南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學 學 報 ，(): :/. :./. 收 稿 日 期: 基 金 項 目: 江 蘇 省 農(nóng) 業(yè) 科 技 自 主 創(chuàng) 新 項 目()； 江 蘇 省 科 技 支 撐 計 劃 項 目() 作 者 簡 介: 董 慧 杰， 碩 士 研 究 生。 通 信 作 者: 胡 春 梅， 副 教 授， 研 究 方 向 為 蔬 菜 分 子 生 物 學 與 遺 傳 育 種，-:.。 董慧杰， 侯喜 林， 韓 克， 等. 不結(jié)球白 菜花青苷合 成負調(diào)控基 因 的 克 隆 和 表 達 分 析 及 其 對 外 源- 的 響 應. 南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學 學 報， ，():. 不 結(jié) 球 白 菜 花 青 苷 合 成 負 調(diào) 控 基 因 的 克 隆 和 表 達 分 析 及 其 對 外 源- 的 響 應 董 慧 杰， 侯 喜 林， 韓 克， 張 志 碩， 胡 春 梅 ( 南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學 園 藝 學 院/ 作 物 遺 傳 與 種 質(zhì) 創(chuàng) 新 國 家 重 點 實 驗 室， 江 蘇 南 京) 摘 要: 目 的 本 文 旨 在 探 究 基 因 在 不 結(jié) 球 白 菜 紫 色 和 綠 色 材 料 中 的 特 性 及 其 對 外 源- 的 響 應， 為 花 青 苷 調(diào) 控 機 制 奠 定 理 論 基 礎(chǔ)。 方 法 以 不 結(jié) 球 白 菜 紫 色 自 交 系- 及 其 綠 色 突 變 體- 為 材 料， 同 源 克 隆 基 因 的 全 長， 應 用 生 物 信 息 學 方 法 分 析 其 核 酸 和 蛋 白 序 列 及 其 進 化 關(guān) 系， 并 在 線 預 測 蛋 白 質(zhì) 二 級 和 三 級 結(jié) 構(gòu)。 采 用 外 源- 處 理 后 測 定 葉 片 中 花 青 苷 含 量， 并 通 過 實 時 熒 光 定 量 技 術(shù) 測 定 了 基 因 在 外 源- 處 理 后 的 表 達 水 平。 結(jié) 果 在 個 不 同 材 料 中 克 隆 獲 得 的 基 因 完 全 相 同， 序 列 長 為， 包 含 編 碼 區(qū)( 長 為) 及 非 編 碼 區(qū)( 長 為)。 其 編 碼 區(qū) 序 列 含 有 個 長 為 的 開 放 閱 讀 框()， 編 碼 個 氨 基 酸， 將 該 基 因 命 名 為。 亞 細 胞 定 位 預 測 該 蛋 白 分 布 在 細 胞 核 中， 蛋 白 相 對 分 子 質(zhì) 量 為.× ， 等 電 點 為.。 進 化 樹 分 析 表 明， 蛋 白 序 列 與 大 白 菜 相 似 性 為， 其 次 與 油 菜 和 甘 藍 關(guān) 系 最 近， 相 似 性 分 別 為 和。 外 源- 處 理 以 后 紫 色 材 料 - 葉 片 中 花 青 苷 含 量 均 高 于 對 照， 而 綠 色 突 變 體 葉 片 基 本 不 含 花 青 苷； 基 因 在 個 材 料 中 具 有 相 似 的 表 達 模 式， 即 先 下 降 后 上 升 而 后 又 下 降， 其 中 在 處 理 后 時 基 因 表 達 量 急 劇 增 加， 在 紫 色 和 綠 色 材 料 中 增 量 分 別 為 . 和.。 