南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學 學 報 2018,41(3):456-464 http:/nauxb.njau.edu.cnJ o u r n a l o f N a n j i n g A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y DOI:10.7685/jnau.201709023 收 稿 日 期 :2017-09-12 基 金 項 目 : 國 家 重 點 研 發(fā) 計 劃 項 目(2016YFE0101100,2017YFD0202101); 中 央 高 校 基 本 科 研 業(yè) 務(wù) 費 專 項 資 金(KJQN201746); 國 家 公 益 性 行 業(yè)( 農(nóng) 業(yè)) 科 研 專 項(201503110); 國 家 自 然 科 學 基 金 項 目(31601836); 中 國 博 士 后 科 學 基 金 項 目(2016M590469) 作 者 簡 介 : 呂 娜 娜, 碩 士 研 究 生。 * 通 信 作 者: 李 榮, 副 教 授, 博 導, 主 要 從 事 土 壤 微 生 物 與 生 物 肥 料 研 究,E-mail:lirongnjau.edu.cn。 呂 娜 娜, 沈 宗 專, 王 東 升, 等. 施 用 氨 基 酸 有 機 肥 對 黃 瓜 產(chǎn) 量 及 土 壤 生 物 學 性 狀 的 影 響J. 南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學 學 報,2018,41(3):456-464. 施 用 氨 基 酸 有 機 肥 對 黃 瓜 產(chǎn) 量 及 土 壤 生 物 學 性 狀 的 影 響 呂 娜 娜 1 , 沈 宗 專 1 , 王 東 升 1,2 , 劉 紅 軍 1 , 薛 超 1 , 李 榮 1* , 沈 其 榮 1 (1. 南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學 資 源 與 環(huán) 境 科 學 學 院/ 江 蘇 省 固 體 有 機 廢 棄 物 資 源 化 高 技 術(shù) 研 究 重 點 實 驗 室/ 江 蘇 省 有 機 固 體 廢 棄 物 資 源 化 協(xié) 同 創(chuàng) 新 中 心/ 國 家 有 機 類 肥 料 工 程 技 術(shù) 研 究 中 心, 江 蘇 南 京210095; 2. 南 京 市 蔬 菜 科 學 研 究 所, 江 蘇 南 京210042) 摘 要 : 目 的 養(yǎng) 殖 場 病 死 畜 禽 的 無 害 化、 資 源 化 處 理 是 減 少 環(huán) 境 污 染、 保 障 養(yǎng) 殖 業(yè) 良 性 發(fā) 展 而 亟 需 解 決 的 關(guān) 鍵 問 題 之 一。 高 溫 酸 解 病 死 畜 禽 制 成 的 氨 基 酸 液 與 普 通 有 機 肥 復 配 制 成 氨 基 酸 有 機 肥 是 實 現(xiàn) 病 死 畜 禽 無 害 化、 資 源 化 利 用 的 重 要 途 徑 之 一。 本 研 究 旨 在 評 估 氨 基 酸 有 機 肥 對 黃 瓜 產(chǎn) 量 及 土 壤 生 物 學 性 質(zhì) 的 影 響。 方 法 采 用 實 時 熒 光 定 量PCR 等 技 術(shù) 手 段, 研 究 連 續(xù) 施 用 氨 基 酸 有 機 肥 對 設(shè) 施 黃 瓜 產(chǎn) 量、 土 壤 理 化 性 質(zhì)、 氮 素 循 環(huán) 微 生 物 數(shù) 量 及 土 壤 酶 活 性 的 影 響。 結(jié) 果 田 間 試 驗 結(jié) 果 表 明: 與 不 施 肥 對 照 相 比, 氨 基 酸 有 機 肥 處 理、 單 施 化 肥、 施 用 雞 糞 有 機 肥 處 理 黃 瓜 分 別 增 產(chǎn)48.2%、29.5% 和30.6%。 與 不 施 肥 對 照 相 比, 氨 基 酸 有 機 肥 處 理 能 顯 著 提 高 土 壤pH 值 和 銨 態(tài) 氮、 硝 態(tài) 氮、 有 效 磷 的 含 量, 而 與 其 他 施 肥 處 理 間 差 異 較 小。 氨 基 酸 有 機 肥 處 理 土 壤 的 氨 氧 化 細 菌 數(shù) 量 顯 著 高 于 不 施 肥 對 照, 但 顯 著 低 于 其 他 施 肥 處 理; 反 硝 化 n i r K 基 因 數(shù) 量 顯 著 高 于 不 施 肥 對 照, 而 顯 著 低 于 施 用 雞 糞 有 機 肥 處 理; n i r S 基 因 數(shù) 量 顯 著 高 于 不 施 肥 對 照 及 單 施 化 肥 處 理。 