洋蔥光周期途徑轉(zhuǎn)錄因子基因AcCOL7的克隆及功能鑒定.pdf

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洋蔥光周期途徑轉(zhuǎn)錄因子基因AcCOL7的克隆及功能鑒定.pdf

<p>園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (3)： 493 502. Acta Horticulturae Sinica   doi： 10.16420/j.issn.0513-353x.2017-0810； http： /www. ahs. ac. cn                                                  493 收稿日期： 2018 01 11；修回日期： 2018 03 01 基金項(xiàng)目：黑龍江省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（ C2015017）；農(nóng)業(yè)部東北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（ NEU-HC-UADS- 201616）  * 通信作者  Author for correspondence（ E-mail： yongwangneau.edu.cn）  洋蔥光周期途徑轉(zhuǎn)錄因子基因 AcCOL7 的克隆及功能鑒定  盛  潔，楊翠翠，吳小旭，袁巧玲，陳  典，張東源，王  勇*（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，農(nóng)業(yè)部東北地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱  150030）  摘  要：以洋蔥品系 SA2為材料，克隆到 1 個(gè)光周期途徑重要轉(zhuǎn)錄因子 CONSTANS-like 基因，命名為 AcCOL7，其 cDNA 序列全長(zhǎng) 1 101 bp，編碼 366 個(gè)氨基酸。多序列比對(duì)和結(jié)構(gòu)域分析表明， AcCOL7蛋白包含 1 個(gè) B-box 型鋅指結(jié)構(gòu)和 1 個(gè) CCT 結(jié)構(gòu)域；系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示它與水稻 OsCOL13 親緣關(guān)系較近；實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 分析顯示， AcCOL7 的表達(dá)量在抽薹前幼葉中最高，幼嫩花莖次之。為了解AcCOL7 的功能，構(gòu)建了其過(guò)表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化擬南芥 co 突變體。與突變體植株相比，轉(zhuǎn)化株表現(xiàn)為早花，且突變體的其他變異性狀也得到了一定程度的恢復(fù)，表明 AcCOL7 與擬南芥的 AtCOL5 具有相似的功能，即在光周期誘導(dǎo)開(kāi)花途徑中具有顯著的促進(jìn)開(kāi)花作用。  關(guān)鍵詞：洋蔥； AcCOL7；基因表達(dá)模式；擬南芥 co 突變體；過(guò)表達(dá)載體；抽薹開(kāi)花  中圖分類(lèi)號(hào)： S 633.2       文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A        文章編號(hào)： 0513-353X（ 2018） 03-0493-10 Molecular Cloning and Functional Identification of Photoperiod Pathway Transcription Factor Gene AcCOL7 in Allium cepa SHENG Jie， YANG Cuicui， WU Xiaoxu， YUAN Qiaoling， CHEN Dian， ZHANG Dongyuan， and WANG Yong*（ College of Horticulture and Landscape Architecture， Northeast Agricultural University； Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops（ Northeast Region）， Ministry of Agriculture， Harbin 150030， China）  Abstract： In this study， we cloned a CONSTANS-like transcription factor gene that is involved in the photoperiod pathway from the Allium cepa L. SA2 . The full-length cDNA of the gene， designated as AcCOL7， is 1 101 bp long and encodes 366 amino acids. Sequence alignment and motif analysis show that AcCOL7 contains a