南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 學(xué) 報(bào) 2018,41(2):240-247 http:/nauxb.njau.edu.cnJ o u r n a l o f N a n j i n g A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y DOI:10.7685/jnau.201705022收 稿 日 期 :2017-05-15 基 金 項(xiàng) 目 : 國 家 自 然 科 學(xué) 基 金 項(xiàng) 目(31471886); 國 家973 計(jì) 劃 子 課 題 項(xiàng) 目(2009CB119001-04); 江 蘇 省 農(nóng) 業(yè) 科 技 支 撐 項(xiàng) 目(BE2012325) 作 者 簡 介 : 張 飛 雪, 碩 士 研 究 生。 通 信 作 者: 李 英, 教 授, 研 究 方 向 為 蔬 菜 分 子 生 物 學(xué) 與 遺 傳 育 種,E-mail:yinglinjau.edu.cn。 張 飛 雪, 虞 章 紅, 劉 坤 宇, 等. 不 結(jié) 球 白 菜 醛 酮 還 原 酶 B c A K R 4 C 9 基 因 的 克 隆 及 表 達(dá) 分 析J. 南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 學(xué) 報(bào),2018,41(2):240-247. 不 結(jié) 球 白 菜 醛 酮 還 原 酶 B c A K R 4 C 9 基 因 的 克 隆 及 表 達(dá) 分 析 張 飛 雪, 虞 章 紅, 劉 坤 宇, 文 鍇, 王 建 軍, 侯 喜 林, 李 英 ( 南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 園 藝 學(xué) 院/ 作 物 遺 傳 與 種 質(zhì) 創(chuàng) 新 國 家 重 點(diǎn) 實(shí) 驗(yàn) 室/ 農(nóng) 業(yè) 部 華 東 地 區(qū) 園 藝 作 物 生 物 學(xué) 與 種 質(zhì) 創(chuàng) 新 重 點(diǎn) 實(shí) 驗(yàn) 室, 江 蘇 南 京210095) 摘 要 : 目 的 本 文 旨 在 探 究 醛 酮 還 原 酶AKR4C 亞 家 族 B c A K R 4 C 9 基 因 在 不 同 激 素 處 理 及 逆 境 脅 迫 中 的 表 達(dá) 模 式, 從 而 分 析 B c A K R 4 C 9 基 因 在 不 結(jié) 球 白 菜 作 物 中 的 生 長 代 謝 和 逆 境 脅 迫 中 可 能 發(fā) 揮 的 作 用。 方 法 以 不 結(jié) 球 白 菜 蘇 州 青 為 材 料, 克 隆 了 B c A K R 4 C 9 基 因 的 全 長, 應(yīng) 用 生 物 信 息 學(xué) 分 析 了 其 氨 基 酸 序 列, 并 通 過 實(shí) 時(shí) 熒 光 定 量PCR 技 術(shù) 分 析 B c A K R 4 C 9 基 因 在 不 同 組 織, 高 溫、 低 溫、NaCl 脅 迫、 傷 害 脅 迫, 以 及 水 楊 酸、 茉 莉 酸 甲 酯 和 脫 落 酸 等 處 理 下 的 基 因 表 達(dá) 變 化。 結(jié) 果 序 列 分 析 表 明, B c A K R 4 C 9 基 因 包 含1 個(gè) 長 度 為948bp 的 開 放 式 閱 讀 框(ORF), 編 碼315 個(gè) 氨 基 酸。 氨 基 酸 序 列 多 重 比 對 和 進(jìn) 化 樹 分 析 表 明, B c A K R 4 C 9 與 其 他 植 物 A K R 4 C 9 基 因 同 源 性 較 高, 具 有 高 度 保 守 性。 熒 光 定 量PCR 分 析 表 明, B c A K R 4 C 9 在 葉 片 中 的 表 達(dá) 量 高 于 根 中, 高 溫 和 低 溫 處 理 下 表 達(dá) 上 調(diào), 且 具 有 相 似 的 表 達(dá) 模 式。 在020g·L -1 NaCl 質(zhì) 量 濃 度 范 圍 內(nèi) 基 因 相 對 表 達(dá) 量 隨NaCl 質(zhì) 量 濃 度 的 升 高 而 升 高, 傷 害 處 理 后 能 夠 迅 速 產(chǎn) 生 應(yīng) 激 響 應(yīng), 并 能 夠 被 水 楊 酸、 茉 莉 酸 甲 酯 和 脫 落 酸 誘 導(dǎo) 表 達(dá)。 結(jié) 論 不 結(jié) 球 白 菜 B c A K R 4 C 9 基 因 能 夠 被 不 同 激 素 誘 導(dǎo) 表 達(dá), 并 且 參 與 到 多 種 逆 境 脅 迫 響 應(yīng)。 