<p>北方園藝（）： ·研究簡報·第一作者簡介：郭繼平（），女，博士，副教授，研究方向為植物病理。：責(zé)任作者：馬光（），男，博士，副教授，研究方向為植物生物技術(shù)。：基金項目：河北省青年拔尖人才支持計劃資助項目（）；河北省高等學(xué)校青年拔尖人才研究計劃資助項目（）。收稿日期：不同菌劑處理對葡萄葉片細菌多樣性的影響郭 繼 平，馬光，王 志 杰，齊 善 厚，王 寶 梅（衡水學(xué)院 生命科學(xué)系，河北 衡水；寶雞市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，陜西 寶雞）摘要：以噴施磚紅微桿菌和解淀粉芽孢桿菌菌劑后的葡萄葉片為試材，采用方法研究葡萄葉片表面細菌多樣性，以期闡明種菌劑對葡萄葉片細菌多樣性的影響。結(jié)果表明：經(jīng)過擴增出大小約為的細菌 可變區(qū)。經(jīng)電泳共標(biāo)記出條帶，其對應(yīng)葡萄葉片上的種已知細菌包括芽孢桿菌屬（）、微球菌屬（）、假單胞菌屬（）、鏈霉菌屬（）等和種非可培養(yǎng)細菌。其中磚紅微桿菌菌劑的細菌種類更為豐富，其中條特有條帶所代表的細菌類群包括微桿菌屬（）、馬杜拉放線菌屬（）、黃假單胞菌（ ）和簡單芽孢桿菌（ ）。聚類分析表明，菌劑處理后與對照及菌劑處理的葉片在細菌多樣性方面有明顯差別，而菌劑的處理與對照沒有差別。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，葡萄葉片噴施菌劑后，其表面細菌仍維持一定的多樣性。磚紅微桿菌菌劑可顯著提高葡萄葉片的細菌多樣性，而解淀粉芽孢桿菌對葡萄葉片細菌多樣性無顯著性影響。關(guān)鍵詞：葡萄葉片；菌劑；細菌多樣性；中圖分類號： 文獻標(biāo)識碼： 文章編號：（）葡萄（ ）是世界上普遍種植的重要水果和釀酒原料之一。隨著葡萄無公害生產(chǎn)技術(shù)的推進，生物拮抗菌劑在葡萄病害防治中的應(yīng)用越來越廣泛。生物菌劑的使用會影響葡萄葉片的微生物生態(tài)體系，改變葡萄葉片上的微生物多樣性。植物葉片微生物多樣性是衡量其群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的重要指標(biāo)。對葡萄葉片和果實微生物群落多樣性的研究已有相關(guān)報道。等通過技術(shù)研究了法國地區(qū)不同葡萄園中“美樂”葡萄上的附生細菌，發(fā)現(xiàn)其優(yōu)勢菌群為假單胞桿菌屬（）和 鞘 脂 單 胞 菌 屬 （）。張世偉等采用高通量測序技術(shù)對不同品種釀酒葡萄表皮的微生物群落進行了分析，結(jié)果顯示，細菌主要分布在變形菌門（）、放線菌門（）、厚壁菌門（）等個門，優(yōu)勢細菌主要是歐文氏菌屬（）、假單胞菌屬（）、芽孢桿菌屬（）等個屬。目前，利用變性梯度凝膠電泳（）技術(shù)進行微生物多樣性研究越來越多。以技術(shù)結(jié)合的技術(shù)高效快速，并且可重復(fù)性高，可在短時間獲取圖譜，并直觀的反映出樣品中各組分的豐富度。該研究采用技術(shù)，對葡萄葉片噴施磚紅微桿菌（）和解淀粉芽孢桿菌（）菌劑，研究不同菌劑對葡萄葉片表面細菌多樣性的影響，以期為生防菌劑防治葡萄病害提供生產(chǎn)指導(dǎo)，并為生物防治機理的研究提供數(shù)據(jù)支撐。 材料與方法 試驗材料供試磚紅微桿菌和解淀粉芽孢桿菌由衡水學(xué)院生命科學(xué)系微生物學(xué)實驗室前期研究篩選并保存，種細菌對葡萄霜霉病菌和白腐病菌均具有拮抗作用。 試驗方法 菌劑制備磚紅微桿菌菌劑：將活化好的磚紅微桿菌接入液體培養(yǎng)基中， 、·振蕩培養(yǎng)，當(dāng)發(fā)酵液中的活芽孢含量為億·時，加入吐溫、山梨醇。