B-box zinc finger motif near the amino terminus and a conserved CCT domain near the carboxy terminus. Phylogenetic analysis shows that it has close relationship with OsCOL13. Real-time quantitative PCR reveals that AcCOL7 is expressed in different tissues， with higher expression level found in tender leaf and stem before bolting. To investigate the function of AcCOL7， we constructed an AcCOL7 over-expression vector and transformed it into an Arabidopsis co mutant. We found that the transgenic plants exhibited earlier bolting and flowering compared with the mutant plants， and that other characters of the mutant plants were also recovered to some degree. These observations suggest that AcCOL7 has similar Sheng Jie， Yang Cuicui， Wu Xiaoxu， Yuan Qiaoling， Chen Dian， Zhang Dongyuan， Wang Yong. Molecular cloning and functional identification of photoperiod pathway transcription factor gene AcCOL7 in Allium cepa. 494                                                                        Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (3)： 493 502. functions with the Arabidopsis AtCOL5， and that AcCOL7 likely plays a significant role in promoting flowering.  Keywords： Allium cepa； AcCOL7； gene expression pattern； Arabidopsis co mutant；  over-expression vector； bolting 洋蔥（ Allium cepa L.）是典型的 2 年生植物，其形態(tài)建成受光周期的嚴(yán)格調(diào)控。植物光周期調(diào)控涉及到諸多元素，如光敏色素（ PHY A， PHY B）和隱花色素（ Cry C），時(shí)鐘節(jié)律元件（ CDF）及信號(hào)輸出元件 CO 等（ Seaton et al.， 2015）。其中 CONSTANS（ CO）基因是開(kāi)花途徑的重要模式元件，其表達(dá)變化在光周期誘導(dǎo)途徑中發(fā)揮最核心的功能（付建新  等， 2010）。  在擬南芥的光周期開(kāi)花途徑中， GI-CO-FT 是主要的信號(hào)通道。首先， GI 整合外部環(huán)境信號(hào)與自身內(nèi)部信號(hào)并輸出到下游的開(kāi)花整合基因 CO，該基因最終促進(jìn)開(kāi)花素基因 FT的表達(dá)來(lái)起始開(kāi)花。CO 在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中分化出了適應(yīng)不同光周期的家族成員：擬南芥 AtCOL3（ CO 同源基因）、AtBBX32（ CO 同源基因）、 AtCOL13（ CO 同源基因）均在開(kāi)花途徑中擔(dān)任活化子的作用，促進(jìn) FT表達(dá)并使擬南芥提前開(kāi)花（ Tripathi et al.， 2016）；較為特殊的是 AtCOL9 及 AtCOL10，它們?cè)跀M南芥的開(kāi)花時(shí)間調(diào)控上扮演一個(gè)抑制因子的角色( Cheng & Wang et al.， 2005)，且與所對(duì)應(yīng)到的同源基因阿拉伯芥 OnCOL9/10 的功能呈現(xiàn)相反情況（陳俊忠， 2012)。 AtBBX19（ CO 同源基因）也是一個(gè)開(kāi)花抑制子，它可以和 CO 相互作用，且在不影響 CO 表達(dá)豐度的情況下通過(guò)抑制 FT 轉(zhuǎn)錄水平來(lái)抑制開(kāi)花（ Wang et al.， 2014）。此外， AtBBX19 在擬南芥晚花突變體 upf1-5 和 upf3-1 中表達(dá)量升高，也表明其作為抑制信號(hào)的作用（ Nasim et al.， 2017）。  對(duì)于光周期誘導(dǎo)途徑的研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)植物的光周期調(diào)控比雙子葉擬南芥更為復(fù)雜，一些物種中的 CO-FT 模型在非誘導(dǎo)環(huán)境下可能作為抑制信號(hào)。