利用黃秋葵轉(zhuǎn)錄組信息挖掘SSR標(biāo)記及用于種質(zhì)分析.pdf

資源ID：5168 資源大?。?span id="9kjombs" class="font-tahoma">1.40MB 全文頁(yè)數(shù)：12頁(yè)
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利用黃秋葵轉(zhuǎn)錄組信息挖掘SSR標(biāo)記及用于種質(zhì)分析.pdf

<p>園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (3)： 579 590. Acta Horticulturae Sinica   doi： 10.16420/j.issn.0513-353x.2017-0848； http： /www. ahs. ac. cn                                                  579 收稿日期： 2018 01 19；修回日期： 2018 03 01 基金項(xiàng)目：福建省屬公益類(lèi)科研院所基本科研專(zhuān)項(xiàng)（ 2015R1026-9）；福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（ STIT2017-1-2）；福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 “青年科技英才百人計(jì)劃 “項(xiàng)目（ YC2017-5）；國(guó)家特色蔬菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（ CARS-24-G-07）  * 通信作者  Author for correspondence（ E-mail： zhs0246163.com， fjvrc163.com）  利用黃秋葵轉(zhuǎn)錄組信息挖掘 SSR 標(biāo)記及用于種質(zhì)分析  李永平，劉建汀，陳敏氡，張前榮，朱海生*，溫慶放*（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所 /福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究中心 /福建省蔬菜工程技術(shù)研究中心，福州  350013）  摘  要：通過(guò)對(duì)黃秋葵（ Hibiscus esculentus L.）轉(zhuǎn)錄組信息分析，共獲得 74 600 條 unigene，全部序列有 52 976 011 bp；有 3 191 條 unigene 包含 SSR 的序列，從中鑒定出 3 448 個(gè) SSR 位點(diǎn)，其中有 235 條序列包含 1個(gè)以上 SSR，復(fù)合 SSR有 123個(gè)。優(yōu)勢(shì)重復(fù)基序?yàn)槿塑账岷投塑账幔?分別占總 SSR的 60.79%和 21.43%。二核苷酸重復(fù)基元中以 AG/CT 為優(yōu)勢(shì)重復(fù)基元，占總位點(diǎn)的 11.02%，三核苷酸重復(fù)基元以AGA/TCT 為主，占總位點(diǎn)的 19.61%。利用 Primer 3.0 共設(shè)計(jì)出 8 088 對(duì) SSR 引物。從 87 對(duì)有效擴(kuò)增引物中隨機(jī)選擇 60 對(duì)用于 32 份黃秋葵種質(zhì)的多態(tài)性驗(yàn)證分析，其中 36 對(duì)（占 60%）引物表現(xiàn)穩(wěn)定可重復(fù)的多態(tài)性。利用 UPGMA 作圖，將 32 份供試材料分為 2 類(lèi)。利用黃秋葵轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行 SSR 標(biāo)記開(kāi)發(fā)，能獲得較高頻率的 SSR 位點(diǎn)，且類(lèi)型豐富，為其遺傳多樣性分析和遺傳圖譜構(gòu)建提供更豐富可靠的標(biāo)記選擇。  關(guān)鍵詞：黃秋葵；轉(zhuǎn)錄組； SSR；多態(tài)性  中圖分類(lèi)號(hào)： S 649       文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A        文章編號(hào)： 0513-353X（ 2018） 03-0579-12 SSR Markers Excavation and Germplasm Analysis Using the Transcriptome Information of Hibiscus esculentus  LI Yongping， LIU Jianting， CHEN Mindong， ZHANG Qianrong， ZHU Haisheng*， and WEN Qingfang*（ Crops Research Institute， Fujian Academy of Agricultural Sciences； Vegetable Research Center， Fujian Academy of Agricultural Sciences； Fujian Engineering Research Center for Vegetables， Fuzhou 350013， China）  Abstract： A total of 74 600 unigenes were obtained by transcriptome sequencing analysis from Hibiscus esculentus. The whole sequence was 52 976 011 bp and a total of 3 448 SSR loci were identified from 3 191 unigenes. 