關(guān) 鍵 詞 : 不 結(jié) 球 白 菜; 醛 酮 還 原 酶AKR4C 亞 家 族; 序 列 分 析; 非 生 物 脅 迫 中 圖 分 類 號(hào) :S634.3 文 獻(xiàn) 標(biāo) 志 碼 :A 文 章 編 號(hào) :1000-2030 (2018 )02-0240-08 Cloningandexpressionanalysisofaldo-ketoreductasegene B c A K R 4 C 9fromnon-headingChinesecabbage ZHANGFeixue,YUZhanghong,LIUKunyu,WENKai,WANGJianjun,HOUXilin,LIYing (CollegeofHorticulture/StateKeyLaboratoryofCropGeneticsandGermplasmEnhancement/ KeyLaboratoryofBiologyandGermplasmEnhancementofHorticulturalCropsinEastChina, MinistryofAgriculture,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China) Abstract:ObjectivesThepurposeofthisstudywastoexploretheexpressionpatternof B c A K R 4 C 9geneofAKR4Csubfamily underdifferenthormonetreatmentsandstressconditions,soastoanalyzethepossibleroleof B c A K R 4 C 9geneingrowthdevelopment andstressinnon-headingChinesecabbage.MethodsThewholecDNAsequence B c A K R 4 C 9genewasclonedfromnon-heading ChinesecabbageSuzhouqing,anditsaminoacidsequencewasanalyzedbybioinformatics,andreal-timefluorescencequantitative PCRtechnologywasusedtoexploreitsexpressionpatternunderdifferenttissues,differentstressconditions(hightemperature,low temperature,NaCl stress,wound stress)and different hormone treatments(salicylic acid,methyl jasmonate and abscisic acid). ResultsThesequenceanalysisshowedthatthe B c A K R 4 C 9genecontainedanopenreadingframe(ORF)withalengthof948bp, encoding315aminoacids.Theaminoacidsequencemultiplealignmentandmappingphylogenetictreeshowedthat B c A K R 4 C 9gene washighlyhomologoustothe A K R 4 C 9genesfromotherplantsandhighlyconserved.Real-timefluorescencequantitativePCRanaly- sisshowedthattheexpressionof B c A K R 4 C 9geneintheleaveswashigherthanthatintheroots,anditwasup-regulatedathigh temperatureandlowtemperatureandhadsimilarexpressionpatterns.Itsexpressionincreasedwiththeincreaseofsaltconcentration from0to20g·L -1 . Theexpressionof B c A K R 4 C 9alsocouldbeinducedbysalicylicacid,methyljasmonateandabscisicacid. ConclusionsThenon-headingChinesecabbage B c A K R 4 C 9genecanbeinducedbydifferenthormonesandisinvolvedinavariety ofstressresponses. Keywords:non-headingChinesecabbage;aldo-ketoreductaseAKR4Csubfamily;sequenceanalysis;abioticstress 第2 期 張 飛 雪, 等: 不 結(jié) 球 白 菜 醛 酮 還 原 酶 B c A K R 4 C 9 基 因 的 克 隆 及 表 達(dá) 分 析在 植 物 生 長 發(fā) 育 的 各 個(gè) 階 段, 植 物 會(huì) 不 可 避 免 地 遇 到 一 些 生 物 和 非 生 物 脅 迫 1 。 