在短日植物水稻中， OsCOL4 和 OsCOL9 通過(guò)阻遏 Ehd1（ CO 同源基因，促進(jìn)開(kāi)花）的表達(dá)來(lái)抑制開(kāi)花（ Lee et al.， 2010； Liu et al.， 2016）； OsCOL16通過(guò)上調(diào)開(kāi)花阻礙基因 Ghd7 來(lái)抑制開(kāi)花（ Wu et al.， 2017）。  洋蔥當(dāng)年形成鱗莖，經(jīng)冬貯春化后，第 2 年再經(jīng)適合光周期成花結(jié)實(shí)，從而完成生命周期。已有的研究表明，洋蔥中 GI 與 FKF1 基因相對(duì)保守，在晝夜表達(dá)模式上與擬南芥相似，是控制光周期開(kāi)花的關(guān)鍵基因（ Taylor et al.， 2010）。此外，開(kāi)花素基因 FT，花序分生組織特異基因 LFY 都決定了洋蔥是否成花（ Lee et al.， 2013； Yang et al.， 2016）。但在洋蔥中， GI 接收的信號(hào)是如何傳遞到FT 的，光信號(hào)的響應(yīng)和傳遞途徑中其他基因的作用如何，目前研究得較少。本研究中利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，克隆洋蔥的 CO 同源基因 COL7 全長(zhǎng)序列；構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化擬南芥 co 突變體，觀察基因?qū)﹂_(kāi)花時(shí)間的作用，推測(cè)基因的功能。以便了解洋蔥 COL 基因?qū)Τ苫ǖ挠绊?，進(jìn)而豐富洋蔥成花機(jī)理，為人工調(diào)控洋蔥開(kāi)花奠定基礎(chǔ)。  1  材料與方法  1.1  材料  洋蔥 SA2為高世代長(zhǎng)日型黃皮洋蔥品系，由本課題培育。 2016 年下旬播種， 4 月 25 日定植，8 月 15 日采收，在此營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期于葉片 7 葉時(shí)取假莖和鱗莖凍存，用于后續(xù)試驗(yàn)。 2017 年 4 月15 日將采收的種球定植于露地， 5 月中旬開(kāi)花，開(kāi)花前后取樣。擬南芥，包括哥倫比亞生態(tài)型野生擬南芥（由本課題組提供）和 co 突變體擬南芥 SALK-096361C（購(gòu)自于 TAIR 公司，遺傳背景為哥盛   潔，楊翠翠，吳小旭，袁巧玲，陳   典，張東源，王   勇 . 洋蔥光周期途徑轉(zhuǎn)錄因子基因 AcCOL7 的克隆及功能鑒定 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (3)： 493 502.                                                                                       495 倫比亞野生型），突變基因?yàn)?COL5，突變方式為 T-DNA 插入，表現(xiàn)為晚花表型。  TA 克隆載體 1250-3301， LBA4404 農(nóng)桿菌菌株和 DH5 大腸桿菌菌株，皆由本課題組提供。  引物（表 1）：均由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。  表 1  試驗(yàn)所用引物序列 Table 1  Primer sequences for cloning and qRT-PCR 用途  Use 名稱(chēng)  Name 序列  Sequence（ 5 3）  全長(zhǎng)序列擴(kuò)增，轉(zhuǎn)化株檢測(cè)    Full length amplification and identify of transformed plants AcCOL7-1250-S AcCOL7-1250-A ATGAAAGAAGAGGAGCAGTT GGTTTGAGACAGTAAAAAGTCA AcCOL7 qRT-PCR AcCOL7-F AcCOL7-R ACAAAGCAAACACGGTCTCC ACGCTAACGTGAGCCTCATA 擴(kuò)增內(nèi)參基因 For reference gene amplification AcActin-F AcActin-R ACACGGCCTGGATAGCAACAT AGAGCAGTATTCCCAAGCATT 1.2  試驗(yàn)方法  1.2.1  洋蔥總 RNA 的提取和 cDNA 第一鏈的合成采用 Trizol 法（上海聯(lián)碩 Invitrogen TRIZOL15596026）提取洋蔥 RNA。 cDNA 第一鏈合成按照TOYOBO 公司的 ReverTra Ace qPCR RT Kit（ Code No.FSQ-101）反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。  1.2.2  AcCOL7 的克隆及生物信息學(xué)分析  以營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期的葉片總 RNA 反轉(zhuǎn)錄所得的 cDNA 為模板，以 AcCOL7-1250-S 和 AcCOL7- 1250-A 為引物克隆 AcCOL7（ 1 101 bp）基因的全長(zhǎng)。