菊花抗白色銹病相關(guān)基因CmDREBa-2的克隆及表達分析.pdf
<p>園藝學(xué)報， 2018， 45 (5)： 977 987. Acta Horticulturae Sinica doi： 10.16420/j.issn.0513-353x.2017-0441； http： /www. ahs. ac. cn 977 收稿日期 ： 2017 11 20； 修回日期 ： 2018 04 26 基金項目 ： 遼寧省自然科學(xué)基金項目（ 2014027004） ；遼寧省教育廳科學(xué)研究計劃項目（ L2015483） * 通信作者 Author for correspondence（ E-mail： maohongyu74163.com） 菊花抗白色銹病相關(guān)基因 CmDREBa-2 的克隆及表達分析 熊超明1，趙興華2，賈紅梅1，延 昕1，毛洪玉1,*（1沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，沈陽 110866；2遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所，沈陽 110161） 摘 要： 以菊花（ Chrysanthemum morifolium）免疫白色銹病品種 C029為試驗材料，基于白色銹病病原菌誘導(dǎo)的菊花轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，采用 RACE（ rapid-amplification of cDNA ends）方法克隆得到菊花DREB（ Dehydration responsive element binding protein）基因，命名為 CmDREBa-2。對其進行生物信息學(xué)分析和表達分析，結(jié)果表明： CmDREBa-2 開放閱讀框（ ORF）全長 291 bp，編碼 96 個氨基酸；預(yù)測CmDREBa-2 蛋白相對分子質(zhì)量為 11 159.04， pI 為 11.34，是一個定位于細胞核、親水的不穩(wěn)定蛋白；氨基酸序列和結(jié)構(gòu)分析顯示該蛋白含有 1 個由 49 個氨基酸殘基組成的 AP2 保守結(jié)構(gòu)域，所以該蛋白屬于AP2/EREBP 家族；進化樹分析表明 CmDREBa-2 屬于 DREB 家族的 A-1 組， CmDREBa-2 蛋白與菊花的其他兩個 DREB 類蛋白 CmDREBa 和 CmDREBb 的同源性較高；菊花 C029接種白色銹病病原菌 6 h后， CmDREBa-2 表達量達到最高，約為未接菌對照的 34 倍；用水楊酸（ SA） 、茉莉酸甲酯（ MeJA）和乙烯利（ ETH）處理 C029菊花葉片，結(jié)果表明 CmDREBa-2 受 3 種激素的誘導(dǎo)表達。 關(guān)鍵詞： 菊花； CmDREBa-2；基因克隆；生物信息學(xué)分析；表達分析 中圖分類號： S 682.1+1 文獻標志碼： A 文章編號： 0513-353X（ 2018） 05-0977-11 Cloning and Expression Analysis of CmDREBa-2， A Resistance-related Gene to Chrysanthemum White Rust XIONG Chaoming1， ZHAO Xinghua2， JIA Hongmei1， YAN Xin1， and MAO Hongyu1,*（1College of Forestry， Shenyang Agricultural University， Shenyang 110866， China；2Institute of Flowers， Liaoning Academy of Agricultural Sciences， Shenyang 110161， China） Abstract： Based on the information of transcriptome database derived from C029 ， a Puccinia horiana Henn. immune Chrysanthemum morifolium cultivar， the cDNA sequence of DREB（ Dehydration responsive element binding protein） was cloned. This DREB gene was named CmDREBa-2. Sequence analysis showed that the open reading frame（ ORF） of CmDREBa-2 was 291 bp， encoding 96 amino acids. The molecular weight of the predicted protein was 11 159.04 and the pI value was 11.34. The protein was located in the nucleus， and it was a hydrophilic and unstable protein. The transcription factor of CmDREBa-2 contained the AP2 DNA binding domain which was