氨 基 酸 有 機 肥 處 理 土 壤 的 過 氧 化 氫 酶 及 磷 酸 酶 活 性 顯 著 高 于 其 他 施 肥 處 理 和 不 施 肥 對 照; 脲 酶 活 性 顯 著 高 于 不 施 肥 對 照 但 低 于 其 他 施 肥 處 理; 蔗 糖 酶 活 性 顯 著 高 于 不 施 肥 對 照 且 與 其 他 施 肥 處 理 無 顯 著 差 異。 結(jié) 論 施 用 氨 基 酸 有 機 肥 可 改 善 土 壤 理 化 性 質(zhì), 增 強 土 壤 生 物 肥 力, 提 高 根 系 可 吸 收 利 用 的 速 效 養(yǎng) 分 及 游 離 氨 基 酸 含 量, 增 加 黃 瓜 產(chǎn) 量。 關(guān) 鍵 詞 : 氨 基 酸 有 機 肥; 黃 瓜; 產(chǎn) 量; 土 壤 酶 活 性; 土 壤 養(yǎng) 分; 氮 素 循 環(huán) 微 生 物 中 圖 分 類 號 :S147.5 文 獻 標 志 碼 :A 文 章 編 號 :1000-2030 (2018 )03-0456-09 Effectsofaminoacidorganicfertilizeroncucumber yieldandsoilbiologicalcharacters LÜNana 1 ,SHENZongzhuan 1 ,WANGDongsheng 1,2 ,LIUHongjun 1 ,XUEChao 1 ,LIRong 1* ,SHENQirong 1 (1.CollegeofResourcesandEnvironmentalSciences/JiangsuKeyLaboratoryofSolidOrganicWasteUtilization/ JiangsuCollaborativeInnovationCenterforSolidOrganicWasteResourceUtilization/NationalEngineeringResearch CenterforOrganic-BasedFertilizers,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China; 2.NanjingInstituteofVegetableScience,Nanjing210042,China) Abstract:ObjectivesAmino acid liquid,which is hydrolyzed from animal carcasses by concentrated sulfuric acid under high temperature,compoundedwithmanurecompostwasusedtodevelopanovelaminoacidorganicfertilizer.Thisisoneofimportant waystoachievethegoalofbio-safetydisposalandutilizationofdeadlivestockandpoultrytoensurethesustainabledevelopmentof farmedanimalindustries.Thisstudyisdesignedtoevaluatetheeffectsofthisaminoacidorganicfertilizerapplicationoncucumber yieldandsoilbiologicalproperties.MethodsTheeffectsofcontinuousapplicationofthenovelproductongreenhousecucumber yield,soilphysicochemicalproperties,nitrogencyclingmicroorganismsandsoilenzymeactivitywerestudiedbyreal-timePCRand othertechnologies.ResultsFieldexperimentshowedthatthecucumberyieldinaminoacidorganicfertilizerapplicationtreatment (AOF)increasedby48.2%,29.5%and30.6%whencomparedwithnon-fertilizationcontrol(CK),fertilizationtreatmentswithappli- cationofonlychemicalfertilizer(CF)andcommonorganicfertilizer(OF),respectively.ComparedtoCK,applicationofaminoacid