235 sequences contained more than one SSR locus and compound SSR loci sequences were 123. The major types such as trinucleotide and dinucleotide were accounted for 60.79% and 21.43%，respectively. Furthermore， the AG/CT was the predominant dinucleotide repeat type（ 11.02%）， and the AGA/TCT was the predominant trinucleotide repeat type（ 19.61%） . 8 088 pairs of SSR primers were found by Primer 3.0 and 60 pairs of primers were randomly selected from 87 pairs of effective amplification primers for polymorphism analysis of 32 Hibiscus esculentus samples. 36 primers（ 60%） showed stable and Li Yongping， Liu Jianting， Chen Mindong， Zhang Qianrong， Zhu Haisheng， Wen Qingfang. SSR markers excavation and germplasm analysis using the transcriptome information of Hibiscus esculentus. 580                                                                        Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (3)： 579 590. repeatable polymorphism. According to the UPGMA analysis， 32 samples were divided into 2 groups. These results indicated that high frequency and various types of SSR markers could be acquired in Hibiscus esculentus by transcriptome sequencing analysis and abundant SSR markers would provide more reliable markers for genetic diversity analysis and genetic mapping construction in Hibiscus esculentus. Keywords： Hibiscus esculentus； transcriptome； simple sequence repeat； polymorphism 黃秋葵（ Hibiscus esculentus L.）原產(chǎn)于非洲東北部，現(xiàn)世界各地均有栽培，以熱帶及亞熱帶地區(qū)種植最為普遍，中國(guó)主要在臺(tái)灣和福建等地栽培。黃秋葵是極具保健價(jià)值的蔬菜（李建華和陳珊，2004；單承鶯  等， 2012；王維婷  等， 2015），具有很大的發(fā)展?jié)摿Α? 黃秋葵種質(zhì)資源豐富，分布地域廣，栽培品種和變種較多。據(jù)國(guó)際植物遺傳資源委員會(huì) （ IBPGR）報(bào)道，黃秋葵種質(zhì)資源主要集中于印度、科特迪、尼日利亞、美國(guó)等國(guó)家。中國(guó)栽培黃秋葵的歷史悠久，明代的本草綱目中已有述著。 20 世紀(jì) 80 年代，中國(guó)積極引進(jìn)優(yōu)良品種，目前中國(guó)熱帶作物研究院收集保存黃秋葵種質(zhì)資源 50 多份（宮慧慧  等， 2013）。關(guān)于黃秋葵遺傳多樣性的研究報(bào)道較少。 Aladele 等（ 2008）利用 RAPD 技術(shù)對(duì)來(lái)自于亞洲及西非的 93 份黃秋葵資源進(jìn)行聚類(lèi)分析，Gulsen 等（ 2007）利用 SRAP 技術(shù)對(duì)來(lái)自于土耳其不同黃秋葵資源進(jìn)行鑒定，張緒元等（ 2009）和Yuan 等（ 2014）分別利用 ISSR 分子標(biāo)記對(duì)黃秋葵資源進(jìn)行評(píng)價(jià)。