composed by 49 amino acids. The results of phylogenetic analysis showed that the CmDREBa-2 belonged to the DREB family of A-1 and it Xiong Chaoming， Zhao Xinghua， Jia Hongmei， Yan Xin， Mao Hongyu. Cloning and expression analysis of CmDREBa-2， a resistance-related gene to chrysanthemum white rust. 978 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (5)： 977 987. had a close relationship with CmDREBa and CmDREBb from C. morifolium. The expression level of CmDREBa-2 reached a maximum at 6 h after Puccinia horiana Henn. infection， with 34 times as much as the control. We also found that the expression of CmDREBa-2 was induced by SA， MeJA and ETH. Keywords： chrysanthemum； CmDREBa-2； cloning； bioinformatics analysis； expression analysis 菊花白色銹?。?chrysanthemum white rust， CWR）是一種重要的世界性菊花病害。該病最早于1895 年在日本被發(fā)現(xiàn)， 1901 年 Hennings 將此病原菌鑒定為 Puccinia horiana Henn.（ Whipps， 1993） 。近年來該病在印度（ Sriram et al.， 2015） ，美國（ Bonde et al.， 2014， 2015）以及中國的山東（丁世民和席敦芹， 2001） 、吉林（范文忠 等， 2002） 、沈陽（田秀玲 等， 1999） 、蘭州（梁偉， 2003）均有發(fā)生，危害中國菊花的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。 DREB 轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子， Stockinger 等（ 1997）首次從擬南芥中分離出來。大量研究結(jié)果表明， DREB 在植物中過量表達，可以顯著提高對脅迫的抗性，并具有一定的廣譜效應(yīng)。將擬南芥 AtDREB1A 轉(zhuǎn)入地被菊，其可以在常規(guī)雜交育種中穩(wěn)定遺傳，并能夠提高轉(zhuǎn)基因地被菊耐干旱和鹽漬脅迫（洪波 等， 2006） 、耐低溫（張曉嬌 等， 2011）和耐水分脅迫（于洋 等， 2011；楊英杰 等， 2013）的能力。在菊花中 DREB2A 受高溫、低溫、干旱、 ABA 和高鹽脅迫誘導(dǎo)表達，可能在提高菊花逆境脅迫耐受性方面也起著重要作用（ Liu et al.， 2008） 。此外，近年來在高粱（謝登雷 等， 2013） 、白菜（劉曉穎 等， 2013)、草莓（張勇 等， 2014） 、向日葵（梁春波 等， 2015） 、茶樹（劉志薇 等， 2015） 、西藏砂生槐（ Yao et al.， 2016）和香樟（李勇鵬 等， 2016）等植物中也發(fā)現(xiàn) DREB 基因?qū)Φ蜏?、高溫、干旱、鹽害都有抵御作用。 但是 DREB 基因參與植物抵御生物脅迫方面的研究鮮有報道。 Chini 等 （ 2004） 在非依賴型 ABA脫水反應(yīng)通路中發(fā)現(xiàn) DREB2A 與抗病激活信號通路相聯(lián)系，在板栗中非生物脅迫也明顯地誘導(dǎo)了囊泡抗真菌蛋白的表達（ Pernas et al.， 2000） 。這說明植物體內(nèi)生物和非生物脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中很可能存在互作， 在一定程度上也說明了 DREB 基因可能參與植物對生物脅迫的響應(yīng)。 菊花品種 C029是一個免疫白色銹病的品種，可作為菊花抗白色銹病育種的資源材料。在課題組的前期研究中，通過對感病（ C008 ）和抗?。?C029 ）品種進行轉(zhuǎn)錄組測序分析，獲得了 14 個差異表達基因（ Dong et al.， 2018） ，其中 CmDREBa-2 在接菌后表達量明顯上升，從而推測其與菊花抗白色銹病相關(guān)，所以明確 CmDREBa-2 抗病反應(yīng)的分子機制，可以為菊花白色銹病抗性育種提供借鑒。 1 材料與方法 1.1 材料及處理 試驗于 2016 2017 年在沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院進行，菊花免疫白色銹病品種 C029 ，由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院花卉基地提供。