organicfertilizercouldsignificantlyincreasesoilpHvalueandthecontentsoftotalcarbon,ammoniumnitrogen,nitratenitrogenand availablephosphorus,butonlydisplaysmalldifferencescomparedtootherfertilizationtreatments(CFandCK).Asrevealedbyreal timePCR,thesoilsampledfromAOFexhibitedasignificantlyhigherabundanceofammonia-oxidizingbacteriathanthatinsoil collectedfromCKwhileexhibitedasignificantlylowerabundancethanthatinsoilcollectedfromCFandOF. Meanwhile,soil collectedfromAOFdisplayedasignificantlyhigherabundanceofdenitrifying n i r KgenecomparedtosoilsampledfromCKbut exhibitedasignificantlylowerabundancecomparedtoOF.Also,soilcollectedfromAOFshowedasignificantlyhigherabundanceof n i r SgenecomparedtoCKandCF.Aminoacidorganicfertilizertreatedsoilshowedhighestactivitiesofcatalaseandphosphatase 第3 期 呂 娜 娜, 等: 施 用 氨 基 酸 有 機 肥 對 黃 瓜 產(chǎn) 量 及 土 壤 生 物 學 性 狀 的 影 響 whencomparedtonon-fertilizationcontrolandfertilizationtreatments.Also,aminoacidorganicfertilizertreatedsoilshowedasignifi- cantlyhigheractivityofureasecomparedtoCKbutloweractivitiescomparedtoCFandOFtreatments.Moreover,sucraseactivity wassignificantly higher for AOF treatment than that for CK with no significant difference comparing with CF and CK. ConclusionsAllresultsillustratedthattheapplicationofaminoacidorganicfertilizercouldpromotethecucumberyieldprobably throughmanipulating soil physicochemical properties,enhancing soil enzyme activity and nitrification,and then improving roots utilizationofavailablenutrientsandfreeaminoacidinsoil. Keywords:aminoacidorganicfertilizer;cucumber;yield;soilenzymeactivity;soilnutrient;nitrogencyclingmicroorganism 黃 瓜( C u c um i s s a t i v u sL.) 是 周 年 均 衡 供 應(yīng) 中 的 常 見 蔬 菜, 許 多 地 區(qū) 均 有 溫 室 或 塑 料 大 棚 的 設(shè) 施 黃 瓜 栽 培。 據(jù) 世 界 糧 農(nóng) 組 織 統(tǒng) 計 數(shù) 據(jù), 中 國 是 世 界 上 最 大 的 黃 瓜 生 產(chǎn) 國,2014 年 黃 瓜 總 產(chǎn) 量 已 高 達5700 萬t 1 。 設(shè) 施 黃 瓜 栽 培 已 成 為 農(nóng) 民 創(chuàng) 收 的 重 要 途 徑 之 一。 