目前尚未見(jiàn) SSR 標(biāo)記運(yùn)用于黃秋葵資源鑒定、多樣性評(píng)價(jià)等研究的報(bào)道，分子標(biāo)記研究仍很薄弱，有必要在深度和廣度上進(jìn)一步拓展。  微衛(wèi)星序列即簡(jiǎn)單重復(fù)序列（ Simple sequence repeat， SSR）分子標(biāo)記，廣泛存在于真核和原核生物基因組中（ Kalia et al.， 2011），因其位點(diǎn)特異、復(fù)等位、呈共顯性、在基因組序列中分布廣泛等優(yōu)點(diǎn)已經(jīng)成為最為廣泛的分子標(biāo)記之一（ Kumar et al.， 2015），已成功應(yīng)用于遺傳多樣性分析（ Daniela et al.， 2013；趙樹(shù)琪  等， 2016）、品種鑒定（李麗和鄭曉鷹， 2009；石星星  等， 2015）、遺傳圖譜建立（江錫兵  等， 2015；高天翔  等， 2016）等。 EST-SSR 標(biāo)記來(lái)源于 DNA 序列的轉(zhuǎn)錄區(qū)，比基于基因組序列開(kāi)發(fā)的 SSR 標(biāo)記種間通用性更高，也更經(jīng)濟(jì)方便。 EST-SSR 標(biāo)記在一些主要蔬菜作物中都有一定的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用，如番茄（韓明利  等， 2011）、黃瓜（胡建斌和李建吾， 2008）、油菜（李小白  等， 2007）、大白菜（忻雅  等， 2006）、甘藍(lán)（陳琛  等， 2010）、蘿卜（崔娜  等， 2012）和辣椒（ Toru et al.， 2013）等。本研究中應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行 SSR 標(biāo)記搜索，分析其分布及組成特征，并進(jìn)行可用性評(píng)價(jià)，以期為黃秋葵的種質(zhì)資源多樣性分析、品種鑒定、核心種質(zhì)建立和分子標(biāo)記輔助育種奠定基礎(chǔ)。  1  材料與方法  1.1  轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來(lái)源  從福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所黃秋葵種質(zhì)資源庫(kù)中選取綠色黃秋葵資源（全株及嫩果均為綠色，果實(shí)六棱至八棱，以六棱為主）， 2017 年 4 月中旬播種， 5 月上旬定植于福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜中心基地， 6 月 5 日采花后 6 d 的嫩果，液氮速凍， 80 保存?zhèn)溆谩y(cè)序時(shí)每個(gè)單株構(gòu)建 1 個(gè)文庫(kù)，委托廣州基迪奧生物科技有限公司采用 Illumina HiSeqTM2500 PE125 系統(tǒng)進(jìn)行 RNA-Seq 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（無(wú)參），采用 Trinity 進(jìn)行序列組裝，經(jīng)過(guò)濾（去除含 adaptor、 N 的比例大于 10%、質(zhì)量值 Q20 的堿基數(shù)占整個(gè) read 的 40%以上的 reads）獲得 3.87 G 的有效數(shù)據(jù)。  李永平，劉建汀，陳敏氡，張前榮，朱海生，溫慶放 . 利用黃秋葵轉(zhuǎn)錄組信息挖掘 SSR 標(biāo)記及用于種質(zhì)分析 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (3)： 579 590.                                                                                      581 1.2  材料及其 DNA 提取  用于 SSR 引物篩選和可用性評(píng)價(jià)的材料為本人收集于亞蔬世界蔬菜中心、中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院、福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜中心資源庫(kù)的 32 份種質(zhì)資源（表 1）。基因組 DNA 提取采用 CTAB 法進(jìn)行。  