選取生長健壯的 C029組培苗，用手指涂抹法將白色銹病病原菌（ Puccinia horiana Henn.）接種到組培苗的第 2 5 枚葉片，未接菌的組培苗作為對照，分別于接菌后 0、 1、 6、 10、 18、 24、 36、 48、 72 和 96 h 時采集葉片，置于液氮中冷凍， 80 冰箱保存?zhèn)溆?。分別用 0.1 mmol · L-1SA， 50 mol · L-1MeJA 和 0.5 g · L-1 ETH 噴灑生長健壯的 C029的組培苗葉片表面，噴灑清水的組培苗作為對照，每個處理重復(fù) 3 次，然后于 0、 1、 6、 12、 24 和 48 h采集第 2 5 枚葉片，馬上置于液氮中冷凍， 80 冰箱保存?zhèn)溆谩? 熊超明，趙興華，賈紅梅，延 昕，毛洪玉 . 菊花抗白色銹病相關(guān)基因 CmDREBa-2 的克隆及表達分析 . 園藝學(xué)報， 2018， 45 (5)： 977 987. 979 1.2 CmDREBa-2 全長的獲得及檢測 總 RNA 的提取按照 RNA prep Pure Plant Kit 試劑盒說明書進行， cDNA 的合成按照 Prime ScripTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒說明書進行。 根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，采用 Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計 3 條特異性 5RACE 引物和兩條特異性3RACE 引物（表 1） ，由生工生物工程（上海）股份有限公司進行合成。 PCR 反應(yīng)體系和擴增方法參照 Clontech 公司的 SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit User Manual。 PCR 產(chǎn)物進行電泳并對目的條帶進行切膠回收純化，純化產(chǎn)物與 pMD18T 進行連接，轉(zhuǎn)化后送至生工生物工程（上海）股份有限公司直接測序。 用 DNAMAN 軟件與中間片段拼接得到 cDNA 全長。 利用拼接得到的 cDNA 全長序列設(shè)計該基因的特異片段擴增引物（表 1） ， PCR 擴增得到特異序列，產(chǎn)物進行 1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的片段回收純化后連接 pMD18T 載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，至少篩選 3 個陽性克隆送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。 1.3 生物信息學(xué)分析 序列同源性分析采用 GenBank 的 BLAST 程序，開放閱讀框框查找采用 NCBI ORF Finder，氨基酸、序列比對、進化樹分析采用 DNAMAN 2.6 和 MEGA 5.0 軟件；采用 ProtParam 數(shù)據(jù)庫（ http： / expasy.org /tools /protparam.html）分析氨基酸序列的多個物理和化學(xué)參數(shù)（分子量、等電點、親水性等） 。采用 SOPMA 程序（ http： /npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa）對蛋白進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測；使用SWISS-MODEL（ http： /swissmodel.expasy.org/）在線軟件預(yù)測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)；利用 PSORT（ http： / wolfpsort.org/）進行亞細胞定位的預(yù)測。 1.4 基因表達分析 采用 qPCR 技術(shù)分析 CmDREBa-2 在白色銹病病原菌誘導(dǎo)下和外源生長調(diào)節(jié)劑處理下不同時間點的表達情況，以 Actin 基因為內(nèi)參，反應(yīng)引物見表 1，按照 SYBR®Premix Ex TaqTM使用說明在StepOnePlus 進行 qPCR 反應(yīng)。每個樣品設(shè)有 3 次重復(fù)。反應(yīng)條件為： 95 30 s； 95 5 s， 60 30 s，變性到延伸循環(huán) 40 次； END（熔解曲線） ： 95 15 s， 60 1 min， 95 15 s。采用 2-CT法分析結(jié)果。 