此 外， 表 達 量 在 綠 色 材 料 中 明 顯 高 于 紫 色 材 料。 結(jié) 論 不 結(jié) 球 白 菜 中 花 青 苷 負 調(diào) 控 基 因 既響應 外 源-， 又 與 葉 片 中 花 青 苷 的 積累 密 切相 關(guān)， 在 花青苷 的生物 合成 過程中 起著 重要的 調(diào)控 作 用。 關(guān) 鍵 詞: 不 結(jié) 球 白 菜； 同 源 克 ??； 序 列 分 析； 基 因 表 達 中 圖 分 類 號:. 文 獻 標 志 碼: 文 章 編 號:() - - ， (/， ，) :- ，.， -，- -.， .-， -. ，-，() ().() ，. .× .， ，. -，- ，-.， -，. 南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學 學 報 第 卷 ，. . ， .，-. - -，. :-；-； 不 結(jié) 球 白 菜(.) 是 一 類 十 字 花 科 蔬 菜， 其 營 養(yǎng) 豐 富， 深 受 人 們 喜 愛。 紫 色 不 結(jié) 球 白 菜 是 近 年 來 培 育 的 新 品 種， 葉 片 呈 紫 色， 富 含 花 青 苷。 花 青 苷 是 一 種 水 溶 性 色 素， 廣 泛 存 在 于 植 物 液 泡 中， 使 植 物 呈 現(xiàn) 出 不 同 的 色 彩， 且 具 有 協(xié) 助 植 物 抵 抗 生 物 脅 迫 和 非 生 物 脅 迫 的 作 用 。 花 青 苷 不 僅 對 植 物 本 身 有 重 要 的 作 用， 對 人 類 健 康 也 有 非 常 重 要 的 醫(yī) 療 保 健 功 能， 具 有 抗 氧 化 和 抗 癌 作 用 。 花 青 苷 生 物 合 成 的 調(diào) 控 主 要 是 通 過 轉(zhuǎn) 錄 因 子 對 結(jié) 構(gòu) 基 因 轉(zhuǎn) 錄 水 平 的 調(diào) 節(jié) 來 完 成 的。 其 中 正 調(diào) 控 基 因 主 要 包 括-(-)、(-) 和 類 轉(zhuǎn) 錄 因 子， 以 三 元 轉(zhuǎn) 錄 調(diào) 控 復 合 體() 激 活 結(jié) 構(gòu) 基 因 來 促 進 花 青 苷 的 生 物 合 成 。 負 調(diào) 節(jié) 基 因 主 要 有 兩 類: 一 類 是 轉(zhuǎn) 錄 因 子- ， 另 一 類 是 受 氮 或 硝 酸 鹽 誘 導 的( ) 轉(zhuǎn) 錄 因 子 家 族， 包 括、 和 基 因 。 目 前， 對 花 青 苷 合 成 調(diào) 控 因 子 的 研 究 大 多 集 中 在 正 調(diào) 控 因 子-、 和 類 轉(zhuǎn) 錄 因 子 上， 對 負 調(diào) 控 基 因 特 別 是 基 因 的 研 究 較 少。 本 試 驗 以 紫 色 葉 自 交 系- 及 其 綠 色 突 變 株 系- 為 材 料， 利 用 同 源 克 隆 的 方 法 分 離 得 到 基 因 的。 運 用 生 物 信 息 學 分 析 基 因 序 列， 比 較 在 種 不 同 材 料 中 的 相 對 表 達 量 以 及 外 源- 對 不 結(jié) 球 白 菜 花 青 苷 合 成 的 影 響， 為 進 一 步 研 究 基 因 的 功 能、 調(diào) 控 機 制 及 紫 色 不 結(jié) 球 白 菜 中 花 青 苷 合 成 的 分 子 調(diào) 控 機 制 奠 定 生 物 學 基 礎(chǔ)。 材 料 與 方 法 . 