表 1  黃秋葵 SSR 多態(tài)性分析材料 Table1  List of tested Hibiscus esculentus L. materials for SSR polymorphism analysis   來(lái)源  Source 編號(hào)  Code 原產(chǎn)國(guó)  Country of origin 果實(shí)性狀特征  Fruit characters  亞蔬世界蔬菜中心  World Vegetable Center Ys01 馬來(lái)西亞  Malaysia 六棱形，綠色  Six ribbed， green Ys04 馬來(lái)西亞  Malaysia 六棱形，綠白色  Six ribbed， green white s06 坦桑尼亞  Tanzania 六棱形，淺綠色  Six ribbed， pale green s07 菲律賓  Philippines 六棱形，淺綠色  Six ribbed， pale green Ys08 馬拉維  Malawi 六棱形，綠色  Six ribbed， green s10 印度  India 八棱形，綠色  Eight ribbed， green s11 印度  India 六棱形，淺綠色  Six ribbed， pale green Ys15 美國(guó)  America 五棱形，淺綠色  Star-shaped， pale green s18 中國(guó)臺(tái)灣  Taiwan， China 六棱形，綠白色  Six ribbed， green white s19 中國(guó)臺(tái)灣  Taiwan， China 五棱形，綠色  Star-shaped， green Ys21 贊比亞  Zambia 五棱形，淺綠色  Star-shaped， pale green s28 越南  Viet Nam 六棱形，綠白色  Six ribbed， green white s29 越南  Viet Nam 六棱形，綠白色  Six ribbed， green white Ys31 蘇里南  Surinam 五棱形，綠色  Star-shaped， green s33 蘇里南  Surinam 五棱形，淺綠色  Star-shaped， Pale green s34 柬埔寨  Cambodia 五棱形，綠色  Star-shaped， green  Ys35 澳大利亞  Australia 八棱形，淺綠  Eight ribbed， pale green s37 美國(guó)  America 五棱形，淺綠色  Star-shaped， pale green s40 孟加拉  Bangladesh 五棱形，綠色  Star-shaped， green Ys43 南斯拉夫  Yugoslavia 六棱形，紅色  Six ribbed， red s46 孟加拉  Bangladesh 圓，淺綠色  Round， pale green s50 柬埔寨  Cambodia 五棱形，淺綠  Star-shaped， pale green Ys51 菲律賓  Philippines 圓，淺綠色  Round， pale green s53 坦桑尼亞  Tanzania 五棱形，綠色  Star-shaped， green s55 土耳其  Turkey 五棱形，綠色  Star-shaped， green Ys56 土耳其  Turkey 六棱形，綠色  Six ribbed， green 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 Chinese Academy of  Tropical Agricultural Sciences Hk12 中國(guó)  China 六棱形，深紅色  Six ribbed， dark red Hk13 中國(guó)  China 五棱形，深紅色  Star-shaped， dark red Hk06 中國(guó)  China 六棱形，深綠色  Six ribbed， dark green k07 中國(guó)  China 六棱形，綠色  Six ribbed， green 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜中心 Vegetable Research Hk03 中國(guó)  China 六棱形，紅色  Six ribbed， red Center of Fujian Academy of Agricultural Sciences Hk08 中國(guó)  China 六到八棱形，綠色  Six to eight ribbed， green 1.3  轉(zhuǎn)錄組 SSR 位點(diǎn)鑒別及 SSR 引物設(shè)計(jì)  使用 MISA 程序（ http： /pgrc.ikp-gatersleben.de/misa）進(jìn)行 SSR 位點(diǎn)搜索，以二、三、四、五、六核苷酸最少重復(fù)次數(shù)分別為 6、 5、 5、 4 和 4 次為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行搜索。用 Primer 3.0 軟件對(duì) SSR 重復(fù)單元前后的序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)及評(píng)價(jià)，每條 SSR 產(chǎn)生 3 條引物。引物序列長(zhǎng)度 18 27 bp， GC 含量40% 60%，退火溫度 57 63 ，上、下游引物的 Tm值相差    2 ，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度 100 280 bp，且無(wú)二級(jí)結(jié)構(gòu)和二聚體。  