表 1 CmDREBa-2 的克隆和定量 PCR 所用引物 Table 1 Primers used for cloning and RT-PCR of CmDREBa-2 用途 Primer function 引物 Primer 序列（ 5 3） Sequence 管家基因擴增 Housekeeping gene amplification Actin-F Actin-R CCACTTAATCCAAAAGCCAA ACCATCACCAGAATCCAACA CmDREBa-2 RT-PCR q-CmDREBa-2-F q-CmDREBa-2-R AAACTTCCTACTCCTTACACCTC GTACATACCTCTTTACAACCACA 轉(zhuǎn)錄組序列驗證 The transcriptome sequence primers B055-F B055-R ATGTTGGCTTCACAAACC CGAGGACTGCGGGATAGG 5 RACE 特異性引物 Gene specific primers for 5 RACE GSP1 GSP2 GSP3 CAGCGGTGTCATGTGT ACTTCCTACTCCTTACACC TGGGTGTCGTGTCTCCTTG 3 RACE 特異性引物 Gene specific primers for 3 RACE C038-1 C038-2 ACACATGACACCGCTGACATGGCA ATGAGAGGTCGATCCGCGTGTTTA 特異擴增引物 Specific amplification primer CmDREBa-2-F CmDREBa-2-R ATGCATATCGAATCACAATACCTT CTAAAAACACCTCAACGACATGTC Xiong Chaoming， Zhao Xinghua， Jia Hongmei， Yan Xin， Mao Hongyu. Cloning and expression analysis of CmDREBa-2， a resistance-related gene to chrysanthemum white rust. 980 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (5)： 977 987. 2 結(jié)果與分析 2.1 CmDREBa-2 的克隆 以菊花 C029接菌處理 6 h 的 cDNA 為模板，利用轉(zhuǎn)錄組序列驗證引物進行 RT-PCR 得到 240 bp 的條帶（圖 1， a） ，測序后在 NCBI 數(shù)據(jù)庫 進 行 BLAST，發(fā)現(xiàn)其與已知菊花（ Chrysanthemum morifolium）材料的 DREB 基因具有較高同源性。以此片段為基礎(chǔ)設(shè)計特異性引物（表 1），獲得 535 bp 的 3端序列（圖 1， b）和 284 bp 的 5端序列（圖 1， c） 。用 DNAMAN 軟件與中間片段拼接得cDNA 全長，全長為 834 bp，并設(shè)計特異引物（表 1）擴增，獲得 533 bp 的特異序列（圖 1， d） 。特異片段測序結(jié)果與拼接序列進行比對，兩者吻合度達到 98.74%，兩者編碼的氨基酸序列比對也幾乎一致，差異氨基酸位于 AP2 結(jié)構(gòu)域下游。 cDNA 序列在 NCBI 網(wǎng)站進行 BLAST，結(jié)果顯示全長序列與菊花另外兩個 DREB 序列（ EF490996.1， EF487535.1）有較高的同源性，因此將該基因命名為CmDREBa-2。 圖 1 基因克隆電泳圖 a：轉(zhuǎn)錄組片段； b： 3RACE 產(chǎn)物； c： 5RACE 產(chǎn)物； d：特異擴增。 Fig. 1 Electrophoresis results of CmDREBa-2 cloning a： Transcriptome fragment； b： 3 fragment； c： 5 fragment； d： Specific amplification. 2.2 CmDREBa-2 的生物信息學(xué)分析 2.2.1 序列特征分析 CmDREBa-2 cDNA 全長 834 bp。 NCBI ORF Finder 分析序列表明該序列包含 179 bp 5 UTR（非編碼區(qū)）和 363 bp 3 UTR， 3端還有一段全長為 29 bp 的 polyA 加尾信號。 ORF Finder 分析表明，CmDREBa-2 的開放閱讀框有 291 bp，編碼 96 個氨基酸（圖 2） 。利用 ProtParam 預(yù)測 CmDREBa-2所編碼的蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量為 11 159.04，理論等電點 pI 為 11.34，氨基酸序列中 Arg 的使用率最高，占 14.6%，蛋白分子式為 C491H806N160O130S4。該蛋白總的負電荷殘基數(shù)為 7 個，總的正電荷殘基數(shù)為 23 個，不穩(wěn)定系數(shù)為 53.65，為不穩(wěn)定蛋白，該蛋白的親水性區(qū)域大于疏水性區(qū)域，平均疏水性為 0.742，即為親水性蛋白；亞細胞定位預(yù)測表明該蛋白定位于細胞核上。 使用 NCBI CDD（ Conserved Domain Database）數(shù)據(jù)庫分析 CmDREBa-2 全長序列中可能有的蛋白功能結(jié)構(gòu)域，該蛋白有 1 個典型的 AP2 保守結(jié)構(gòu)域（圖 2）,分布在第 22 70 位氨基酸之間,并且 AP2 結(jié)構(gòu)域的第 14 位為纈氨酸（ V） ，但第 19 位不是通常的谷氨酸（ E）而是組氨酸（ H） ，與CmDREBa（ ABO93604.1）相同（圖 2，圖 3）,這也符合 DREB 轉(zhuǎn)錄因子的典型特征。由此推測, CmDREBa-2 屬于 DREB 轉(zhuǎn)錄因子基因。 