反應(yīng)體系包括 10× Taq 緩沖液 2 L， dNTP（ 2.5 mmol · L-1） 2 L，引物（ 10 mol · L-1）各 0.5 L， Taq DNA 聚合酶（ 5 U · L-1） 0.2 L，模板 cDNA 1 g，水補(bǔ)足至 20 L，反應(yīng)條件為 94  5 min； 94  30 s， 52  30 s， 72  1 min， 30 個(gè)循環(huán)；72  10 min。  利用 DNAMAN 6.0.3 對(duì) AcCOL7 進(jìn)行同源序列比對(duì)，利用 MEGA5.2.2 軟件構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)分析。  1.2.3  AcCOL7 表達(dá)模式分析  為探討 AcCOL7 在洋蔥營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)階段各器官的表達(dá)特性，選取洋蔥的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng) 7 葉期假莖、7 葉期鱗莖，抽薹前幼葉、幼嫩花莖、花序，盛花期花莖、假莖、鱗莖、葉片、花苞，計(jì)10 個(gè)不同生長(zhǎng)部位或器官材料，提取 RNA，均衡濃度后反轉(zhuǎn)錄，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)。反應(yīng)體系同上。反應(yīng)條件為 95 預(yù)變性 3 min； 95 變性 10 s， 56 退火 20 s， 72 延伸 20 s， 30 個(gè)循環(huán)； 72 延伸 10 min。 3 次重復(fù)，表達(dá)量計(jì)算方法為 2-Ct。  1.2.4  載體構(gòu)建   利用 1250-3301 載體上的 XcmI 酶切位點(diǎn)，經(jīng) TA 克隆方式構(gòu)建 AcCOL7 的過(guò)表達(dá)載體pAcCOL7-1250，載體結(jié)構(gòu)見(jiàn)結(jié)果與分析部分，載體構(gòu)建成功后經(jīng)凍融法（ Wang et al.， 2011），將其導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株 LBA4404 中。  1.2.5  擬南芥轉(zhuǎn)化及表型分析  將突變體植株培養(yǎng)至開(kāi)花，利用花序侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥（ Yang et al.， 2016），經(jīng)除草劑篩選（ 50 mg · mL-1）和 PCR 擴(kuò)增獲得轉(zhuǎn)化陽(yáng)性株，調(diào)查轉(zhuǎn)基因擬南芥與突變體的性狀差異，測(cè)量株高和葉片數(shù)量，并調(diào)查花期。以上擬南芥培養(yǎng)的光周期皆為 16 h /8 h，培養(yǎng)溫度 25 。 Sheng Jie， Yang Cuicui， Wu Xiaoxu， Yuan Qiaoling， Chen Dian， Zhang Dongyuan， Wang Yong. Molecular cloning and functional identification of photoperiod pathway transcription factor gene AcCOL7 in Allium cepa. 496                                                                        Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (3)： 493 502. 2  結(jié)果與分析  2.1  AcCOL7 的克隆  以 AcCOL7-1250-S， AcCOL7-1250-A（表 1）為引物，以洋蔥營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期葉片 cDNA 為模板，擴(kuò)增得到 AcCOL7（ KX553871） ?；虻?CDS 區(qū)為 1 101 bp，編碼 366 個(gè)氨基酸，正電荷氨基酸殘基（ Arg + Lys）數(shù)為 42，負(fù)電荷氨基酸殘基數(shù) （ Asp + Glu）數(shù)為 57。蛋白分子式為 C1804H2811N515O585S18，相對(duì)分子質(zhì)量為 41 651.34，等電點(diǎn)為 5.15。  2.2  AcCOL7 的生物信息學(xué)分析  為確定洋蔥 AcCOL7 與其他作物中 COL 的相似性，選取擬南芥 AtCO，油菜 BnCOL13，亞洲棉 GaCOL13，煙草 NtCOL13，與 AcCOL7 進(jìn)行同源性比對(duì)和功能域分析。比對(duì)結(jié)果顯示它們具有COL 典型的功能域，即 B-box 和 CCT 結(jié)構(gòu)域（圖 1）。