研 究 表 明: 植 物 在 遭 遇 非 生 物 脅 迫 時(shí), 活 性 氧 與 活 性 乙 醛 水 平 增 加, 導(dǎo) 致 植 物 的 脅 迫 誘 導(dǎo) 損 傷 2 , 為 了 清 除 植 物 體 內(nèi) 產(chǎn) 生 的 活 性 氧、 活 性 乙 醛 等 有 毒 物 質(zhì), 植 物 會(huì) 利 用 大 量 具 有 氧 化 還 原 活 性 的 酶 類 使 有 毒 物 質(zhì) 分 解 為 毒 性 較 小 的 乙 醇 和 碳 水 化 合 物 3 , 而 醛 酮 還 原 酶(AKR) 家 族 通 常 催 化 醛、 酮、 類 固 醇 以 及 其 他 羰 基 化 合 物 的 還 原 3 。 AKR 家 族 在 逆 境 防 御 中 起 重 要 作 用, 能 夠 被 多 種 逆 境 脅 迫 誘 導(dǎo) 4-7 ; 在 植 物 中 它 們 起 著 反 應(yīng) 性 醛 解 毒、 滲 透 壓 生 成 和 次 級(jí) 代 謝 物 合 成 的 關(guān) 鍵 作 用 8 。 AKR 家 族, 是 以NADP(H) 為 輔 酶 而 催 化 一 系 列 醛 酮 底 物 發(fā) 生 氧 化 還 原 反 應(yīng), 具 有 經(jīng) 典 的(/)8 桶 狀 折 疊 結(jié) 構(gòu), 在 進(jìn) 化 上 高 度 保 守。 其 中,(/)8 桶 狀 結(jié) 構(gòu) 羧 基 端 的3 個(gè) 環(huán)(LooPA、LooPB、LooPC) 的 不 同 組 成 和 大 小 決 定 了 其 底 物 的 特 異 性 9 。 AKR 催 化 活 性 位 點(diǎn) 是 由N 末 端(Asp50、Tyr55、Lys84) 所 構(gòu) 成 9 , 催 化 四 聯(lián) 體(Asp50、Tyr55、Lys84、His117) 被 認(rèn) 為 是 醛 酮 還 原 酶 負(fù) 責(zé) 底 物 催 化 的 關(guān) 鍵 氨 基 酸 10 ; 另 外, 發(fā) 現(xiàn)C 末 端 形 成 的 高 度 保 守 的 氨 基 酸 殘 基(Ser271、Arg276) 在 輔 因 子 結(jié) 合 中 起 重 要 作 用 9 。 AKR4C 亞 家 族 與 植 物 的 耐 受 性 相 關(guān) 3 。 AKR4C 能 夠 被 高CO 2 濃 度 和 高 光 照 下 誘 導(dǎo) 表 達(dá), 使 細(xì) 胞 內(nèi) 光 合 速 率 增 強(qiáng) 11 。 在 單 子 葉 植 物 中 首 先 鑒 定 到 的AKR4C1 被 認(rèn) 為 是 耐 旱 性 相 關(guān) 的 蛋 白 并 能 夠 被 脫 落 酸 誘 導(dǎo) 表 達(dá) 12 。 A K R 4 C 9 為AKR4C 亞 家 族 的 成 員, 在 逆 境 脅 迫 中 能 夠 起 到 醛 酮 解 毒 的 作 用 13 , 被 認(rèn) 為 是 保 護(hù) 植 物 免 受 應(yīng) 激 氧 化 脅 迫 的 重 要 的 候 選 基 因 3 。 在 大 麥 中 過 表 達(dá) 擬 南 芥 A K R 4 C 9 基 因 可 以 在 氧 化 脅 迫 和 鎘 脅 迫 中 增 強(qiáng) 其 醛 酮 解 毒 反 應(yīng), 轉(zhuǎn) 基 因 植 株 呼 吸 速 率 降 低, 葉 綠 素 含 量 增 加 并 且 光 合 速 率 提 高 13 ; 山 梨 醇 濃 度 相 對 于 野 生 型 提 高24 倍, 其 耐 寒 性 和 再 生 能 力 得 到 顯 著 提 高 14 。 本 研 究 以 不 結(jié) 球 白 菜 品 種 蘇 州 青 為 試 驗(yàn) 材 料, 克 隆 了 A K R 4 C 9 同 源 基 因, 并 且 進(jìn) 行 了 相 關(guān) 的 生 物 信 息 學(xué) 分 析。 利 用 實(shí) 時(shí) 熒 光 定 量PCR 技 術(shù) 分 別 測 定 了 高 溫、 低 溫、NaCl、 傷 害 處 理 下 的 基 因 表 達(dá) 水 平, 以 及 在 脫 落 酸、 茉 莉 酸 甲 酯 和 水 楊 酸 激 素 處 理 下 基 因 的 表 達(dá) 變 化, 旨 在 進(jìn) 一 步 了 解 B c A K R 4 C 9 基 因 在 不 結(jié) 球 白 菜 中 的 功 能。 1 材 料 與 方 法 1.1 材 料 及 處 理 供 試 材 料 為 不 結(jié) 球 白 菜( B r a s s i c a c a m p e s t r i sssp. c h i n e n s i sMakino) 品 種 蘇 州 青, 由 南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 園 藝 學(xué) 院 不 結(jié) 球 白 菜 課 題 組 提 供。 