熊超明，趙興華，賈紅梅，延 昕，毛洪玉 . 菊花抗白色銹病相關(guān)基因 CmDREBa-2 的克隆及表達分析 . 園藝學(xué)報， 2018， 45 (5)： 977 987. 981 圖 2 菊花 CmDREBa-2 基因的 cDNA 全長序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列 劃直線處為 CmDREBa-2 氨基酸的特征序列，虛線處為 AP2/EREB-DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域， 曲線處為 polyA 尾，方框表示起始密碼子和終止密碼子。 Fig. 2 cDNA and deduced amino acid sequences of CmDREBa-2 oxidase gene from Chrysanthemum The amino acids underlined are CmDREBa-2 character sequences， the amino acids with imaginary line are AP2/EREB-DNA binding domain， the amino acids with wavy line are polyA， the translation start and stop codons are framed. 2.2.2 編碼蛋白的序列同源性比較 利用蛋白比對，在 NCBI 數(shù)據(jù)庫中找到了 6 個菊科植物： 4 個菊花（ ABO93604.1、 ABS11982.1、ACU00263.1、 ABD90468.1） 、 1 個向日葵（ XP_021984743.1）和 1 個紫莖澤蘭（ ADE62311.1）同源蛋白。利用 DNAMAN 軟件進行氨基酸序列比對，結(jié)果表明， CmDREBa-2 與這 6 個菊科植物都具有 AP2保守結(jié)構(gòu)域，同源性分別為 38.54%、 38.92%、 33.50%、 32.51%、 40.99%和 30.14%，其同源性不高的主要原因是 CmDREBa-2 基因編碼的氨基酸太少（圖 3） 。比對結(jié)果顯示， CmDREBa-2 蛋白中的 AP2 結(jié)構(gòu)域中缺少以“ RVWLG”為主體構(gòu)成的 3 保守區(qū)域（圖 3） ，使得 CmDREBa-2 蛋白中的 AP2 結(jié)構(gòu)域較短，可能因此它才能夠參與生物脅迫應(yīng)答，但其具體功能需要進一步試驗揭示。 2.2.3 蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)分析 利用 SMOPA 數(shù)據(jù)庫（ http： /npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa）對 CmDREBa-2 蛋白進行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果表明，該蛋白由 26.04%的 螺旋， 15.62%的 折疊， 5.21%的 轉(zhuǎn)角和 53.13%的隨機卷曲組成。由此可知隨機卷曲結(jié)構(gòu)是 CmDREBa-2 蛋白的主要組成部分，而 螺旋和 折疊則分散在蛋白序列中（圖 4， a） 。 由 SWISS-MODEL 模擬出的 CmDREBa-2 的三級結(jié)構(gòu)（圖 4， b） ，其結(jié)構(gòu)較為簡單，只含有 1個 螺旋和 3 個 折疊， 4 個組分間以 轉(zhuǎn)角（ loop）相連接。 Xiong Chaoming， Zhao Xinghua， Jia Hongmei， Yan Xin， Mao Hongyu. Cloning and expression analysis of CmDREBa-2， a resistance-related gene to chrysanthemum white rust. 982 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (5)： 977 987. 圖 3 CmDREBa-2 氨基酸序列與近緣物種 DREB 類蛋白的多重比對 Fig. 3 Protein multi-alignment of CmDREBa-2 with C4Hs from other plants 圖 4 CmDREBa-2 蛋白的二級結(jié)構(gòu)（ a）與三級結(jié)構(gòu)預(yù)測（ b） Fig. 4 The secondary structure（ a） and three-dimension structures（ b） of the deduced CmDREBa-2 polypeptide 熊超明，趙興華，賈紅梅，延 昕，毛洪玉 . 菊花抗白色銹病相關(guān)基因 CmDREBa-2 的克隆及表達分析 . 園藝學(xué)報， 2018， 45 (5)： 977 987. 983 2.3 CmDREBa-2 蛋白分子的系統(tǒng)進化樹 為了分析試驗中得到的 CmDREBa-2 與 DREB 轉(zhuǎn)錄因子的關(guān)系，將 CmDREBa-2 蛋白與部分菊科植物和擬南芥 DREB 家族蛋白進行同源性比較，利用 MEGA5.05 軟件，采用鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。