試 驗 材 料 供 試 材 料 不 結(jié) 球 白 菜 來 源 于 南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學 白 菜 系 統(tǒng) 生 物 學 實 驗 室。 其 中 紫 色 葉 自 交 系- 經(jīng) 秋 水 仙 素 誘 導 后 篩 選 出 可 穩(wěn) 定 遺 傳 的 綠 色 突 變 系-。 將- 與 綠 色 突 變 系- 雜 交 后 得 到 的 代 全 為 紫 色， 自 交 后 得 到 的 后 代 植 株 中 紫 色 葉 與 綠 色 葉 的 比 例 約 為。 取 紫 色 葉 和 綠 色 突 變 植 株 自 交 系 植 株 作 為 試 驗 材 料( 圖)。 將 種 子 用 蒸 餾 水 沖 洗 干 凈， 室 溫 催 芽 左 右， 播 種 至 穴 盤 并 移 至 溫 室。 圖 不 結(jié) 球 白 菜 紫 色 自 交 系- 和 綠 色 突 變 系- 表 型 . - . 的 合 成 用 提 取 試 劑 盒() 分 別 提 取- 和- 葉 期 葉 片 的 總。 使 用 反 轉(zhuǎn) 錄 試 劑 盒() 合 成 第 一 鏈 用 于 基 因 克 隆。 用 提 取 試 劑 盒 分 別 提 取 經(jīng)- 溶 液 處 理 后 的 不 結(jié) 球 白 菜- 和- 總， 使 用 反 轉(zhuǎn) 錄 試 劑 盒() 合 成 單 鏈。 . 不 結(jié) 球 白 菜 基 因 克 隆 利 用 大 白 菜 數(shù) 據(jù) 庫(，:/./) 中 同 源 基 因() 設(shè) 計 引 物( 表)， 以 反 轉(zhuǎn) 錄 得 到 的 第 一 鏈 為 模 板。 總 體 系: 模 板， 正、 反 引 物 各 ，×， 。 擴 增 條 件 為:；， 個 循 環(huán)；。 擴 增 產(chǎn) 物 經(jīng)· 的 瓊 脂 糖 凝 膠 電 泳 分 離， 回 收 目 的 片 段， 經(jīng) 轉(zhuǎn) 化， 挑 第 期 董 慧 杰， 等: 不 結(jié) 球 白 菜 花 青 苷 合 成 負 調(diào) 控 基 因 的 克 隆 和 表 達 分 析 及 其 對 外 源- 的 響 應 選 陽 性 克 隆 菌 液 測 序。 表 引 物 序 列 引 物 對 名 稱 引 物 對 序 列() 用 途 -/ / 擴 增 保 守 片 段 -/ / 檢 測 的 表 達 -/ / 檢 測 內(nèi) 參 基 因 的 表 達 . 基 因 序 列 及 其 蛋 白 的 生 物 信 息 學 分 析 用. 軟 件 查 找 基 因 的 開 放 閱 讀 框() 并 推 導 其 氨 基 酸 序 列； 利 用 在 線 軟 件 (:/./.) 分 析 基 因 編 碼 蛋 白 質(zhì) 的 氨 基 酸 組 成， 推 測 其 相 對 分 子 質(zhì) 量 和 等 電 點； 利 用(:/. . /) 預 測 所 編 碼 蛋 白 質(zhì) 的 信 號 肽； 用 .(:/./) 和(:/./.) 分 別 對 其 跨 膜 結(jié) 構(gòu) 域 和 亞 細 胞 定 位 進 行 預 測 分 析； 用 中 在 線 工 具(:/. ./.) 和(:/./) 分 析 其 編 碼 蛋 白 的 結(jié) 構(gòu) 域； 采 用 和 軟 件 進 行 蛋 白 質(zhì) 多 序 列 比 對， 用. 軟 件 構(gòu) 建 系 統(tǒng) 進 化 樹； 通 過 在 線 軟 件(:/./ ? ) 和(:/ ./) 分 析 其 蛋 白 質(zhì) 序 列 的 二 級 結(jié) 構(gòu) 并 進 行 三 級 結(jié) 構(gòu) 建 模 預 測。 . 外 源- 處 理 不 結(jié) 球 白 菜 待 不 結(jié) 球 白 菜 植 株 長 到 葉 期 時， 葉 面 噴 施 質(zhì) 量 濃 度 為· 的- 溶 液， 并 于 噴 前 及 噴 后、 、 和 剪 取 葉 片.， 置 保 存 備 用。 每 個 處 理 個 重 復。 為 了 增 強- 的 吸 收 效 果， 噴 施 液 中 加 入.· 的 吐 溫， 以 噴 施 等 量 清 水 加.· 吐 溫 作 為 對 照。 噴 施 時 間 為 :。 . 不 結(jié) 球 白 菜 總 花 青 苷 含 量 的 測 定 總 花 青 苷 的 提 取 參 照 王 小 青 等 的 方 法 并 略 有 改 動。 取 冷 凍 干 燥 葉 片.， 用 液 氮 研 磨 后， 加 入 . 酸 化 甲 醇( 其 中 含 體 積 分 數(shù) 為 的)， 在 適 當 搖 晃 的 條 件 下 室 溫 浸 提。 因 提 取 液 中 花 青 苷 見 光 易 分 解， 試 驗 過 程 中 應 注 意 避 光 。 花 青 苷 含 量( . )/， 其 中: 和 表 示 花 青 苷 提 取 液 分 別 在 和 下 的 吸 光 值； 表 示 葉 片 鮮 質(zhì) 量()。 每 個 反 應 設(shè) 次 重 復。 . 實 時 熒 光 定 量 表 達 分 析 根 據(jù) 克 隆 所 得 基 因 的 全 長 序 列， 采 用 軟 件 設(shè) 計 正、 反 引 物( 表)， 基 因 作 為 內(nèi) 參。 試 驗 參 照 ® () 試 劑 盒 的 說 明 書， 采 用 標 準 的 兩 步 法 程 序， 在 實 時 熒 光 定 量 儀( 美 國) 上 完 成 定 量 分 析。 反 應 體 系: 模 板 ( 稀 釋 倍)， 正、 反 引 物 各.， .。 相 對 定 量 使 用 參 照 基 因 的 法 ， 表 達 差 異 等 于 ， 目 標 基 因 。 每 個 反 應 設(shè) 次 生 物 學 重 復。 結(jié) 果 與 分 析 . 不 結(jié) 球 白 菜 基 因 的 克 隆 及 序 列 分 析 分 別 以 紫 色 葉 自 交 系- 及 其 綠 色 突 變 系- 葉 片 為 模 板， 用 特 異 性 引 物 對 -/ 擴 增 出 長 約 的 擴 增 產(chǎn) 物。 通 過 基 因 克 隆 分 別 獲 得- 和- 中 基 因 序 列。 測 序 結(jié) 果( 圖) 表 明， 克 隆 所 得 基 因 片 段 在 個 自 交 系 中 大 小 一 致， 長 度 均 為， 其 中 包 括 編 碼 區(qū)()， 非 編 碼 區(qū)()， 其 編 碼 區(qū) 序 列 含 有 的 開 放 閱 讀 框()， 編 碼 個 氨 基 酸， 將 克 隆 片 段 命 名 為。 核 苷 酸 序 列 比 對 發(fā) 現(xiàn) 編 碼 區(qū) 序 列 與 大 白 菜 的 完 全 一 致( 圖)。 . 不 結(jié) 球 白 菜 蛋 白 的 特 征 分 析 蛋 白 等 電 點 為.， 蛋 白 相 對 分 子 質(zhì) 量 為.× ， 氨 基 酸 組 成 中 絲 氨 酸() 所 占 比 例 南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學 學 報 第 卷 圖 不 結(jié) 球 白 菜 中 基 因 的 核 苷 酸 序 列 及 其 編 碼 的 氨 基 酸 序 列 . - 表 示 終 止 密 碼 子。 . 