將 蘇 州 青 種 植 于 南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 人 工 氣 候 室, 在 植 株4 葉1 心 期 時(shí), 選 取 生 長 整 齊 一 致 的 幼 苗 作 為 試 驗(yàn) 材 料。 以42 熱 激 和4 低 溫 處 理 幼 苗,處 理 設(shè) 備 為RXZ 智 能 型 人 工 氣 候 培 養(yǎng) 箱, 光 照 強(qiáng) 度 為100mol·m -2 ·s -1 , 處 理 后0、4、6、8 和24h 取 樣,每 處 理10 株,3 次 重 復(fù)。 在 每 片 葉 上 打3 個(gè) 孔 ( 保 留 圓 片 不 致 脫 離, 孔 徑 大 小 為1cm) 作 為 傷 害 處 理, 未 打 孔 的 作 為 對 照, 分 別 在0、4、8、12 和24h 后 取 樣, 每 處 理10 株,3 次 重 復(fù)。 分 別 以5、10、15、20、25g·L -1 的NaCl 溶 液 噴 灑 葉 片 背 面, 以 清 水 為 對 照, 然 后 用 透 光 塑 料 罩 罩 住, 處 理12h 后 取 樣, 每 處 理10 株,3 次 重 復(fù)。 選 用2mmol·L -1 水 楊 酸(SA)、50mol·L -1 茉 莉 酸 甲 酯(JA) 和50mol·L -1 脫 落 酸(ABA) 溶 液 分 別 噴 施4 葉1 心 期 的 葉 片, 然 后 用 透 光 塑 料 罩 罩 住, 處 理 時(shí) 間 為 0、4、8、12 和24h, 每 處 理10 株,3 次 重 復(fù)。 材 料 收 集 后 液 氮 速 凍, 存 放-80 保 存 備 用。 1.2 RNA 的 提 取 與cDNA 的 合 成 RNA 提 取 試 劑 盒 購 自 天 根 生 化 科 技 有 限 公 司, 具 體 方 法 參 照RpPureNApre 植 物 總RNA 提 取 試 劑 盒 說 明 書。 用 蘇 州 青 葉 片 的 總RNA 為 模 板, 按 照PrimeScriptRT 試 劑 盒(TaKaRa) 說 明 書 反 轉(zhuǎn) 錄 合 成cDNA。 1.3 不 結(jié) 球 白 菜 B c A K R 4 C 9 基 因 的 克 隆 根 據(jù) 大 白 菜 數(shù) 據(jù) 庫(http:/brassicadb.org/brad/searchGene.php) 的 基 因 序 列 編 號(hào)Bra000018, 利 用 PrimerPremier6.0 軟 件 設(shè) 計(jì)1 對 引 物, 引 物 分 別 為AKR4C9-F:ATGGCTAACGCAATTAGAT,AKR4C9-R: TTATATCTCGCCATCCCATAAGT。 以 不 結(jié) 球 白 菜 蘇 州 青 葉 片cDNA 作 為 模 板 進(jìn) 行PCR 反 應(yīng), 反 應(yīng) 體 系 按 照TaKaRa 公 司 的 r T a q 酶 說 明 書 進(jìn) 行。 反 應(yīng) 程 序 為:955min;9530s,5830s,721min, 35 個(gè) 循 環(huán);7210min,4 保 存。 PCR 產(chǎn) 物 進(jìn) 行 瓊 脂 糖 凝 膠 電 泳 檢 測, 用DNA 凝 膠 回 收 試 劑 盒 對 目 的 片 段 進(jìn) 行 回 收、 純 化。 回 收 產(chǎn) 物 用T 4 -DNA 連 接 酶 連 接 到pMD18-T-simple 載 體, 連 接 產(chǎn) 物 轉(zhuǎn) 化 大 腸 桿 菌 DH5( 由 本 實(shí) 驗(yàn) 室 保 存), 涂 于 氨 芐 青 霉 素 抗 性 的LB 平 板37 暗 培 養(yǎng)12h, 挑 取 陽 性 單 克 隆 送 到 南 京 金 斯 瑞 生 物 科 技 有 限 公 司 測 序 分 析。 1 4 2 南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 學(xué) 報(bào) 第41 卷 1.4 序 列 分 析 用BioEdit 軟 件 查 找 不 結(jié) 球 白 菜 B c A K R 4 C 9 基 因 序 列 的 開 放 閱 讀 框(ORF)。 不 同 物 種AKRC49 的 氨 基 酸 序 列 從NCBI(http:/www.ncbi.nih.gov/)GenBank 數(shù) 據(jù) 庫 中 搜 索 獲 得, 同 源 性 計(jì) 算 利 用NCBI 網(wǎng) 站 BLAST 程 序。 氨 基 酸 編 碼 的 蛋 白 質(zhì) 相 對 分 子 質(zhì) 量、 理 論 等 電 點(diǎn)、 不 穩(wěn) 定 指 數(shù) 等 通 過 在 線 軟 件Protparam tool(http:/web.Expasy.org/protparam/) 完 成。 