結(jié)果（圖 5）表明： CmDREBa-2 屬于 DREB 家族的 A-1 組，并且擬南芥和菊科植物 DREB 沒有位于同一小分支，這也說明了 DREB 蛋白在不同植物中具有較高的保守性， CmDREBa-2 與菊花另外兩個 DREB 關(guān)系最近,尤其是 CmDREBa， 這也是 CmDREBa-2 命名的緣由。 圖 5 CmDREBa-2 和其他 DREB 蛋白的系統(tǒng)進化樹 Cm：菊花； Aa：紫莖澤蘭； Ha：向日葵； At：擬南芥。 Fig. 5 Phylogenetic tree of CmDREBa-2 and DREB from other plants Cm： Chrysanthemum morifolium； Aa： Ageratina adenophora； Ha： Helianthus annuus； At： Arabidopsis thaliana. 2.4 CmDREBa-2 的表達分析 2.4.1 在白色銹病病原菌誘導(dǎo)下表達特異性分析 菊花品種 C029在接種白色銹病病原菌后， CmDREBa-2 表達明顯受白色銹病病原菌誘導(dǎo)。由圖 6 可知，在接菌處理后的 6、 10、 18、 24 和 72 h， CmDREBa-2 的表達量顯著高于未接菌的對照，分別為未接菌對照的 34 倍、 4 倍、 7 倍、 2.8 倍和 2.7 倍。 2.4.2 在SA、 MeJA和ETH誘導(dǎo)下表達特異性分析 對菊花品種 C029進行茉莉酸甲酯（ MeJA）處理后， CmDREBa-2 表達量出現(xiàn)明顯變化，分別于 6、 24 和 48 h 顯著高于清水對照，大約為清水對照的 2 倍、 3 倍和 2.8 倍。外源乙烯利（ ETH）處理后， CmDREBa-2 表達量呈現(xiàn)一直上升的趨勢，均顯著高于清水對照，并在 48 h 達到峰值，為清水對照的 4 倍。外源水楊酸（ SA）處理后， CmDREBa-2 表達量和 MeJA 處理后表達趨勢一致，但變化幅度更大，在 6 和 24 h 顯著高于清水對照，均為清水對照的 3 倍（圖 7） 。 Xiong Chaoming， Zhao Xinghua， Jia Hongmei， Yan Xin， Mao Hongyu. Cloning and expression analysis of CmDREBa-2， a resistance-related gene to chrysanthemum white rust. 984 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (5)： 977 987. 圖 6 菊花 C029葉片接種白銹病病原菌后 CmDREBa-2 的表達情況 * 表示不同處理在同一時間點表達差異顯著（ Tukeys test， P < 0.05） 。 Fig. 6 Expression levels of CmDREBa-2 gene under Puccinia horiana treatments in C029 chrysanthemum * means significant difference in the same time between the two treatments（ Tukeys test， P < 0.05） . 圖 7 菊花 C029葉片在 MeJA、 SA 和 ETH 處理后 CmDREBa-2 的表達情況 * 表示不同激素處理在同一時間點與對照表達差異顯著（ Tukeys test， P < 0.05） Fig. 7 Expression levels of CmDREBa-2 gene under MeJA， SA and ETH treatments in C029 chrysanthemum * means significant difference in the same time between hormone and water treatments（ Tukeys test， P < 0.05） . 3 討論 DREB 轉(zhuǎn)錄因子屬于 AP2/EREBP 家族，該家族轉(zhuǎn)錄因子在植物體內(nèi)的分布十分廣泛，是調(diào)控植物發(fā)育和脅迫耐性的重要因子， 根據(jù)基因序列的相似性和 AP2 結(jié)構(gòu)域的個數(shù)以及結(jié)構(gòu)特點可以分為 5 個亞族 AP2、 DREB、 ERF、 RAV 和單獨成員 Soloist（ Sakuma et al.， 2002； Feng et al.， 2005） 。其中 DREB 亞族和 ERF 亞族都均只含有一個 AP2 結(jié)構(gòu)域（ Sakuma et al.， 2002） ，兩個亞族之間的關(guān)系很近，有些學(xué)者將兩者歸為一起，并且將它們分為 12 個亞組（ Licausi et al.， 2013） ，這說明這兩個亞族的基因存在功能相似的可能性。目前對于 DREB 轉(zhuǎn)錄因子的研究主要集中在其對干旱（ Dubouzet at al.， 2003； Chen at al.， 2016） ，低溫（ Chen at al.