濃度種類時，要根據(jù)苗的生長勢確定。 紅顏 繼代從第5代， 章姬從第6代開始不定芽開始變 細(xì)弱，即使轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基上，苗依舊細(xì)弱，影響組 -9- 中國園藝文摘 2018 年第 2 期 培苗馴化成活率。因此， 紅顏組培苗繼代4代后， 章姬組培苗繼代5次后，建議2次剝離莖尖或者 壯苗2代后再繼續(xù)增殖。在相同培養(yǎng)基上，不同品種 生長勢有差異，本試驗中 章姬生長勢比 紅顏生 長勢強，應(yīng)根據(jù)不同品種選擇不同培養(yǎng)基， 紅顏 更適宜的培養(yǎng)基應(yīng)進一步探討。 表5 生長激素對組培苗生根的影響 品種 培養(yǎng)基組合 生根條數(shù)(條) 組培苗生長勢 紅顏 MS+0.2 mg/L IBA 0 組培苗生長慢，葉色濃綠 1/2 MS+0.2 mg/L IBA 0 組培苗生長慢，葉色濃綠 MS+0.3 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA 3 葉色濃綠，根生長快 1/2 MS+0.3 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA 3 葉色濃綠，根生長快 0.1 mg/L NAA 2 葉色濃綠，根生長慢 1/2 MS+0.1 mg/L NAA 2 葉色濃綠，根生長慢 MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA 4 葉色濃綠，根生長快 MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA 4 葉色濃綠，根生長快 1/2 MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA 4 葉色濃綠，根生長快 章姬 MS+0.2 mg/L IBA 0 組培苗生長慢，葉色濃綠 1/2 MS+0.2 mg/L IBA 0 組培苗生長慢，葉色濃綠 MS+0.3 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA 3 葉色濃綠，根生長快 1/2 MS+0.3 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA 3 葉色濃綠，根生長快 0.1 mg/L NAA 2 葉色濃綠，根生長慢 1/2 MS+0.1 mg/L NAA 2 葉色濃綠，根生長慢 MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA 5 葉色濃綠，根生長快 MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA 5 葉色濃綠，根生長快 1/2 MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA 5 葉色濃綠，根生長快 Regeneration system establishment of strawberry leaves WANG Yu, YU Fei, TAN Wei, LIU Wan-da Abstract: Taking the leaves of strawberry (Benihope and Zhangji) as explants, we studied the influence of dark incubation time, different plant growth regulator and concentrations on the adventitious bud induction; the effects of different plant growth of regulator and concentrations, and subculture times on adventitious bud proliferation; and the best medium for rooting seedlings. The results show that the optimum medium for adventitious bud regeneration of strawberry leaves is MS + 3 mg/L 6-BA + 0.2 mg/L 2, 4-D; dark training can promote in vitro shoot regeneration in 15 to 20 d; the best adventitious bud proliferation culture medium is 2 mg/L 6 - BA + 0.3 mg/L NAA, adventitious bud proliferation of Benihope are suitable for secondary 4 generations, and adventitious bud proliferation of Zhangji are suitable for secondary 5 generations; the best rooting culture medium is MS + 0.5 mg/L 6 - BA + 0.05 mg/L NAA. Key words: strawberry; dark culture; adventitious bud regeneration; proliferation coefficient</p>
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