疏 水 性 預(yù) 測 采 用 ProtScale(http:/web.expasy.org/ protscale/), 信 號(hào) 肽 預(yù) 測 采 用Signalp4.0(http:/www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/), 跨 膜 區(qū) 域 預(yù) 測 采 用 TMHMM2.0(http:/www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/), 蛋 白 質(zhì) 二 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 預(yù) 測 采 用SOPMA(http:/ pbil.ibcp.fr/) 等 在 線 工 具。 蛋 白 質(zhì) 三 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 分 析 通 過SWISS-MODEL(https:/www.swissmodel.expasy. org/) 完 成。 多 重 序 列 比 對 通 過DNAMAN6.0 進(jìn) 行, 進(jìn) 化 樹 構(gòu) 建 用MEGA5.2 軟 件 15 進(jìn) 行。 1.5 實(shí) 時(shí) 熒 光 定 量PCR 實(shí) 時(shí) 熒 光 定 量PCR 體 系 參 照SYBRPrimeScriptRT-PCRKit 試 劑 盒(TaKaRa,Japan) 說 明 書。 內(nèi) 參 基 因 為 A c t i n( 登 錄 號(hào):AF111812), 內(nèi) 參 引 物 序 列 為 A c t i n-F:GTTGCTATCCAGGCTGTTCT, A c t i n-R:AGCGT- GAGGAAGAGCATAAC; A K R4 C 9 引 物 序 列 為qAKR4C9-F:GCCGCAGCTGTTAAGATCGGAT;qAKR4C9-R: GGTCATGATCCGTACACCAG。 PCR 程 序 采 用 兩 步 法:95 30s;95 5s,60 30s,40 個(gè) 循 環(huán); 設(shè) 置 65 到95 的 熔 解 曲 線。 目 標(biāo) 基 因 表 達(dá) 量 的 計(jì) 算 按 照 C T 法。 相 對 表 達(dá) 量 等 于2 - C T , 即 相 對 定 量 是 基 于 對 照 和 處 理 之 間, 目 標(biāo) 基 因 和 內(nèi) 參 基 因 表 達(dá) 量 的 比 值。 所 得 數(shù) 據(jù) 用Excel2010 軟 件 分 析。 圖1 不 結(jié) 球 白 菜 B c A K R 4 C 9 基 因 的 核 苷 酸 序 列 及 其 編 碼 的 氨 基 酸 序 列 Fig1 Nucleotidesequenceanditsencodedaminoacidsequenceof B c A K R 4 C 9gene fromnon-headingChinesecabbage方 框 內(nèi) 為 催 化 四 聯(lián) 體(Asp47、Tyr52、Lys81、His114) 位 點(diǎn)。 Theboxisacatalyticresidue(Asp47,Tyr52, Lys81,andHis114)locus. 2 結(jié) 果 與 分 析 2.1 不 結(jié) 球 白 菜 B c A K R 4 C 9 基 因 的 克 隆 和 序 列 分 析 測 序 結(jié) 果 表 明: 不 結(jié) 球 白 菜 B c A K R 4 C 9 基 因 與 擬 南 芥 序 列 長 度 一 致, 序 列 相 似 度 為88.7%, 包 含1 個(gè) 長 度 為948bp 的 開 放 式 閱 讀 框(ORF), 編 碼315 個(gè) 氨 基 酸, 包 含AKR 家 族 共 有 的 催 化 四 聯(lián) 體(Asp47、 Tyr52、Lys81、His114)( 圖1)。 預(yù) 測 該 基 因 編 碼 蛋 白 質(zhì) 相 對 分 子 質(zhì) 量 為35.126×10 3 , 理 論 等 電 點(diǎn) 為6.61, 不 穩(wěn) 定 指 數(shù) 為39.81, 屬 于 不 穩(wěn) 定 蛋 白。 ProtScale 親/ 疏 水 性 預(yù) 測 顯 示: 該 蛋 白 屬 于 疏 水 性 蛋 白( 圖2), 總 平 2 4 2 第2 期 張 飛 雪, 等: 不 結(jié) 球 白 菜 醛 酮 還 原 酶 B c A K R 4 C 9 基 因 的 克 隆 及 表 達(dá) 分 析 均 疏 水 指 數(shù)(GRAVY) 為-0.440。 