Li Yongping， Liu Jianting， Chen Mindong， Zhang Qianrong， Zhu Haisheng， Wen Qingfang. SSR markers excavation and germplasm analysis using the transcriptome information of Hibiscus esculentus. 582                                                                        Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (3)： 579 590. 1.4  EST-SSR 引物篩選  PCR 反應(yīng)體系為 20 L，其中 10 mmol · L-1dNTPs 0.4 L， 5 U Taq 酶 0.3 L， 100 ng DNA 1.5 L，10 mol · L-1的上、下游引物各 1 L， 10× Buffer（ Mg2+） 2.5 L，加 ddH2O 補(bǔ)至 20 L。 PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?95 預(yù)變性 5 min；然后進(jìn)行 35 個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括 94 變性 30 s， 56 退火 30 s（退火溫度因不同引物而異）， 72 延伸 1 min；最后 72 延伸 7 min。 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物 6%變性聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè)， 160 V 電壓， 3 h，銀染顯色后觀(guān)察拍照。  1.5  數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)  SSR 發(fā)生頻率為 SSR 的 unigene 數(shù)量與總 unigene 數(shù)量之比， SSR 的出現(xiàn)頻率為 SSR 的個(gè)數(shù)與總 unigene 的數(shù)量比， SSR 平均分布距離為 1 kb 以上的 unigene 的堿基數(shù)與 SSR 數(shù)量之比。采用人工讀帶的方法，將電泳圖上可重復(fù)的清晰條帶記為“ 1”，同一位置無(wú)帶或不易分辨的弱帶記為“ 0” ，建立原始數(shù)據(jù)矩陣。利用軟件 NTsys2.10 按系統(tǒng)聚類(lèi)進(jìn)行聚類(lèi)繪圖。  2  結(jié)果與分析  2.1  轉(zhuǎn)錄組中 SSR 的分布及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)  黃秋葵轉(zhuǎn)錄組經(jīng)組裝后共獲得 74 600 條 unigene（序列總長(zhǎng)約 52 976 011 bp），用 MISA 軟件對(duì) 1 kb 以上的 unigene（ 16 257 條，序列全長(zhǎng)為 26 945 574 bp）進(jìn)行搜索，發(fā)現(xiàn)其中 3 191 條 unigene序列中含有 3 448 個(gè) SSR 位點(diǎn)，其中 235 條 unigene 含有兩個(gè)或兩個(gè)以上的 EST-SSR 位點(diǎn)。 SSR 發(fā)生頻率為 19.63%，出現(xiàn)頻率為 20.59%，平均 7.81 kb 出現(xiàn) 1 個(gè) SSR，其中復(fù)合 SSR 有 123 個(gè)，占3.57%。 SSR 重復(fù)類(lèi)型 5 種均有，即二核苷酸至六核苷酸重復(fù)。其中三核苷酸和二核苷酸重復(fù)出現(xiàn)頻率占優(yōu)勢(shì)，分別占總 SSR 的 60.79%和 21.43%；四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復(fù)類(lèi)型數(shù)量較少，分別占總數(shù)的 8.93%、 3.54%和 5.31%（表 2）。  黃秋葵轉(zhuǎn)錄組 SSR 重復(fù)單元的重復(fù)次數(shù)分布在 4 26 次之間，其中 4 10 次的 SSR 共有 3 358個(gè)，占總數(shù)的 97.39%；其次為 11 26 次的 SSR，共有 90 個(gè)，占總數(shù)的 2.61%。黃秋葵轉(zhuǎn)錄組 SSR的長(zhǎng)度主要集中在 12 256 bp，其中長(zhǎng)度在 12 18 bp 的 SSR 達(dá) 2 504 個(gè)，占總數(shù)的 72.62%，長(zhǎng)度在 18 bp 以上的 SSR 有 944 個(gè)，只占 27.38%。  表 2  黃秋葵 SSR 的類(lèi)型、數(shù)量及分布頻率  Table 2  Type， number and frequency of SSRs in Hibiscus esculentus L. 