然 而, 目 前 設(shè) 施 黃 瓜 栽 培 生 產(chǎn) 中 因 過 量 施 用 化 肥, 致 使 土 壤 出 現(xiàn) 板 結(jié)、 酸 化、 連 作 障 礙 等 問 題, 進 而 導 致 黃 瓜 產(chǎn) 量 減 少 及 品 質(zhì) 下 降, 嚴 重 威 脅 著 設(shè) 施 黃 瓜 產(chǎn) 業(yè) 的 發(fā) 展 2 。 設(shè) 施 黃 瓜 栽 培 時 減 施 化 肥、 增 施 有 機 肥 已 成 為 保 障 設(shè) 施 黃 瓜 產(chǎn) 業(yè) 可 持 續(xù) 發(fā) 展 的 重 要 途 徑 之 一。 我 國 規(guī) 模 化 養(yǎng) 殖 廠 的 畜 禽 病 死 率 一 般 為5%10%, 遇 到 重 大 疫 情 時, 病 死 率 還 會 更 高, 每 年 產(chǎn) 生 的 病 死 畜 禽 量 高 達 數(shù) 十 億 頭 3 。 病 死 畜 禽 攜 帶 大 量 的 病 原 微 生 物, 不 僅 污 染 環(huán) 境, 而 且 還 嚴 重 威 脅 畜 禽 養(yǎng) 殖 業(yè) 健 康 發(fā) 展 和 人 體 健 康, 亟 需 進 行 無 害 化 處 理 4 。 病 死 畜 禽 經(jīng) 高 溫 酸 解 制 成 氨 基 酸 肥 料 是 近 年 來 對 病 死 畜 禽 進 行 無 害 化 處 理 并 資 源 化 利 用 的 最 新 工 藝 技 術(shù), 是 解 決 環(huán) 境 污 染、 實 現(xiàn) 養(yǎng) 殖 業(yè) 良 性 發(fā) 展 的 重 要 途 徑 之 一 5 。 目 前, 農(nóng) 資 市 場 上 氨 基 酸 肥 料 多 以 液 體 氨 基 酸 肥 為 主, 主 要 用 于 葉 面 噴 施、 灌 根、 浸 種 蘸 根。 由 于 施 用 液 體 氨 基 酸 肥 存 在 各 種 不 足 之 處, 所 以 只 能 作 為 土 壤 施 肥 的 補 充 6 。 液 體 氨 基 酸 與 有 機 肥 復 配 而 成 的 氨 基 酸 有 機 肥 具 有 氨 基 酸 肥 料 和 有 機 肥 的 雙 重 優(yōu) 點, 不 僅 可 為 作 物 提 供 速 效 氨 基 酸 養(yǎng) 分, 而 且 還 可 提 升 土 壤 有 機 質(zhì) 含 量。 同 時, 考 慮 到 氨 基 酸 有 機 肥 直 接 施 用 于 作 物 根 系 附 近, 還 可 增 加 作 物 對 氨 基 酸 的 吸 收 利 用 效 率。 然 而, 目 前 氨 基 酸 肥 的 效 應(yīng) 研 究 多 集 中 于 施 用 液 體 氨 基 酸 肥 對 作 物 產(chǎn) 量 或 品 質(zhì) 的 影 響 7 , 僅 有 少 數(shù) 有 關(guān) 施 用 氨 基 酸 有 機 肥 對 作 物 產(chǎn) 量、 品 質(zhì) 及 土 壤 性 質(zhì) 影 響 的 報 道 8-9 , 尚 無 有 關(guān) 利 用 病 死 畜 禽 制 成 的 氨 基 酸 有 機 肥 對 設(shè) 施 黃 瓜 作 物 產(chǎn) 量 及 土 壤 性 質(zhì) 影 響 的 綜 合 研 究。 土 壤 硝 化 作 用 是 供 給 作 物 生 長 發(fā) 育 所 需 氮 素 的 關(guān) 鍵 過 程, 而 反 硝 化 作 用 將 硝 化 作 用 產(chǎn) 生 的 硝 態(tài) 氮 最 終 還 原 成N 2 或N 2 O 的 過 程, 是 氮 的 損 失 途 徑 之 一, 對 農(nóng) 業(yè) 生 產(chǎn) 不 利 10 。 氨 氧 化 作 用 是 硝 化 作 用 的 第 一 步 反 應(yīng) 和 限 速 步 驟, 是 全 球 氮 素 循 環(huán) 的 中 心 環(huán) 節(jié) 11 。 農(nóng) 田 土 壤 中 不 同 形 態(tài) 氮 源 的 投 入 會 改 變 氮 素 循 環(huán) 氨 氧 化 微 生 物 及 反 硝 化 微 生 物 的 種 群 數(shù) 量 及 群 落 結(jié) 構(gòu), 從 而 影 響 土 壤 的 硝 化 及 反 硝 化 作 用, 最 終 影 響 土 壤 中 有 效 氮 的 含 量 12 。 此 外, 土 壤 酶 活 性 也 與 土 壤 營 養(yǎng) 物 質(zhì) 的 轉(zhuǎn) 化 密 切 相 關(guān), 土 壤 酶 活 性 的 強 弱 有 助 于 評 判 土 壤 的 供 肥 能 力, 是 判 定 土 壤 質(zhì) 量 的 重 要 指 標 之 一 13 。 