洋蔥 AcCOL7 中 B-box 鋅指結(jié)構(gòu)為 C-X2-C-X8- C-R-X-D-X4-C-X2-C-X4-H，與擬南芥 CO 蛋白構(gòu)型類(lèi)似。 AcCOL7 在 B-box 鋅指結(jié)構(gòu)和 CCT 結(jié)構(gòu)域處高度保守，雖中部區(qū)域保守性很低，但仍有少數(shù)氨基酸序列表現(xiàn)為高度保守。說(shuō)明 AcCOL7 是具有生物功能的 CO 類(lèi)似基因。  圖 1  AcCOL7 同源性分析  AtCO：擬南芥（ NP182310）； BnCOL13：油菜（ XP013690401）； GaCOL13：  亞洲棉（ XP017634815）； NtCOL13：煙草（ XP016495983）。  Fig. 1  AcCOL7 sequence homology analysis AtCO： Arabidopsis thaliana（ NP182310）； BnCOL13： Brassica napus（ XP013690401）； GaCOL13： Gossypium arboretum （ XP017634815）； NtCOL13： Nicotiana tabacum（ XP016495983） . 為了探討 COL 在進(jìn)化過(guò)程中的特點(diǎn)，利用 MEGA5.2.2 軟件對(duì)來(lái)自于洋蔥、擬南芥和水稻的 17個(gè)不同的 COL 編碼的氨基酸序列做了進(jìn)化樹(shù)分析。從結(jié)果（圖 2）上看， COL 可聚類(lèi)為 2 大類(lèi)，洋盛   潔，楊翠翠，吳小旭，袁巧玲，陳   典，張東源，王   勇 . 洋蔥光周期途徑轉(zhuǎn)錄因子基因 AcCOL7 的克隆及功能鑒定 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (3)： 493 502.                                                                                       497 蔥 AcCOL7 與水稻 OsCOL13 聚在一起，說(shuō)明兩者的親緣關(guān)系較近。系統(tǒng)分析結(jié)果顯示，在一個(gè)進(jìn)化分支內(nèi)存在單子葉雙子葉共存的現(xiàn)象，說(shuō)明 CO 是古老的光周期基因在系統(tǒng)發(fā)生上，出現(xiàn)于單雙子葉植物的歧化之前。  圖 2  基于 COL 的系統(tǒng)發(fā)育分析  Fig. 2  Phylogenetic analysis of COL 2.3  AcCOL7 的表達(dá)模式分析    圖 3 顯示， AcCOL7 雖然在整個(gè)生長(zhǎng)周期中均有表達(dá)，但明顯在抽薹開(kāi)花后的花序等器官的表達(dá)量更低，此外營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段中假莖和鱗莖中的表達(dá)量也都較低，而當(dāng)洋蔥的發(fā)育狀態(tài)由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變時(shí)， AcCOL7 高表達(dá)于抽薹前葉片和抽薹伊始出現(xiàn)的細(xì)嫩花莖中。這個(gè)結(jié)果也說(shuō)明了該基因是光周期途徑中接收光信號(hào)傳導(dǎo)的重要基因，對(duì)植株的發(fā)育轉(zhuǎn)換具有重要作用。  圖 3  洋蔥 AcCOL7 基因的時(shí)空表達(dá)特性  Fig. 3  Spatial and temporal expression of AcCOL7 gene Sheng Jie， Yang Cuicui， Wu Xiaoxu， Yuan Qiaoling， Chen Dian， Zhang Dongyuan， Wang Yong. Molecular cloning and functional identification of photoperiod pathway transcription factor gene AcCOL7 in Allium cepa. 498                                                                        Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (3)： 493 502. 2.4  AcCOL7 對(duì)擬南芥 co 突變體的功能補(bǔ)償分析   構(gòu)建了 AcCOL7 的過(guò)表達(dá)載體 pAcCOL7-1250（圖 4），轉(zhuǎn)化擬南芥 co 突變體，通過(guò)轉(zhuǎn)化株的表型變化鑒定基因的功能。  經(jīng)除草劑篩選和 PCR 檢測(cè)后（圖 5）獲得轉(zhuǎn)化株 48 株。去除最早抽薹和最晚抽薹的極端株，在生長(zhǎng)狀態(tài)較為一致的群體里隨機(jī)選取 15 株，均分為 5 組，調(diào)查抽薹期及其他植物學(xué)性狀。  圖 4  過(guò)表達(dá)載體 AcCOL7-1250 結(jié)構(gòu)圖  Fig. 4  Structure block of overexpression vector AcCOL7-1250 圖 5  部分陽(yáng)性植株的 AcCOL7 擴(kuò)增鑒定  M： DL2000 marker； 1 6：部分轉(zhuǎn)基因植株 PCR 鑒定。  