， 2003， 2016） ，高鹽（ Herath， 2016）等非生物脅迫的響應(yīng)， 其他 4 個亞族基因的功能則集中在調(diào)控植物發(fā)育 （ AP2、 RAV） 、 脅迫響應(yīng) （ ERF、RAV）和生物脅迫響應(yīng)（ Soloist）方面（季愛加 等， 2015） 。 Lai 等（ 2013）從白菜中分離得到一個ERF 亞家族轉(zhuǎn)錄因子基因 BrERF11，研究發(fā)現(xiàn) BrERF11 受外源水楊酸、茉莉酸甲酯、乙烯和過氧化氫的誘導(dǎo)，轉(zhuǎn)化煙草后發(fā)現(xiàn)植株對青枯雷爾氏菌的抗病性增強。 Chini 等（ 2004）在非依賴型 ABA熊超明，趙興華，賈紅梅，延 昕，毛洪玉 . 菊花抗白色銹病相關(guān)基因 CmDREBa-2 的克隆及表達分析 . 園藝學(xué)報， 2018， 45 (5)： 977 987. 985 脫水反應(yīng)通路中發(fā)現(xiàn) DREB2A 與抗病激活信號通路相聯(lián)系， 這些都說明 DREB 轉(zhuǎn)錄因子有很大的可能參與植物對生物脅迫的抵御反應(yīng)。菊花白色銹病是菊花生產(chǎn)中的嚴重病害，一旦發(fā)病有可能對當(dāng)?shù)氐木栈óa(chǎn)業(yè)造成毀滅性的打擊。本研究中選取菊花免疫白色銹病品種 C029為試材，對 DREB轉(zhuǎn)錄因子在菊花抵御白色銹病中的作用進行了研究。 本研究在前期研究的基礎(chǔ)上通過 RACE 技術(shù)得到一個新的 DREB 基因并命名為 CmDREBa-2，序列分析表明該基因具有典型 DREB 基因的的 AP2 結(jié)構(gòu)域，是植物 DREB 家族的一員。系統(tǒng)進化樹分析表明 CmDREBa-2 轉(zhuǎn)錄因子屬于 DREB 轉(zhuǎn)錄因子的 A-1 組與菊花 DREBa 和 DREBb 具有極高的相似性，尤其與 CmDREBa 在 AP2 結(jié)構(gòu)域的第 19 位均為組氨酸，這與菊花其他 DREB 的谷氨酸不同（ Sakuma et al.， 2002） ，這些都表明該蛋白是菊花體內(nèi)的 DREB 轉(zhuǎn)錄因子。 利用實時熒光定量 RT-PCR，對 CmDREBa-2 在菊花 C029葉片受白色銹病脅迫誘導(dǎo)下的表達情況進行了分析，結(jié)果表明該基因受白色銹病的誘導(dǎo)，表達趨勢呈現(xiàn)先急劇升高，后下降再升高最終趨于平穩(wěn)， 分別在接菌處理后的 6、 10、 18、 24 和 72 h 表達量顯著高于未接菌的對照 （ P < 0.05） 。這說明 CmDREBa-2 參與了 C029對白色銹病抵御反應(yīng)，這也說明 DREB 類轉(zhuǎn)錄因子有參與植物抵御生物脅迫反應(yīng)的功能。這與 PA2/EREBP 家族中的獨立成員和 ERF 亞族的功能相吻合。 SA、 JA 和乙烯是植物體內(nèi)重要的抗病信號分子，它們在抵御生物類脅迫中具有重要作用（ Lu et al.， 2015） 。 Nakano 等（ 2006）的研究表明 DEAR1 基因被 JA 和乙烯聯(lián)合調(diào)控。 Chini 等（ 2004）研究發(fā)現(xiàn) DREB2A 的表達依賴水楊酸。這些研究說明一些 DREB 轉(zhuǎn)錄因子基因受 SA、 JA 和 ETH 的誘導(dǎo)。本試驗結(jié)果與之一致。 本試驗雖然證明 CmDREBa-2 參與了菊花 C029對白色銹病抵御反應(yīng)，并且受 SA、 MeJA 和ETH 誘導(dǎo)，但是該基因是通過何種途徑來實現(xiàn)這種參與生物脅迫的功能，尚不清楚，該基因受白色銹病誘導(dǎo)后激活了下游哪些抗性基因來抵抗白色銹病的也不清楚，這些都是實現(xiàn)菊花抗性育種亟待解決的問題。 References Bonde M R， Murphy C A， Bauchan G R， Luster D G， Palmer C L， Nester S E. 2015. Evidence for systemic infection by Puccinia horiana， causal agent of chrysanthemum white rust， in chrysanthemum. Phytopathology， 105 (1)： 91 98. Bonde M R， Palmer C L， Luster D G， Nester S E， Revell J M， Berger D K. 2014. Viability of Puccinia horiana teliospores under various environmental conditions. Plant Health Progress， 15 (1)： 25 28. Chen J Q， Dong Y， Wang Y J， Liu Q， Zhang J S， Chen S Y. 2003. An AP2/EREBP-type transcription-factor gene from rice is cold-inducible and encodes a nuclear-localized protein. Theoretical and</p>
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