解淀粉芽孢桿菌菌劑：將活化好的解淀粉芽孢桿菌接入液體培養(yǎng)基中，、·振蕩培養(yǎng)，當(dāng)發(fā)酵液中的活芽孢含量為億·時，加入吐溫、山梨醇。 葡萄植株的菌劑噴施和取樣選擇年生葡萄樹株，將上述種菌劑分別稀釋倍，在：以后向葡萄葉片正反面和果實均勻噴灑，次重復(fù)。對照組不噴灑稀釋菌液，保證其它條件與試驗組一致。從月日起，每間隔噴灑次，共噴灑次，月日取樣進行測定。每組處理分別隨機采摘個葡萄葉片，次重復(fù)。 基因組的提取和純化將葉片的反正面均用無菌水沖洗次，收集沖洗后的水溶液， ·離心，棄上清收集菌體，再按 試劑盒說明提取總，并采用天根的凝膠回收試劑盒基因組進行純化。 細菌 區(qū)的擴增以樣品基因組為模板，采用細菌通用引物和擴增樣品高變區(qū)序列。引物：； 引 物：。擴增體系（）：× ；（·）； 酶（·）；（·）；（·）；模 板 ；補至。擴增程序為預(yù)變性；變性，復(fù)性，延伸，個循環(huán)；最終延伸。產(chǎn)物采用公司 純化回收。 產(chǎn)物的變性梯度凝膠電泳（）分析制備濃度為，即變性梯度范圍為的聚丙烯酰胺凝膠，取 產(chǎn)物進行變形梯度凝膠電泳（）分析，在×緩沖液中、下電泳。采用銀染法染色，使用紫外凝膠系統(tǒng)拍照，并用軟件分析結(jié)果。 圖譜中優(yōu)勢條帶的回收與測序根據(jù)圖譜中樣品條帶數(shù)目及每個條帶的強度（灰度），采用軟件對每樣品的電泳條帶數(shù)目、條帶密度進行數(shù)字化分析，確定測序條帶。采用公司 回收目的條帶。以回收產(chǎn)物為模板，為引物進行擴增。擴增體系（）：× ；（·）； 酶（·）；（·）；（·）；模板 ；補至。擴增程序：預(yù)變性；變性，復(fù)性，延伸，個循環(huán)；最后，延伸。將重新擴增的片段切膠回收、純化后，連接到載體上，并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞中，篩選陽性克隆，進行序列測定。 數(shù)據(jù)分析測得的序列在數(shù)據(jù)庫進行相似性比較。將測序結(jié)果和代表性菌株的部分序列用程序 進行序列比對測序，依據(jù) 戴 斯 相 似 系 數(shù)并 采 用 軟 件 構(gòu)建進化樹，分析親緣關(guān)系及相似性，對各樣品中細菌多樣性等指標(biāo)進行分析。 第期北方園藝 結(jié)果與分析 細菌 可變區(qū)的擴增采用細菌通用引物和擴增出的目的片段大小均約為（圖）。條帶經(jīng)過瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化回收后滿足電泳的條件。注： ；對照。： ；圖細菌可變區(qū)的擴增 細菌的圖譜分析由圖可知，圖譜均可以分離出清晰的電泳條帶，說明葡萄葉片上的細菌多樣性較高。個處理和對照的條帶的相對強度和遷移率不完全相同，說明三者中既存在共有細菌種群，又存在特有細菌。在圖譜分析軟件給出的條條帶（圖）中，與對照相比，噴施磚紅微桿菌菌劑特有的電泳條帶有條，說明噴施該菌劑后改變了葉片局部的微生態(tài)環(huán)境，使細菌菌群的種類更加豐富。與對照相比，噴施解淀粉芽孢桿菌菌劑后的電泳條帶與對照無顯著差異，說明噴施菌劑后葉片的細菌種群無明顯變化，也進一步反映對葡萄葉片的微環(huán)境的影響較小。圖對照和處理組細菌的圖譜 測序結(jié)果分析對圖中標(biāo)注的條條帶進行了克隆和測序。由表可知，種條帶所代表的細菌與表葡萄葉片細菌條帶測序結(jié)果 測序條帶編號 比對結(jié)果 序列登錄號 相似度 微桿菌屬 &nbsp; 馬杜拉放線菌屬 &nbsp; 黃假單胞菌 &nbsp; &nbsp; 簡單芽孢桿菌 &nbsp; &nbsp; 產(chǎn)氧光合細菌 &nbsp; &nbsp; 食烷菌 &nbsp; &nbsp; 灰色鏈霉菌 &nbsp; &nbsp; 枯草芽孢桿菌 &nbsp; &nbsp; 地衣芽孢桿菌 &nbsp; &nbsp; 葡萄假單胞菌 &nbsp; &nbsp; 非可培養(yǎng)細菌 &nbsp; &nbsp; 藤黃微球菌 &nbsp; &nbsp; 短桿菌屬 &nbsp; 非可培養(yǎng)細菌 &nbsp; &nbsp; 解淀粉芽孢桿菌 &nbsp; &nbsp; 固氮菌屬 &nbsp; 微球菌屬 &nbsp;北方園藝月（下）公布的序列的最大相似度均在以上。