該 蛋 白 無 信 號(hào) 肽, 也 無 分 泌 蛋 白, 并 且 不 存 在 跨 膜 區(qū) 域。 蛋 白 二 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 預(yù) 測 結(jié) 果 顯 示: 其 主 要 為 螺 旋, 無 規(guī) 則 卷 曲, 分 別 占39.37% 和31.11%, 其 余 為 轉(zhuǎn) 角 和 延 伸 鏈。 以 擬 南 芥AKR4C9 的 結(jié) 構(gòu) 為 模 型, 利 用SWISS-MODEL 進(jìn) 行 同 源 建 模, 預(yù) 測 了 其 三 維 空 間 結(jié) 構(gòu)。 由 圖3 可 以 看 出:AKR4C9 在 不 結(jié) 球 白 菜 與 擬 南 芥 中 具 有 相 似 的 三 維 空 間 結(jié) 構(gòu), 都 擁 有 醛 酮 還 原 酶 所 具 備 的8 個(gè)(/) 8 桶 狀 折 疊 結(jié) 構(gòu), 螺 旋 在 外 圍, 折 疊 在 里 面, 中 間 形 成 一 個(gè) 疏 水 結(jié) 構(gòu)。 其 晶 體 結(jié) 構(gòu) 揭 示 了 底 物 結(jié) 合 位 點(diǎn) 的 開 放 性 和 適 應(yīng) 性 與 廣 泛 的 底 物 特 征 相 關(guān) 3 。 圖2 不 結(jié) 球 白 菜BcAKR4C9 氨 基 酸 序 列 親/ 疏 水 性 預(yù) 測 Fig2 PredictedhydrophilicandhydrophobicpropertiesofBcAKR4C9aminoacidsequences fromnon-headingChinesecabbage 圖3 不 結(jié) 球 白 菜 與 擬 南 芥AKR4C9 蛋 白 的 三 維 結(jié) 構(gòu) 模 型 比 較 Fig3 TertiarystructurepredictionofAKR4C9fromnon-headingChinesecabbageand A r a b i d o p s i s t h a l i a n aLooPA、LooPB、LooPC 分 別 為(/)8 桶 狀 結(jié) 構(gòu) 羧 基 端 的3 個(gè) 環(huán)。 下 同。 LooPA,LooPB,LooPCrepresentthethreeringsof thecarboxylterminalofthe(/)8barrelstructure,respectively.Thesameasfollows. 2.2 不 結(jié) 球 白 菜 B c A K R 4 C 9 基 因 編 碼 的 氨 基 酸 序 列 同 源 性 和 系 統(tǒng) 進(jìn) 化 分 析 利 用BLASTp 對 B c A K R 4C 9 基 因 推 導(dǎo) 的 氨 基 酸 序 列 進(jìn) 行 同 源 性 檢 索 與 多 重 比 對, 結(jié) 果( 圖4) 顯 示, 其 與 蘿 卜(XP 018465613.1)、 歐 洲 油 菜(CDY64988.1) 和 大 白 菜(XP 009133204.1) 相 似 性 達(dá)95% 以 上, 與 擬 南 芥 (3H7U)、 亞 麻 芥(XP 010509278.1) 相 似 性 分 別 為90% 和89%; 與 中 棉(XP 012458618.1)、 蘋 果 (XP 008387826.1)、 野 草 莓(XP 004302704.1)、 葡 萄(XP 002273035.1)、 可 可(XP 007026918.2) 的 相 似 性 均 在80% 以 上, 表 明 同 科 植 物 的 氨 基 酸 序 列 相 似 度 較 高。 該 基 因 具 有 保 守 的 結(jié) 構(gòu) 區(qū) 域, 并 且 比 對 結(jié) 果 發(fā) 現(xiàn) LooPA、LooPB、LooPC 這3 個(gè) 環(huán) 在 不 同 的 物 種 中 存 在 氨 基 酸 的 不 同( 圖3), 不 結(jié) 球 白 菜 與 擬 南 芥 相 比 較 LooPA 中117 位 點(diǎn) 處 由 丙 氨 酸 變 為 纈 氨 酸, 在LooPB 中 不 結(jié) 球 白 菜 與 擬 南 芥 不 存 在 氨 基 酸 的 變 異, 而 LooPC 中 主 要 在291、292、293 氨 基 酸 位 點(diǎn) 處 由 亮 氨 酸、 天 冬 酰 胺、 丙 氨 酸 分 別 改 變 為 纈 氨 酸、 蘇 氨 酸 和 甘 氨 酸。 與 以 上 序 列 比 對 中 的 植 物 物 種 進(jìn) 行 同 源 進(jìn) 化 分 析 并 構(gòu) 建 進(jìn) 化 樹, 結(jié) 果( 圖5) 顯 示: 十 字 花 科 的 擬 南 芥、 亞 麻 芥、 大 白 菜、 不 結(jié) 球 白 菜、 油 菜 各 自 聚 集 在 同 一 分 支 中, 而 薔 薇 科 的 蘋 果、 野 草 莓 同 樣 聚 集 在 同 一 分 支 中。 