Fig. 5  Amplification and identification of AcCOL7 positive plants M： DL2000； 1 6： PCR amplification of the transgenic plants. 轉(zhuǎn)入過(guò)表達(dá)載體的 co 突變體陽(yáng)性植株突變性狀，即晚花表型得到了一定程度的恢復(fù)，具體表現(xiàn)為： co 突變體（ co-mutant）在 34 37 d 開(kāi)始抽薹，蓮座葉數(shù)（圖 6）平均為 11.8 片；轉(zhuǎn) AcCOL7的 co 突變體植株在 30 32 d 開(kāi)始抽薹，蓮座葉數(shù)為 8 11 片；但作為對(duì)照的同一培養(yǎng)條件下的野生型（ WT）植株在 28 30 d 開(kāi)始抽薹，蓮座葉數(shù)平均為 7.8 片，說(shuō)明 AcCOL7 在長(zhǎng)日照條件下可使擬南芥 co 突變體提早抽薹，但并不能恢復(fù)到野生狀態(tài)。  圖 6  抽薹時(shí)野生型（ WT）、轉(zhuǎn) AcCOL7 的 co 突變體（ 1 5）與 co 突變體（ co-mutant）植株蓮座葉數(shù)及其葉面積比較  Fig. 6  Comparison of rosette number of leaf and leaf area of wild type， transgenic  AcCOL7 co-mutant（ 1 5） and co-mutant plants  盛   潔，楊翠翠，吳小旭，袁巧玲，陳   典，張東源，王   勇 . 洋蔥光周期途徑轉(zhuǎn)錄因子基因 AcCOL7 的克隆及功能鑒定 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (3)： 493 502.                                                                                       499 此外， co 突變體的其他植物學(xué)性狀的改變也被過(guò)表達(dá)載體部分逆轉(zhuǎn)。 co 突變體（ co-mutant）植株蓮座葉葉面積（圖 6）平均為 2.01 cm2，株高（圖 7）平均為 16.23 cm，轉(zhuǎn)基因 co 突變體（ AcCOL7 co-mutant）植株蓮座葉葉面積為 2.03 2.15 cm2，株高平均為 23.2 cm，野生型植株蓮座葉葉面積平均為 3.17 cm2，株高平均為 22.33 cm。  co 突變體植株葉片邊緣有少許缺刻，花莢較為粗壯短小且發(fā)芽率較低；轉(zhuǎn)基因的 co 突變體葉片邊緣沒(méi)有缺刻或者缺刻很少，其花莢較為細(xì)長(zhǎng)窄?。▓D 7），但種子收取后發(fā)芽率仍較低，發(fā)芽率為 40%左右。  圖 7  擬南芥野生型（ WT）、 co 突變體（ co-mutant）與轉(zhuǎn) AcCOL7 的 co 突變體（ AcCOL7 co-mutant）植株表型比較  a：蓮座葉片； b：花莢； c、 d：抽薹情況。  Fig. 7  Phenotypic analysis of WT， co-mutants and transgenic AcCOL7 co-mutants a： Leaf； b： Pod； c and d： Bolting. 3  討論  CONSTANS-like 是植物光周期開(kāi)花途徑中關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子，它們具有特殊的結(jié)構(gòu)特征，在靠近C端含有保守的 CCT結(jié)構(gòu)域，在 N端有類(lèi)鋅指 B-box結(jié)構(gòu)域。核因子 NF-Y可與 CCT結(jié)構(gòu)域的 CCAAT元件相結(jié)合，協(xié)同激活 FT 的表達(dá)（ Swain et al.， 2016）。 B-box 作為晝夜時(shí)鐘輸出的關(guān)鍵，可以精準(zhǔn)的調(diào)控 CO 及 FT 的表達(dá)（ Wang et al.， 2014）。 AtCOL7 具有典型的 B-box 結(jié)構(gòu)域和 CCT 結(jié)構(gòu)域，推測(cè)它對(duì)開(kāi)花的調(diào)控機(jī)理與上述類(lèi)似。  Sheng Jie， Yang Cuicui， Wu Xiaoxu， Yuan Qiaoling， Chen Dian， Zhang Dongyuan， Wang Yong. Molecular cloning and functional identification of photoperiod pathway transcription factor gene AcCOL7 in Allium cepa. 500                                                                        Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (3)： 493 502. 