因 此, 土 壤 氮 素 循 環(huán) 微 生 物 及 酶 活 性 的 研 究 將 有 助 于 揭 示 氨 基 酸 有 機 肥 施 用 后 對 土 壤 氮 素 供 應(yīng) 及 生 態(tài) 功 能 的 影 響。 本 文 通 過 田 間 試 驗, 研 究 連 續(xù) 施 用 高 溫 酸 解 病 死 畜 禽 制 成 的 氨 基 酸 液 與 雞 糞 有 機 肥 復 配 而 成 的 氨 基 酸 有 機 肥, 對 設(shè) 施 黃 瓜 產(chǎn) 量 和 土 壤 生 物 學 性 質(zhì) 的 影 響, 以 期 為 大 面 積 推 廣 應(yīng) 用 氨 基 酸 有 機 肥 提 供 科 學 依 據(jù)。 1 材 料 與 方 法 1.1 供 試 材 料 黃 瓜 品 種 為 南 京 市 蔬 菜 所 提 供 的 寧 豐 春 秋。 供 試 土 壤 為 多 年 連 作 黃 瓜 土 壤, 屬 黃 棕 壤, 基 本 理 化 性 質(zhì) 為:pH7.21, 有 機 質(zhì) 含 量14.2g·kg -1 , 總 氮 含 量1.45g·kg -1 , 有 效 磷 含 量166.6mg·kg -1 , 有 效 鉀 含 量 318mg·kg -1 。 腐 熟 雞 糞 有 機 肥 購 自 南 通 惠 農(nóng) 生 物 有 機 肥 有 限 公 司; 氨 基 酸 有 機 肥 由 腐 熟 雞 糞 有 機 肥 添 加 20% 水 溶 性 氨 基 酸 液 復 配 而 成, 水 溶 性 氨 基 酸 由 高 溫 酸 解 病 死 畜 禽 制 成, 由 江 陰 市 聯(lián) 業(yè) 生 物 科 技 有 限 公 司 提 供。 水 溶 性 氨 基 酸 及 各 肥 料 養(yǎng) 分 含 量 見 表1。 土 壤 基 因 組DNA 強 力 提 取 試 劑 盒PowerSoilDNAIsolationKits 購 自MoBioLaboratoriesInc. 公 司, 質(zhì) 粒 提 取 試 劑 盒 購 自Qiagen 公 司,TaqManUniversalPCRMasterMix 和PowerSYBRGreenPCRMasterMix 均 購 自 美 國ABI 公 司,dNTP 以 及PCRBuffer, T aq、 E x 聚 合 酶 購 自TaKaRa 公 司。 本 試 驗 所 用 引 物 均 由 南 京 金 斯 瑞 生 物 公 司 合 成, 具 體 序 列 見 表2。 7 5 4 南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學 學 報 第41 卷 表1 普 通 有 機 肥 、 水 溶 性 氨 基 酸 及 氨 基 酸 有 機 肥 養(yǎng) 分 含 量 Table1 Nutrientcontentoforganicfertilizer ,compoundliquidaminoacidandaminoacidorganicfertilizer 肥 料 種 類 Varietiesof fertilizer 總 氮 含 量/% Totalnitrogen content 全 磷(P 2 O 5 ) 含 量/% Totalphosphorus content 全 鉀(K 2 O) 含 量/% Totalpotassium content 游 離 氨 基 酸 含 量/% Free-amino acidcontent 總 氨 基 酸 含 量/% Totalamino acidcontent pH 含 水 量/% Water content 水 溶 性 氨 基 酸 Liquidaminoacidfertilizer 4.65 0.41 0.07 10.21 16.92 0.72 氨 基 酸 有 機 肥 Aminoacidorganicfertilizer 1.78 2.61 1.25 1.94 4.37 5.84 29.2 雞 糞 有 機 肥 Chickenmanurecompost 1.24 2.91 1.43 1.06 8.34 28.4 尿 素Urea 46.4 過 磷 酸 鈣 Calciumsuperphosphate 16.0 硫 酸 鉀 Potassiumsulfate 50 表2 熒 光 定 量PCR 所 用 引 物 Table2 Primersforreal-timePCR 基 因 Gene 引 物 名 稱 Primersname 序 列(53) Sequence B a c t e r i a l - a m o A AmoA-1F amoA-2R GGGGHTTYTACTGGTGGT CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC A r c h a e a l - a m o A Arch-amoAF Arch-amoAR STAATGGTCTGGCTTAGACG GCGGCCATCCATCTGTATGT n i r S cd3aF R3cd GTSAACGTSAAGGARACSGG GASTTCGGRTGSGTCTTGA n i r K nirK1F nirK5R GGMATGGTKCCSTGGCA GCCTCGATCAGRTTRTGG n o s Z nosZFb nosZRb AACGCCTAYACSACSCTGTTC TCCATGTGCAGNGCRTGGCAGAA 1.2 試 驗 設(shè) 計 1.2.1 黃 瓜 育 苗 以60 溫 水 浸 泡 黃 瓜 種 子, 攪 拌 至 室 溫 后, 取 沉 淀 種 子 以5%( 體 積 分 數(shù)) 次 氯 酸 鈉 消 毒 處 理3min, 再 以 無 菌 水 清 洗34 次, 并 于30 培 養(yǎng) 箱 中 遮 光 催 芽 至 露 白 后 分 別 埋 入 育 苗 基 質(zhì) 中, 待 幼 苗 長 至2 葉1 心 時 移 栽。 1.2.2 田 間 試 驗 分 別 于2015 年36 月、2015 年 912 月 及2016 年36 月 在 江 蘇 省 南 京 市 蔬 菜 花 卉 科 學 研 究 所 科 技 園 大 棚 開 展13 季 田 間 試 驗。 試 驗 區(qū) 域 屬 亞 熱 帶 季 風 氣 候, 年 平 均 氣 溫 為15.4, 年 平 均 降 雨 量 為1106mm。 每 季 田 間 試 驗 設(shè) 置4 個 施 肥 處 理, 分 別 為: 施 用 氨 基 酸 有 機 肥 處 理(AOF)、 施 用 雞 糞 有 機 肥 處 理(OF)、 單 施 化 肥 處 理(CF) 及 不 施 肥 空 白 對 照(CK)。 每 個 處 理 設(shè) 置3 個 小 區(qū), 每 個 小 區(qū) 面 積 為10m 2 ( 長5m、 寬2m), 各 小 區(qū) 隨 機 區(qū) 組 排 列。 各 處 理 等 養(yǎng) 分 設(shè) 置, 其 中 化 肥 處 理 各 小 區(qū) 施 肥 量 為 尿 素0.5kg、 過 磷 酸 鈣1.0kg、 硫 酸 鉀0.4kg, 施 用 氨 基 酸 有 機 肥 處 理 及 施 用 雞 糞 有 機 肥 處 理 的 有 機 肥 施 用 量 為6kg, 并 用 化 肥 補 齊 差 額 養(yǎng) 分。 有 機 肥 及 磷 肥 用 量 的 全 部、 氮 肥 用 量 的1/2 及 鉀 肥 用 量 的2/3 作 為 基 肥 施 入, 施 肥7d 后 定 植 黃 瓜 幼 苗 并 定 期 監(jiān) 測 黃 瓜 長 勢。 剩 余 肥 料 于 定 植30 和45d 后 分2 次 追 施。 其 他 田 間 日 常 管 理 交 由 江 蘇 省 南 京 市 蔬 菜 科 學 研 究 所 工 作 人 員 常 規(guī) 管 理。 1.2.3 土 壤 樣 品 采 集 第3 季 黃 瓜 最 后 一 次 收 獲 后, 用 土 鉆 采 集020cm 的 表 土, 每 個 小 區(qū) 采 集5 個 點, 混 勻 后 留 取 部 分 土 壤 樣 品, 分 別 于4 和-80 下 保 存 備 用。 1.3 測 定 方 法 1.3.1 黃 瓜 產(chǎn) 量 的 測 定 黃 瓜 定 植30d 后 定 期 監(jiān) 測 黃 瓜 長 勢, 待 黃 瓜 果 實 成 熟 后 每2d 采 摘1 次, 直 至 黃 瓜 生 命 周 期 結(jié) 束, 記 錄 每 個 處 理 的 黃 瓜 總 產(chǎn) 量, 以kg·m -2 表 示。 1.3.2 土 壤 理 化 性 質(zhì) 的 測 定 土 壤 理 化 性 質(zhì) 測 定 參 照 土 壤 農(nóng) 化 分 析。 利 用 玻 璃 電 極 酸 度 計 測 定 土 壤pH 值; 利 用 元 素 分 析 儀(Vario EL,Germany) 通 過 干 燒 法 測 定 土 壤 的 總 碳(total carbon,TC)、 總 氮(total nitrogen,TN) 含 量 及 碳 氮 比(C/N);0.01mol·L -1 氯 化 鈣 溶 液 浸 提 土 壤 后 用 流 動 分 析 儀(AutoAnalyzer3, Germany) 測 定 土 壤 懸 液 的 銨 態(tài) 氮(NH + 4 -N) 含 量 及 硝 態(tài) 氮(NO - 3 -N) 含 量; 利 用 醋 酸 銨 浸 提 土 壤 并 用 火 焰 分 光 光 度 計 測 定 土 壤 有 效 鉀(availableK,AK) 含 量; 利 用 碳 酸 氫 鈉 浸 提 土 壤 懸 液 并 用 鉬 銻 抗 比 色 法 測 定 土 壤 有 效 磷(availableP,AP) 含 量。 