3 4 2 南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 學(xué) 報(bào) 第41 卷 圖4 不 結(jié) 球 白 菜BcAKR4C9 與 其 他 物 種 氨 基 酸 序 列 同 源 性 比 對 Fig4 AlignmentofaminoacidsequencesofBcAKR4C9andhomologsfromotherplants 4 4 2 第2 期 張 飛 雪, 等: 不 結(jié) 球 白 菜 醛 酮 還 原 酶 B c A K R 4 C 9 基 因 的 克 隆 及 表 達(dá) 分 析 圖5 不 結(jié) 球 白 菜 與 其 他 植 物BcAKR4C9 氨 基 酸 序 列 的 系 統(tǒng) 進(jìn) 化 樹 Fig5 PhylogenetictreeofBcAKR4C9ofnon-headingChinesecabbageandotherplants 圖6 不結(jié)球 白菜 B c A K R 4 C 9 基因 在 不 同組織 中 的 相 對 表 達(dá) 量 Fig6 Relativeexpressionlevelof B c A K R 4 C 9 geneindifferenttissuesfrom non-headingChinesecabbage 2.3 不 結(jié) 球 白 菜 B c A K R 4 C 9 基 因 在 不 同 組 織 及 不 同 脅 迫 、 不 同 激 素 處 理 下 的 表 達(dá) 分 析 由 圖6 可 見: 不 結(jié) 球 白 菜 B c A K R 4 C 9 在 根 和 葉 片 中 均 有 表 達(dá), 在 葉 中 的 表 達(dá) 量 要 高 于 根 中。 由 圖7 可 見: 高 溫 和 低 溫 脅 迫 處 理 均 能 使 不 結(jié) 球 白 菜 B c A K R 4 C 9 基 因 的 表 達(dá) 量 升 高, 且 高 溫 和 低 溫 處 理 下, B c A K R 4 C 9 具 有 相 似 的 表 達(dá) 趨 勢, 即 在12h 表 達(dá) 量 達(dá) 到 最 高, 隨 后 表 達(dá) 水 平 有 所 降 低。 在020g·L -1 NaCl 質(zhì) 量 濃 度 范 圍 內(nèi), B c A K R 4 C 9 基 因 表 達(dá) 水 平 隨NaCl 質(zhì) 量 濃 度 的 升 高 而 升 高, 當(dāng)NaCl 為20g·L -1 時(shí), 基 因 相 對 表 達(dá) 量 達(dá) 到 初 始 量 的70 倍 左 右。 傷 害 處 理4h, 該 基 因 表 達(dá) 量 明 顯 上 升, 而12h 后 該 基 因 表 達(dá) 量 則 低 于 對 照 水 平。 圖7 不 結(jié) 球 白 菜 B c A K R 4 C 9 基 因 在 不 同 脅 迫 條 件 下 的 相 對 表 達(dá) 水 平 Fig7 Relativeexpressionlevelof B c A K R 4 C 9geneinnon-headingChinesecabbageunderdifferentstresses 5 4 2 南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 學(xué) 報(bào) 第41 卷由 圖8 可 見: 水 楊 酸、 脫 落 酸、 茉 莉 酸 甲 酯 均 能 誘 導(dǎo) 不 結(jié) 球 白 菜 B c A K R 4 C 9 基 因 的 表 達(dá)。 水 楊 酸 和 茉 莉 酸 甲 酯 處 理 下, 該 基 因 具 有 相 似 的 表 達(dá) 趨 勢, 即 在 處 理4h 后 表 達(dá) 量 明 顯 上 升, 之 后 表 達(dá) 量 下 降, 至24h 又 急 劇 升 高。 脫 落 酸 處 理12h 時(shí), 該 基 因 相 對 表 達(dá) 量 急 劇 增 加,24h 時(shí) 又 明 顯 下 降。 圖8 不 結(jié) 球 白 菜 B c A K R 4 C 9 基 因 在 不 同 激 素 處 理 后 的 相 對 表 達(dá) 水 平 Fig8 Relativeexpressionlevelof B c A K R 4 C 9geneinnon-headingChinesecabbageunderdifferenthormones SA: 水 楊 酸Salicylicacid;JA: 茉 莉 酸 甲 酯Methyljasmonate;ABA: 脫 落 酸Abscisicacid. 