包括種已經(jīng)被培養(yǎng)鑒定的細菌和種尚未被鑒定的非可培養(yǎng)細菌。與對照和噴施解淀粉芽孢桿菌菌劑的葡萄葉片相比，噴施磚紅微桿菌菌劑的葡萄葉片的細菌種類更為豐富，其中特有的條帶所代表的微生物類群為微桿菌屬（）、馬杜拉放線菌屬（）、黃假單胞菌（ ）和簡單芽孢桿菌（ ）。 聚類分析從圖可以看出，對照和處理的重復(fù)樣品一共分為類，第一類為菌劑處理的次重復(fù)樣品，第二類為和菌劑處理的次重復(fù)樣品。處理單獨在一個枝上，說明其與對照及菌劑處理的葉片表面在細菌多樣性上具有明顯差別。而噴施菌劑處理與對照聚在一個枝上，說明二者在葉片表面細菌多樣性上沒有差別，這也與中圖譜的結(jié)果相對應(yīng)。圖處理和對照的聚類分析 系統(tǒng)發(fā)育分析由圖可以看出，所測序列分為個大枝。條帶和藤黃微球菌（ ：）聚為一個大枝。另一個大枝分為組：條帶、和聚為一組；條帶、和聚為一組；條帶和為一組；條帶、和為一組。從系統(tǒng)發(fā)育樹可看出，聚在一枝的序列均是相近種屬，該發(fā)育樹的多個分支代表不同的細菌，體現(xiàn)出一定的多樣性?？梢娖咸讶~片噴施菌劑后其表面的細菌仍維持一定的多樣性。注：數(shù)字代表表中的測序條帶編號。： 圖葡萄葉片上細菌的系統(tǒng)發(fā)育分析 討論從目前研究看，對葡萄果實上的細菌類群的研究更多一些。葡萄葉片和果實上的附生細菌種類既存在相似性，但又有各自獨特的類群。如張世偉等通過研究不同品種釀酒葡萄表皮的微生物群落發(fā)現(xiàn)，優(yōu)勢細菌主要是歐文氏菌屬（）、假單胞菌屬（）、芽孢桿菌屬（）、丙酸桿菌屬（）、和小雙孢菌屬（）等個屬。等發(fā)現(xiàn)“霞多麗”葡萄上的優(yōu)勢菌屬為假單胞菌屬（）。等發(fā)現(xiàn)“美樂”葡萄上的優(yōu)勢菌屬為假單胞菌屬（）和鞘脂單胞菌屬（）。該研究中葡萄葉片表面上的細菌也是以假單胞菌屬（）和芽孢桿菌屬（）為主，說明葡萄植株中的不同部位如葉片和果實處于相同的生態(tài)環(huán)境中，細菌類群具有一定的相似性，但葉片和果實的營養(yǎng)和微環(huán)境又具有各自的特點，所以又存在一定的特異性。 第期北方園藝世紀(jì)年代以來，研究者一直采用分離培養(yǎng)的方法來研究微生物多樣性，而事實上一些微生物經(jīng)常處于“活的非可培養(yǎng)狀態(tài)”。盡管研究人員利用看家基因（特別是基因）了解混合細菌群落的特征，許多新的微生物種系型被發(fā)現(xiàn)。但在實際研究中，只有通過分離得到純培養(yǎng)物種，才能夠?qū)υ撐锓N的生理生化綜合特征和潛在致病性進行充分的評價。通過實驗室人工培養(yǎng)方法已經(jīng)分離和描述的微生物物種數(shù)量僅占估計數(shù)量的，而其余的微生物類群仍然未被分離和認(rèn)識。因此，對于非可培養(yǎng)細菌的培養(yǎng)一直是研究的重點和難點。通過現(xiàn)代分子生物技術(shù)，可以繞過純培養(yǎng)的手段來研究微生物的多樣性，使其進入了一個嶄新的研究階段。變性梯度凝膠電泳（）技術(shù)在微生物群落多樣性和種群動態(tài)監(jiān)測中得到廣泛應(yīng)用。該研究采用技術(shù)發(fā)現(xiàn)條帶和條帶均為非可培養(yǎng)細菌，需進一步進行研究鑒定。