1.3.3 土 壤 酶 活 性 的 測 定 土 壤 酶 活 性 參 照 文 獻14 的 方 法 測 定。 其 中 采 用3,5- 二 硝 基 水 楊 酸 比 色 法 測 定 蔗 糖 酶 活 性, 采 用 苯 酚 鈉- 次 氯 酸 鈉 靛 酚 比 色 法 測 定 脲 酶 活 性, 采 用 高 錳 酸 鉀 滴 定 法 測 定 過 氧 化 氫 酶 活 性, 采 用 磷 酸 苯 二 鈉 比 色 法 測 定 磷 酸 酶 活 性。 1.3.4 土 壤DNA 的 提 取 及 土 壤 氮 素 循 環(huán) 功 能 基 因 豐 度 的 測 定 稱 取-80 保 存 的0.25g 土 壤 樣 品, 利 8 5 4 第3 期 呂 娜 娜, 等: 施 用 氨 基 酸 有 機 肥 對 黃 瓜 產(chǎn) 量 及 土 壤 生 物 學 性 狀 的 影 響 用 土 壤 強 力 提 取 試 劑 盒 提 取 土 壤 基 因 組 總DNA。 利 用 表2 中 引 物 擴 增 土 壤DNA, 然 后 將 擴 增 產(chǎn) 物 分 別 連 接 到pMD19-T 載 體 上, 轉(zhuǎn) 入 大 腸 桿 菌, 以10 倍 梯 度 稀 釋 的 標 準 溶 液 所 含 的 基 因 拷 貝 數(shù) 的 對 數(shù) 為 橫 坐 標, 以 相 對 應(yīng) 的 C T 值 為 縱 坐 標 作 圖, 所 得 曲 線 即 為 標 準 曲 線。 按 照SYBR 標 準 體 系 配 制 熒 光 定 量PCR 反 應(yīng) 液(20L 體 系):10LSYBR ® P r e m i x E x T a q,0.4L 上、 下 游 引 物,0.4LROXReferenceDye,2L 模 板DNA 和6.8L 無 菌 水。 以ddH 2 O 為 模 板 作 為 陰 性 對 照。 采 用ABI7500 熒 光 定 量PCR 儀 的 標 準 程 序 擴 增 測 定 氮 素 循 環(huán) 功 能 基 因 的 豐 度,PCR 擴 增 程 序 為: 95 預 變 性30s;95 預 變 性5s,60 延 伸34s, 循 環(huán)40 次。 根 據(jù) 各 樣 品 C T 值 計 算 每 克 土 壤 所 含 的 拷 貝 數(shù), 并 換 算 成 每 克 干 土 的 拷 貝 數(shù)。 1.4 統(tǒng) 計 分 析 采 用SPSS20.0 軟 件 對 數(shù) 據(jù) 進 行 單 因 素 方 差 分 析 及 顯 著 性 和 皮 爾 遜(Pearson) 相 關(guān) 性 檢 驗。 采 用R 軟 件“Vegan” 進 行 產(chǎn) 量 與 土 壤 酶 活 性、 氮 素 循 環(huán) 基 因 及 土 壤 理 化 性 質(zhì) 的 蒙 特 爾 卡 羅 相 關(guān) 性 檢 驗(Monte Carlotest)。 2 結(jié) 果 與 分 析 2.1 不 同 施 肥 處 理 對 黃 瓜 產(chǎn) 量 的 影 響 從 圖1 可 知: 與 不 施 肥 對 照 相 比, 單 施 化 肥、 施 用 雞 糞 有 機 肥 及 施 用 氨 基 酸 有 機 肥 處 理 均 能 顯 著 提 高 黃 瓜 產(chǎn) 量。 第1 季 各 施 肥 處 理 間 無 顯 著 差 異; 從 第2 季 開 始, 施 用 氨 基 酸 有 機 肥 處 理 產(chǎn) 量 顯 著 高 于 單 施 化 肥 或 施 用 雞 糞 有 機 肥 處 理; 第3 季 中, 與 不 施 肥 對 照 相 比, 施 用 氨 基 酸 有 機 肥 對 黃 瓜 的 增 產(chǎn) 效 果 達48.2%, 而 單 施 化 肥 和 施 用 雞 糞 有 機 肥 的 增 產(chǎn) 效 果 分 別 為29.5% 和30.6%。 圖1 不 同 施 肥 處 理 的 黃 瓜 產(chǎn) 量 Fig.1 ThecucumberyieldsofdifferentfertilizationtreatmentsCK: 不 施 肥 對 照;CF: 單 施 化 肥 處 理;OF: 施 用 雞 糞 有 機 肥 處 理;AOF: 施 用 氨 基 酸 有 機 肥 處 理。 不 同 小 寫 字 母 表 示 不 同 處 理 在0.05 水 平 顯 著 差 異。 下 同。 