3 討 論 擬 南 芥 A K R 4 C 9 基 因 被 認(rèn) 為 是 植 物AKR 家 族 中 一 個(gè) 保 護(hù) 植 物 免 受 應(yīng) 激 氧 化 脅 迫 的 重 要 候 選 基 因 8 , 對 其 酶 動(dòng) 力 學(xué) 參 數(shù) 研 究 表 明AKR4C9 可 以 活 化 類 固 醇, 降 解 糖 類 和 一 系 列 脂 肪 醛 等 化 合 物,X-ray 晶 體 結(jié) 構(gòu) 構(gòu) 建 也 證 明 了 其 具 有 廣 泛 的 底 物 特 征, 并 且 比 其 他AKR 亞 家 族 成 員 有 更 開 放 和 更 適 宜 的 催 化 活 性 位 點(diǎn) 3 。 因 此 A K R 4 C 9 同 源 基 因 可 以 作 為 重 要 經(jīng) 濟(jì) 作 物 培 育 多 抗 品 種 的 目 標(biāo) 4 。 本 研 究 從 不 結(jié) 球 白 菜 蘇 州 青 中 克 隆 到 B c A K R 4 C 9 基 因, 發(fā) 現(xiàn) 與 擬 南 芥 基 因 序 列 具 有 較 高 同 源 性, 其 序 列 相 似 度 為88.7%, 序 列 同 源 性 比 對 表 明 A K R C 49 基 因 具 有 保 守 的 結(jié) 構(gòu) 區(qū) 域。 蛋 白 進(jìn) 化 樹 分 析 發(fā) 現(xiàn) 不 結(jié) 球 白 菜 與 同 屬 于 十 字 花 科 的 蘿 卜、 油 菜 進(jìn) 化 距 離 較 近, 且 同 屬 于 一 個(gè) 分 支, 同 屬 于 薔 薇 科 的 蘋 果 和 野 草 莓 也 被 分 到 同 一 分 支 上, 并 且 與 鼠 李 科 的 棗 具 有 相 對 較 近 的 進(jìn) 化 距 離。 同 屬 于 錦 葵 目 的 錦 葵 科 中 棉 與 梧 桐 科 的 可 可 樹 也 具 有 相 對 較 近 的 進(jìn) 化 距 離, 并 在 同 一 進(jìn) 化 分 支 上, 可 以 看 出 各 科 的 進(jìn) 化 關(guān) 系 均 比 較 保 守。 通 過 蛋 白 三 級(jí) 結(jié) 構(gòu) 的 預(yù) 測 分 析 發(fā) 現(xiàn) 擬 南 芥 與 不 結(jié) 球 白 菜 具 有 相 似 的 空 間 結(jié) 構(gòu), 某 些 氨 基 酸 改 變 并 沒 有 改 變AKR4C9 的 構(gòu) 象, 推 測 其 存 在 相 似 功 能。 本 研 究 通 過 對 B c A K R 4 C 9 基 因 的4 低 溫 處 理 和42 熱 激 處 理 發(fā) 現(xiàn) 不 結(jié) 球 白 菜 B c A K R 4 C 9 基 因 具 有 相 似 的 表 達(dá) 趨 勢, 推 測 該 基 因 在 低 溫 和 高 溫 的 脅 迫 響 應(yīng) 中 可 能 具 有 一 致 的 響 應(yīng) 模 式, 推 測 A K R 基 因 與 醛 酮 解 毒 的 作 用 有 關(guān), 其 調(diào) 控 機(jī) 制 有 待 進(jìn) 一 步 明 確。 通 過 不 同 濃 度 的NaCl 處 理 發(fā) 現(xiàn), 在020g·L -1 的 NaCl 質(zhì) 量 濃 度 范 圍 內(nèi), 該 基 因 表 達(dá) 量 隨NaCl 質(zhì) 量 濃 度 升 高 而 升 高。 在 麻 風(fēng) 樹 中 表 達(dá) J c A K R 基 因 的 細(xì) 菌 和 酵 母 細(xì) 胞 對NaCl(200mmol·L -1 )、 甲 基 乙 二 醛(MG,5mmol·L -1 ) 處 理 有 更 高 的 耐 受 性 16 , 表 明 A K R 基 因 在 非 生 物 脅 迫 耐 受 性 中 發(fā) 揮 作 用。 本 研 究 發(fā) 現(xiàn) 不 結(jié) 球 白 菜 B c A K R 4 C 9 基 因 能 夠 被 水 楊 酸、 脫 落 酸 和 茉 莉 酸 甲 酯 誘 導(dǎo) 表 達(dá), 脫 落 酸 處 理12h, 表 達(dá) 量 迅 速 達(dá) 到 峰 值, 隨 后 又 迅 速 下 降 到 接 近 對 照 水 平。 A K R 在 多 種 作 物 中 被 證 明 能 夠 被 脫 落 酸 誘 導(dǎo) 表 達(dá) 17 。 目 前 關(guān) 于 該 基 因 與 不 同 激 素 之 間 的 作 用 并 未 見 報(bào) 道。 由 于 非 生 物 脅 迫 為 降 低 作 物 產(chǎn) 量 的 重 要 因 素 1 , 因 此 提 高 作 物 的 抗 逆 性 已 經(jīng) 成 為 育 種 工 作 的 重 要 目 標(biāo) 之 一。 不 結(jié) 球 白 菜 在 長 江 中 下 游 及 以 南 地 區(qū) 被 廣 泛 種 植 18 , 不 可 避 免 會(huì) 遭 遇 高 溫、 低 溫、 旱 澇 等 多 種 逆 境 脅 迫, 因 此 發(fā) 掘 不 結(jié) 球 白 菜 的 抗 逆 基 因 以 及 研 究 抗 逆 基 因 的 功 能 不 僅 可 以 加 深 對 作 物 抗 逆 機(jī) 制 的 理 解, 同 時(shí) 對 于 如 何 提 高 種 質(zhì) 抗 逆 性 具 有 重 要 的 意 義。 參 考 文