重復(fù)基序長(zhǎng)度  Repeat motif length 重復(fù)次數(shù)  Repeat number 總計(jì)  比例 /% 4 5 6 7 8 9 10 11 14  15 Total Ratio 二核苷酸  Di 0 0 329 172 89 53 36 44 16 739 21.43 三核苷酸  Tri 0 1 341 472 198 38 11 9 9 18 2 096 60.79 四核苷酸  Tetra 232 56 9 6 2 0 1 1 1 308 8.93 五核苷酸  Penta 87 24 9 1 0 0 1 0 0 122 3.54 六核苷酸  Hexa 145 32 4 0 1 0 0 0 1 183 5.31 總計(jì)  Total 464 1 453 823 377 130 64 47 54 36 3 448  比例 % Ratio 13.46 42.14 23.87 10.93 3.77 1.86 1.36 1.57 1.04  100 2.2  轉(zhuǎn)錄組中 SSR 基序重復(fù)類(lèi)型和頻率特征  黃秋葵轉(zhuǎn)錄組中 3 448 個(gè) SSR 位點(diǎn)共含 181 種重復(fù)基序，二、三、四、五、六核苷酸重復(fù)分別李永平，劉建汀，陳敏氡，張前榮，朱海生，溫慶放 . 利用黃秋葵轉(zhuǎn)錄組信息挖掘 SSR 標(biāo)記及用于種質(zhì)分析 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (3)： 579 590.                                                                                      583 有 4、 10、 25、 43 和 99 種。從分布頻率來(lái)看（表 3），以三核苷酸重復(fù)類(lèi)型 AAG/CTT 出現(xiàn)最多，占總 SSR 的 19.61%，占三核苷酸重復(fù)基序的總數(shù)的 32.25%。其次是二核苷酸重復(fù)類(lèi)型 AG/CT，占總 SSR 的 11.02%，占二核苷酸總數(shù)的 51.42%。四核苷酸、五核苷酸尤其是六核苷酸重復(fù)基序分布較為分散，出現(xiàn)的頻率較低。  表 3  黃秋葵轉(zhuǎn)錄中不同微衛(wèi)星重復(fù)基序（ motif）出現(xiàn)的頻率  Table 3  Occurrence frequency of different microsatellites motifs of Hibiscus esculentus 重復(fù)基序類(lèi)型  Repeat type 重復(fù)基序  Repeat motif 數(shù)量  Number 發(fā)生頻率 /%  Frequency 所占比例 /%  Proportion 二核苷酸  Di AG/CT 380 11.02 51.42 AT/AT 236  6.84 31.93 AC/GT 118 3.42 15.97 CG/CG   5  0.15  0.68 三核苷酸  Tri AAG/CTT 676 19.61 32.25 AGC/CTG 321 9.31 15.31 ATC/ATG 242  7.02 11.55 ACC/GGT 229 6.64 10.93 AGG/CCT 198  5.74  9.45 AAC/GTT 161  4.67  7.68 AAT/ATT  92  2.67  4.39 CCG/CGG  86  2.49  4.10 ACG/CGT  54  1.57  2.58 ACT/AGT  37  1.07  1.77 四核苷酸  Tetra AAAG/CTTT  76  2.20 24.67 AAAT/ATTT  61  1.77 19.81 AAAC/GTTT  40  1.16 12.99 ACAT/ATGT  24  0.70  7.79 其他  Other 107  3.10 34.74 五核苷酸  Penta AAAAG/CTTTT  34  0.99 27.87 AAAAC/GTTTT  10  0.29  8.20 AAAAT/ATTTT   7  0.20  5.74 AAAGG/CCTTT   7  0.20  5.74 其他  Other  64  1.87 52.45 六核苷酸  Hexa AACAGC/CTGTTG AAGAGG/CCTCTT 6 6 0.17 0.17 3.28 3.28 AAAAAG/CTTTTT AAGGAG/CCTTCT ACCAGC/CTGGTG AGATGG/ATCTCC AGGCGG/CCGCCT 5 5 5 5 5 0.15 0.15 0.15 0.15 0.15 2.73 2.73 2.73 2.73 2.73 其他  Other 146  4.23 79.78 2.3  黃秋葵轉(zhuǎn)錄組 SSR 引物設(shè)計(jì)與篩選  利用 Primer3.0 對(duì)含 SSR 位點(diǎn)的 3 191 條 unigene 序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，共設(shè)計(jì)出引物 8 088 對(duì)。隨機(jī)挑選 100 對(duì)不同重復(fù)單元（二、三、四、五、六核苷酸）的引物對(duì)黃秋葵 Hk08 DNA 進(jìn)行SSR-PCR 擴(kuò)增，以驗(yàn)證其有效性。