CK:Nofertilizationcontrol;CF:Singleapplicationofchemicalfertilizertreatment;OF:Applicationofchickenmanureorganicfertilizertreatment; AOF:Applicationofaminoacidorganicfertilizertreatment.Differentlowercaselettersindicatesignificantlydifferentindifferenttreatmentsat0.05 level.Thesameasfollows. 2.2 不 同 施 肥 處 理 對 土 壤 理 化 性 質(zhì) 的 影 響 不 同 施 肥 模 式 下, 黃 瓜 連 作 土 壤 的 基 本 理 化 性 質(zhì) 差 異 明 顯( 表3)。 盡 管 各 施 肥 處 理 及 不 施 肥 對 照 土 壤 總 氮 含 量、 總 碳 含 量、 碳 氮 比 及 有 效 鉀 含 量 無 顯 著 差 異, 但 各 施 肥 處 理 土 壤 有 效 磷、 銨 態(tài) 氮 含 量 顯 著 高 于 不 施 肥 對 照 土 壤, 而 各 施 肥 處 理 間 有 效 磷 及 銨 態(tài) 氮 含 量 無 顯 著 差 異。 此 外, 施 用 雞 糞 有 機 肥 和 施 用 氨 基 酸 有 機 肥 處 理 的 土 壤pH 值 顯 著 高 于 施 用 化 肥 處 理 和 不 施 肥 對 照, 且 施 用 雞 糞 有 機 肥 處 理 的pH 值 最 高。 單 施 化 肥 處 理 的 土 壤 硝 態(tài) 氮 含 量 最 高, 施 用 氨 基 酸 有 機 肥 處 理 的 土 壤 次 之, 兩 者 均 顯 著 高 于 施 用 雞 糞 有 機 肥 處 理 和 不 施 肥 對 照。 2.3 不 同 施 肥 處 理 對 土 壤 中 氮 素 循 環(huán) 微 生 物 數(shù) 量 的 影 響 在 連 作 黃 瓜 土 壤 上 連 續(xù) 施 用 不 同 肥 料 對 土 壤 中 氨 氧 化 古 菌(AOA) 和 氨 氧 化 細 菌(AOB) 數(shù) 量 的 影 響 不 同( 圖2)。 與 不 施 肥 對 照 相 比, 施 肥 處 理 土 壤 中 氨 氧 化 細 菌 的 數(shù) 量 顯 著 升 高; 施 用 氨 基 酸 有 機 肥 處 理 土 壤 中 氨 氧 化 細 菌 的 數(shù) 量 顯 著 低 于 單 施 化 肥 或 施 用 雞 糞 有 機 肥 處 理, 而 單 施 化 肥 及 施 用 雞 糞 有 機 肥 處 理 間 無 顯 著 差 異。 9 5 4 南 京 農(nóng) 業(yè) 大 學 學 報 第41 卷 表3 不 同 施 肥 處 理 的 土 壤 基 本 理 化 性 質(zhì) Table3 Basicsoilphysicochemicalpropertiesfordifferentfertilizationtreatments 土 壤 理 化 性 質(zhì)Soilphysicochemicalproperty CK CF OF AOF pH 7.12±0.08 c 7.15±0.03 c 7.55±0.02 a 7.35±0.03 b 銨 態(tài) 氮 含 量/(mg·kg -1 )NH + 4 -Ncontent 8.09±1.86 b 11.97±0.50 a 11.83±1.90 a 12.08±0.74 a 硝 態(tài) 氮 含 量/(mg·kg -1 )NO - 3 -Ncontent 12.24±1.19 c 27.44±1.96 a 13.11±0.50 c 17.83±1.89 b 總 氮 含 量/(g·kg -1 )TotalNcontent 1.84±0.04 a 1.84±0.08 a 1.81±0.14 a 1.85±0.08 a 總 碳 含 量/(g·kg -1 )TotalCcontent 14.22±1.71 a 14.60±1.30 a 16.15±1.32 a 16.06±0.72 a碳 氮 比 C/Nratio 7.75±1.15 a 7.93±0.39 a 8.69±0.04 a 8.57±0.13 a 有 效 磷 含 量/(mg·kg -1 )AvailablePcontent 218.46±11.77 b 253.80±24.17 a 259.46±10.30 a 266.29±15.91 a 有 效 鉀 含 量/(mg·kg -1 )AvailableKcontent 318.67±37.53 a 322.67±14.15 a 348.67±14.57 a 348.00±39.84 a 圖2 不 同 施 肥 處 理 土 壤 中 氨 氧 化 古 菌 (AOA ) 及 氨 氧 化 細 菌 (AOB )