等應(yīng)用技術(shù)研究了不同種植園中葡萄內(nèi)生細菌多樣性，特征條帶測序結(jié)果顯示，圖譜中顯示的優(yōu)勢細菌多數(shù)為不可培養(yǎng)細菌，說明非可培養(yǎng)細菌在葡萄植株上大量存在。參考文獻 ， ， ， ，（）： ， ， ， ， ， ，（）：張世偉，陳曦，鐘其頂不同品種釀酒葡萄表皮微生物群落多樣性分析生物技術(shù)通報，（）：劉蓓一，丁成龍，喬偉艷，等利用技術(shù)研究稻草與黑麥草混合青貯過程中菌群的動態(tài)變化江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，（）：冉淦僑，張紅艷，任平技術(shù)監(jiān)測自然發(fā)酵葛根中微生物菌群動態(tài)變化生物技術(shù)通報，（）：劉沛應(yīng)用技術(shù)研究低分子量聚乙烯粉末對土壤細菌遺傳多樣性的影響成都：四川師范大學(xué)，馬俊孝，季明杰，孔健技術(shù)在微生物物種多樣性研究中的局限性及其解決措施食品科學(xué)，（）： ， ： ： ： ， ， ， ？，： ， ，：張秀敏，滕忠才，任凱“非可培養(yǎng)的”細菌研究進展安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，（）：， ， ： ，（）：劉慧杰，楊彩云，田蘊基于技術(shù)的紅樹林區(qū)微生物群落結(jié)構(gòu)微生物學(xué)報，（）： ， ， ， ，（）： ， ， ， ， （ ， ， ； ， ）： （） （） ， ， ， 北方園藝月（下）北方園藝（）： ·設(shè)施園藝·第一作者簡介：馮爭光（），男，碩士，副研究員，研究方向為果樹設(shè)施栽培。：基金項目：河北省科技支撐計劃資助項目（）。收稿日期：不同落葉時期和落葉方式對設(shè)施桃無需冷栽培萌芽率的影響馮 爭 光，胡青，楊 金 庫，王 桂 英，劉 曉 杰（廊坊市農(nóng)林科學(xué)院，河北 廊坊；滄州市園林綠化局，河北 滄州）摘要：以年生“中農(nóng)金輝”油桃為試材，在設(shè)施無需冷栽培方式下，采用不同落葉時期和落葉方式對油桃進行處理，分析了不同處理方式對油桃萌芽率的影響。結(jié)果表明：在設(shè)施桃無需冷栽培中，不同落葉時期對萌芽率的影響差別很大，從月開始，萌芽率逐漸升高，在月中下旬時萌芽率達到最高，之后萌芽率開始下降，到月下旬時萌芽率降低為；不同落葉方式同樣對萌芽率的影響很大，其中避光悶棚落葉的萌芽率最高，與人工摘葉和尿素脫葉相比差異極顯著。由此篩選出了設(shè)施桃無需冷栽培方式下最適宜的落葉時期為月中下旬，最適宜的落葉方式為避光悶棚落葉。關(guān)鍵詞：落葉時期；落葉方式；設(shè)施桃；無需冷栽培；萌芽率中圖分類號： 文獻標(biāo)識碼： 文章編號：（）我國設(shè)施桃栽培起步較晚，世紀(jì)年代逐漸興起，栽培區(qū)域主要集中在黃河以北，其中以山東、遼寧、河北省栽培面積最大，約占全國設(shè)施桃栽培總面積的。據(jù)年統(tǒng)計數(shù)據(jù)，目前我國設(shè)施桃栽培總面積約萬，年產(chǎn)值約億元。對設(shè)施桃栽培而言，一般上市時間越早收益越高，而一直以來，在設(shè)施桃栽培中只有滿足了不同品種的需冷量之后才能升溫促生產(chǎn)，這是目前制約設(shè)施桃成熟期無法大幅提前的根本因素，致使設(shè)施桃的成熟期一直處于月。且隨著設(shè)施桃栽培規(guī)模的逐年擴大，果品集中上市的現(xiàn)象越來越嚴(yán)重，栽培效益亦越來越低。等把木本植物的休眠進程分成個階段：“預(yù)休眠相”“內(nèi)休眠相”和“環(huán)境休眠相”。等研究表明在淺內(nèi)休眠期，芽的休眠狀態(tài)可通過人工摘葉或化學(xué)藥劑處理等打破。高東升等以年生“曙光”油桃為試材，研， ， ， ， ， ： ； ； ；</p>