結(jié)果表明 100 對(duì)引物實(shí)現(xiàn)有效擴(kuò)增，有效率為 100%，其中 87 對(duì)（ 87.00%） PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)期大小相符，有 13 對(duì)（ 13%）擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度超過(guò)預(yù)期，分別是引物HeSSR006、 HeSSR008、 HeSSR010、 HeSSR012、 HeSSR015、 HeSSR016、 HeSSR021、 HeSSR024、HeSSR025、 HeSSR026、 HeSSR027、 HeSSR032 和 HeSSR034（圖 1）。  Li Yongping， Liu Jianting， Chen Mindong， Zhang Qianrong， Zhu Haisheng， Wen Qingfang. SSR markers excavation and germplasm analysis using the transcriptome information of Hibiscus esculentus. 584                                                                        Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (3)： 579 590. 圖 1  引物 HeSSR001 HeSSR100 對(duì)黃秋葵 Hk08的擴(kuò)增結(jié)果  Fig. 1  Amplification result of primer HeSSR001 HeSSR100 for Hk08 Hibiscus esculentus M： DNA marker； 1 100： HeSSR001 HeSSR100. 2.4  多態(tài)性分析  從 87 對(duì)有效擴(kuò)增引物中隨機(jī)選取 60 對(duì) EST-SSR 引物對(duì) 32 份黃秋葵種質(zhì)資源進(jìn)行擴(kuò)增及多態(tài)性評(píng)價(jià)（圖 2 為引物 HeSSR020 和 HeSSR033 的擴(kuò)增情況），其中 36 對(duì)引物存在多態(tài)性差異（表 4），占有效擴(kuò)增引物的 60%。每對(duì)引物產(chǎn)生的條帶數(shù)在 2 7 之間，共得到 147 條條帶，其中多態(tài)性片段 102 個(gè)，每對(duì)引物平均產(chǎn)生 2.83 個(gè)多態(tài)性片段。 36 對(duì) EST-SSR 標(biāo)記的 PIC 平均值為 0.73，僅HeSSR011 引物 PIC 值小于 0.5， HeSSR088 的 PIC 值達(dá)到 0.87，表明這些 SSR 標(biāo)記含有高度多態(tài)信息。 36 對(duì)多態(tài)性引物中二核苷酸重復(fù)的 5 對(duì)，三核苷酸重復(fù)的 14 對(duì)，五核苷酸重復(fù)的 6 對(duì)，六核苷酸重復(fù)的 11 對(duì)。  圖 2  引物 HeSSR020（ A）和 HeSSR033（ B）在 32 份黃秋葵種質(zhì)資源（ 1 32）中的多態(tài)性  M： DNA marker；箭頭標(biāo)注部分為差異條帶。  Fig. 2  Polymorphisms showed in 32 Hibiscus esculentus germplasms（ 1 32） by  primer HeSSR020（ A） and HeSSR033（ B）  M： DNA marker； The arrows indicate the different bands. 李永平，劉建汀，陳敏氡，張前榮，朱海生，溫慶放 . 利用黃秋葵轉(zhuǎn)錄組信息挖掘 SSR 標(biāo)記及用于種質(zhì)分析 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (3)： 579 590.                                                                                      585 表 4  黃秋葵 36 對(duì) SSR 引物信息  Table 4  Information of 36 pairs of SSR primers developed from Hibiscus esculentus 引物編號(hào)  Primer No. 