雖然 COL 廣泛地參與對(duì)開(kāi)花時(shí)間的控制，但是在不同物種中對(duì)日長(zhǎng)的響應(yīng)和對(duì)開(kāi)花起促進(jìn)或抑制作用的方面卻發(fā)生了種內(nèi)和種間的分化。以模式植物擬南芥為例，擬南芥 AtCO 在長(zhǎng)日照下促進(jìn) FT 的表達(dá)并誘導(dǎo)開(kāi)花，而過(guò)表達(dá)的 AtCOL5 在短日照情況下也可以誘導(dǎo)擬南芥開(kāi)花（ Hassidim et al.， 2009）。短日照植物水稻 OsCO3 短日條件抑制開(kāi)花（ Kim et al.， 2008）， OsCOL4 和 Osbbx14則不受光周期調(diào)節(jié)，無(wú)論長(zhǎng)日還是短日照條件下均抑制或延遲水稻開(kāi)花（ Lee et al.， 2010； Bo et al.，2016）。在短日植物大豆中 GmCOL5 和 GmCOL8 促進(jìn)開(kāi)花（張清哲等， 2010），而 GmCOL2 對(duì)開(kāi)花時(shí)間無(wú)顯著作用（ Fan et al.， 2014）；過(guò)表達(dá)的國(guó)蘭 CsCOL1 可使煙草提前開(kāi)花（ Yang & Zhu，2015）；紅掌中 AaCOL1 和 AaCOL2 分別受短日照和長(zhǎng)日照調(diào)節(jié)開(kāi)花（?？『? 等， 2014）；牡丹PsCOL4 會(huì)合成較多的  PsCOL4 蛋白，促使下游基因 SOC1 的表達(dá)，最終調(diào)控牡丹開(kāi)花（王順利  等，2014）。洋蔥在栽培過(guò)程中適應(yīng)環(huán)境形成了長(zhǎng)日生態(tài)型、短日生態(tài)型以及中日生態(tài)型的分化，AtCOL7 可促使擬南芥突變體在長(zhǎng)日條件下開(kāi)花，但其在短日生態(tài)型洋蔥上的功能還有待于進(jìn)一步研究。  目前在許多植物中都克隆到 CO 同源基因，其調(diào)控和功能方面的研究思路和結(jié)果將為洋蔥中 CO同源基因的研究提供一定的參考價(jià)值。在水稻中，過(guò)表達(dá) OsCOL10 能延遲抽穗， OsCOL10-RNAi植株與野生型相比在長(zhǎng)短日照下差別不大（ Tan et al.， 2016）。過(guò)表達(dá)的 OsCOL9 無(wú)論在長(zhǎng)、短日照下均抑制 EHD1、 Hd3a 和 RFT1 的表達(dá)從而延遲水稻開(kāi)花，且除了 EHD1 通路外， OsCOL9 獨(dú)立運(yùn)作于其他開(kāi)花途徑。過(guò)表達(dá)的 OsCOL16 抑制抽薹開(kāi)花，且上調(diào)開(kāi)花阻礙物 Ghd7 的表達(dá)，導(dǎo)致 EHD1，Hd3a 和 RFT1 的表達(dá)下調(diào)（ Wu et al.， 2017）。過(guò)表達(dá)的 OsCOL13，無(wú)論長(zhǎng)、短日照均負(fù)向調(diào)節(jié)水稻開(kāi)花，并下調(diào) OsphyB，上調(diào) EHD1 的表達(dá)（ Sheng et al.， 2016），這也說(shuō)明 COL 在開(kāi)花調(diào)控方向上的多樣性。除 AtCOL7，還得到了幾個(gè)洋蔥的 COL 基因，每個(gè)基因的作用特點(diǎn)，它們與上、下游基因間的相互關(guān)系也是下一步研究工作的重點(diǎn)。  對(duì)于現(xiàn)有遺傳轉(zhuǎn)化體系尚未完善的作物來(lái)說(shuō)，利用擬南芥突變體進(jìn)行功能補(bǔ)償試驗(yàn)是研究基因功能的一個(gè)行之有效的方法，如陸地棉 Ghcol1-A 和 Ghcol1-D 可以恢復(fù)晚花表型的擬南芥 co-2 突變體并促進(jìn)開(kāi)花（ Cai et al.， 2017）；黑麥草 LpCO 基因也可以互補(bǔ)擬南芥 co-2 突變體的晚花表型（付建新  等， 2010）。在本試驗(yàn)中， AcCOL7 可一定程度恢復(fù)擬南芥 co 突變體的晚花表型，但仍比野生型擬南芥略晚，這可能是由于參與光周期誘導(dǎo)途徑的多個(gè) COL 基因間存在冗余現(xiàn)象所致。  植物的開(kāi)花是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及到多個(gè)途徑多種因素的整合。目前，模式植物中光周期調(diào)控研究相對(duì)較為清楚，但洋蔥中，光周期因子如何協(xié)同調(diào)控開(kāi)花尚不明確?？寺」庵芷谥衅渌颍芯吭趩我患皡f(xié)同背景下信號(hào)的傳遞關(guān)系，將有助于了解洋蔥的開(kāi)花調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)而為打破不同生態(tài)型洋蔥的地域限制提供可能。  References  Bo Bai， Jie Zhao， Yaping Li， Fang Zhang， Jinjun Zhou， Fan Chen， Xianzhi Xie. 2016. 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