圖 不 結(jié) 球 白 菜 和 大 白 菜 中 基 因 的 核 苷 酸 序 列 比 對 . - 最 大。 蛋 白 中 含 有 酸 性 氨 基 酸 個， 堿 性 氨 基 酸 個。 生 物 信 息 學 分 析 表 明 蛋 白 位 于 細 胞 核 中， 為 親 水 性 蛋 白， 無 跨 膜 區(qū)。 保 守 域 分 析 結(jié) 果 表 明， 蛋 白 屬 于 超 家 族。 運 圖 不 結(jié) 球 白 菜 基 因 編 碼 蛋 白 的 二 級 結(jié) 構(gòu) . -: 結(jié) 合 區(qū) 域；: 蛋 白 結(jié) 合 區(qū) 域；: 螺 旋；: 延 伸 鏈；: 外 露 的 蛋 白 質(zhì)；: 隱 藏 的 蛋 白 質(zhì)。 :-；:；:-；:；:；:. 用 軟 件 預 測 蛋 白 的 二 級 結(jié) 構(gòu) 結(jié) 果( 圖) 顯 示: 該 蛋 白 含 有 個 結(jié) 合 位 點， 個 蛋 白 質(zhì) 結(jié) 合 位 點， 其 二 級 結(jié) 構(gòu) 由. 的 螺 旋、. 的 延 伸 鏈 以 及. 的 隨 機 卷 曲 組 成。 此 外， 蛋 白 結(jié) 構(gòu) 中 暴 露 在 外 的 氨 基 酸 占.， 隱 藏 在 內(nèi) 的 氨 基 酸 占.， 其 余. 的 氨 基 酸 居 中。 其 無 序 蛋 白 含 量 占.， 表 明 該 蛋 白 結(jié) 構(gòu) 靈 活 性 較 強。 預 測 的 蛋 白 的 三 級 結(jié) 構(gòu)( 圖) 與 其 二 級 結(jié) 構(gòu) 預 測 結(jié) 果 基 本 相 符。 第 期 董 慧 杰， 等: 不 結(jié) 球 白 菜 花 青 苷 合 成 負 調(diào) 控 基 因 的 克 隆 和 表 達 分 析 及 其 對 外 源- 的 響 應 圖 不 結(jié) 球 白 菜 蛋 白 三 級 結(jié) 構(gòu) 的 預 測 . -: 螺 旋-；: 延 伸 鏈；: 隨 機 卷 曲 . . 蛋 白 的 同 源 性 比 較 及 進 化 樹 分 析 利 用 對 編 碼 的 蛋 白 序 列 進 行 同 源 檢 索， 結(jié) 果( 圖) 表 明， 蛋 白 與 大 白 菜 ( .) 中 的 同 源 性 高 達， 其 次 與 油 菜(.)、 甘 藍( .) 的 同 源 性 較 高， 分 別 為 和。 利 用 及 軟 件 對 包 括 蛋 白 在 內(nèi) 的 個 物 種 的 蛋 白 序 列 進 行 多 重 比 對 分 析， 結(jié) 果( 圖) 顯 示， 超 家 族 所 在 的 區(qū) 域( 第 個 氨 基 酸 序 列) 在 比 對 的 植 物 蛋 白 序 列 中 高 度 保 守， 表 明 編 碼 的 蛋 白 可 能 與 其 他 物 種 的 蛋 白 具 有 相 同 的 功 能。 此 外， 由 個 保 守 的 半 胱 氨 酸 殘 基 組 成 的-()-()-()- 基 序 也 存 在 于 蛋 白 的 高 保 守 區(qū) 域 中。 圖 蛋 白 和 其 他 植 物 已 知 蛋 白 同 源 性 比 較 . 黑 框( 第 個 氨 基 酸 序 列) 表 示 超 家 族 所 在 的 高 保 守 區(qū) 域， 黑 框( 第 個 氨 基 酸 序 列) 表 示-()-()-()- 基 序， 表 示 半 胱 氨 酸。 : 不 結(jié) 球 白 菜；: 大 白 菜( .)；: 油 菜(.)；: 甘 藍( .)；: 擬 南 芥 ( .)；: 亞 麻 芥( .)；: 琴 葉 擬 南 芥( .)。 ()，() -()-()-()- ， .: . ；: . ( .)；:(.)；: ( .)；: ( .)； :( .)；:( .). 為 進 一 步 分 析 蛋 白 與 其 他 植 物 蛋 白 之 間 的 進 化 關(guān) 系， 在 多 重 比 對 的 基 礎(chǔ) 上， 利 用 軟 件. 對 上 述 植 物 與 薺 菜( .)、 天 藍 遏 藍 菜(.)、 山 葵( .) 和 蘿 卜( .) 中 的 蛋 白 進 行 系 統(tǒng) 進 化 分 析。 由 圖 可 見: 的 進 化 基 本 符 合 植 物 分 類 學 地 位， 且 具 有 明 顯 的 種 屬 特 性， 同 一 科 植 物 不 同 屬 之 間 的 分 類 明 顯， 同 屬 植 物 在 進 化 樹 上 處 于 同 一 分 支。 其 中， 擬 南 芥 屬 的 擬 南 芥 和 琴 葉 擬 南 芥 聚 為 一 組； 同 為 蕓 薹 屬 的 大 白 菜、 油 菜 和 甘 藍 聚 為 一 組； 而 不 結(jié) 球 白 菜 與 同 屬 的 大 白 菜 關(guān) 系 最 近， 聚 為 一 組， 其 次 與 油 菜 和 甘 藍 關(guān) 系 較 近。 南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學 學 報 第 卷 圖 蛋 白 與 其 他 植 物 中 蛋 白 的 系 統(tǒng) 進 化 分 析 . . 外 源- 處 理 后 不 結(jié) 球 白 菜 花 青 苷 含 量 的 變 化 由 圖 可 見: 在 紫 色 材 料- 中 檢 測 到 大 量 花 青 苷， 外 源- 在 一 定 程 度 上 可 以 促 進 紫 色 不 結(jié) 球 白 菜 中 花 青 苷 的 積 累， 且 在 處 理 以 后 花 青 苷 含 量 均 高 于 對 照(<.)。 而 綠 色 材 料- 中 則 基 本 不 含 花 青 苷。 圖 外 源- 處 理 下 不 結(jié) 球 白 菜 中 花 青 苷 含 量 . - 不 同 大 寫 字 母 表 示 在. 水 平 上 差 異 極 顯 著。 下 同。 . 圖 外 源- 處 理 下 不 結(jié) 球 白 菜 中 基 因 相 對 表 達 量 . - - . 外 源- 處 理 后 不 結(jié) 球 白 菜 基 因 的 表 達 分 析 由 圖 可 見: 基 因 在- 和- 中 的 表 達 水 平 不 同 但 具 有 相 似 的 表 達 模 式， 即 先 降 低 后 急 劇 升 高， 時 表 達 量 達 到 最 高 而 后 又 急 劇 下 降。 在- 中，- 處 理 后， 時 基 因 表 達 量 降 低 了.， 而 時 基 因 表 達 量 比 對 照 增 加 了.， 在 時 表 達 量 又 急 劇 下 降。 在- 中，- 處 理 后， 時 基 因 表 達 量 降 低 了.， 時 基 因 表 達 量 與 對 照 相 比 增 加 了.。 此 外， 基 因 在 紫 色 葉 材 料- 中 的 表 達 量 明 顯 低 于 綠 色 突 變 體 材 料 -。 第 期 董 慧 杰， 等: 不 結(jié) 球 白 菜 花 青 苷 合 成 負 調(diào) 控 基 因 的 克 隆 和 表 達 分 析 及 其 對 外 源- 的 響 應 討 論 家 族 的 基 因 所 編 碼 的 蛋 白 在 其 末 端 含 有 約 個 氨 基 酸 的 高 保 守 區(qū) 域， 其 中 保 守 基 序 -()-()-()- 存 在 于 所 有 的 蛋 白 中 。 有 研 究 表 明， 家 族 的 基 因 可 編 碼 鋅 指 轉(zhuǎn) 錄 因 子， 其 中 家 族