引物序列（ 5 3）  Primer sequence SSR 基元  SSR motif 產(chǎn)物長(zhǎng)度 /bp Length of  product 多態(tài)性條帶  數(shù) Number of polymorphic  bands 多態(tài)信息量PIC HeSSR002 CGCTGCTCCAGACATAACAATCTTTCTCTCCGAACCTCCA (ACG)9169 5 0.83 HeSSR003 GGCGATCAAATTAGAAACCAGGTCACGCTGTAGCTCTCGAA (AGC)11122 3 0.75 HeSSR009 GAAGAACAAGGCAAGGCAAGAACATCTCCAAGCTCCCTCA (GAA)10270 3 0.73 HeSSR011 TGCAGGCAAATCAACTGAAGGTTTCCATTCGACTCGGGTA (TA)8206 2 0.47 HeSSR017 ACTGCCACTCAACAGCAATGTGCGACAATATTTCCAGCAG (CAG)8270 4 0.81 HeSSR020 TTCTCACTGCAGCAACAAGGTGCCACTTCTCTGCCTCTTT (AGG)8147 7 0.86 HeSSR023 CAAGGAGACAATGCAGGGTTATTCGATACCCAAAGCTCCC (AAC)8243 3 0.72 HeSSR030 GAGATCAAGAACGTGTGGCAAATCTTCGTTGGTTTCGGTG (AAC)8223 2 0.63 HeSSR033 TAAGAGGCGTGAAAGGAAGCAAGCTCAACCTTTACGGCAA (AT)9163 5 0.76 HeSSR036 GTGGGTTCAAACTTTGGGTGAAGCAGCAAGGTTATTACACTTTACA (AT)12268 3 0.71 HeSSR037 ACGTCATCCTCATTAACGGCTTCCTTTCCGACAATTCGAC   (AG)16210 4 0.68 HeSSR040 CGTTTGAACGCTACCCCATACCCGAAACCACCTAACTCAA (GTT)7280 6 0.82 HeSSR041 GCGAATCTTTTGGTATCGGAATGGATGATTTGGTGGGATG (CTG)7264 2 0.53 HeSSR043 GCTGCAGCTAAAACGCTTCTCGTAGTCCATGAGGGCAAAT (TC)12272 3 0.63 HeSSR046 GAATGGAAGCCAAAGGATCATGGAATGAATTTTATGATGATGG (TTC)7202 3 0.70 HeSSR051 AACTGGACCCGAGTGTTGTCAAGTATGGTGCCCATCATCG (CTG)7183 2 0.62 HeSSR054 TGGCAATGATCCATCTGAAACTTGCCATCGGAATCGTAAT (GAA)7208 3 0.64 HeSSR055 ATTCGATGCTGCTTCTTCGTCTGCGTTGTTTGTTCAGGTG (AGA)7113 3 0.72 HeSSR057 CTTCCGCATCTTCACCAAGTTTTCAACACGTGGATGTCGT (AGA)7210 3 0.59 HeSSR060 GGCAGTGGCTGATTGTTGTACAAAGCAGGACAGGAAAAGC (CTAGC)4227 4 0.77 HeSSR063 CGAGGTAGCCCCATCTATCATTCTTTCCGTCCAACCAATC (ATTGA)4196 6 0.85 HeSSR064 GCAGGAAGCTCTAGGGTCAAGACCCAACCAACTGGAGAAA (AAAAG)4196 5 0.70 HeSSR067 CAAAACAAACAATAAGGAACCCATGGCTTTACCTCAAACCCAG (CAAAA)4134 6 0.81 HeSSR068 TCACTCCTGAATCCTGGTCCGGCTTTGTCCGTGCTTATGT (CTTCCC)4167 4 0.76 HeSSR071 TCGTCCCTTTTAACAATCCGAATTCCCCCTACAATCCCAG (TTCTTG)4212 5 0.75 HeSSR074 TACTAGAGGGCAACGCCACTGGAGGAGGAAGAGGGAAATG (GTGTT)5205 4 0.71 HeSSR075 TATGGGCGAAAAATGACTCCCTTATTTTCATCGCCCCTGA (CTCAT)7177 4 0.73 HeSSR077 TGTCTCCGAGTGTTGTCTGCAACCCTAAACTTGGAGGGGA (CTATAC)4211 5 0.78 HeSSR078 CGTCGTCTTCATTTTCAGCAGATCGGCATCAGATCCACTT (CTTCAG)4182 4 0.69 HeSSR079 CGGCTGACTCATGACCACTATGCTTTCCAAGTGTTCCTCC (AGGAGC)4223 4 0.81 HeSSR081 GCGATTACATCAAAAACCCAGTCATTTCGCAAGGGAATGT (GACTAG)4233 4 0.76 HeSSR082 TTCTCCCCCTCCTCTTCAATTGACTCACTGGCACTTTGCT (TCCATA)4276 5 0.84 HeSSR087 GGACATTTTAATGCCGCTTCATCATGGTGGTGATGGGAGT (TGCTGG)4199 6 0.81 HeSSR088 TCAGGATTTGGGAATGAAGCGGCTCTGAATGTTTTGCCAT (ACATGG)4214 6 0.87 HeSSR094 TGACCTTGCTCGGGTACTTCCTAGGGT</p>

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