園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (4)： 678 690. Acta Horticulturae Sinica 678 doi： 10.16420/j.issn.0513-353x.2017-0769； http： /www. ahs. ac. cn 收稿日期 ： 2018 02 14； 修回日期 ： 2018 04 09 基金項(xiàng)目 ： 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ 31471878） ；浙江省重點(diǎn)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（ 2013TD05） ；浙江省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（ LZ17C150002） * 通信作者 Author for correspondence（ E-mail： gluzju.edu.cn） 番茄生長(zhǎng)素響應(yīng)因子基因 SlARF12 在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中的功能分析 劉松瑜，閆艷秋，馮秋碩，盧 鋼*（浙江大學(xué)蔬菜研究所，杭州 310058） 摘 要： 以番茄 Micro-Tom為材料，研究了生長(zhǎng)素響應(yīng)因子基因 SlARF12 （序列號(hào)： HM565127.1）在果實(shí)發(fā)育過(guò)程的生物學(xué)功能。實(shí)時(shí)定量 PCR 檢測(cè)表明， SlARF12 在花蕾中表達(dá)量逐漸降低，而在授粉后的子房中顯著高于去雄后未授粉的子房。利用 RNA 干擾（ RNAi）技術(shù)抑制 SlARF12 表達(dá)，對(duì)番茄植株?duì)I養(yǎng)生長(zhǎng)與花的發(fā)育沒(méi)有顯著影響，但 SlARF12 RNAi 果實(shí)顯著大于野生型與空載轉(zhuǎn)化植株的果實(shí)，且開花前去雄未授粉不能形成單性結(jié)實(shí)的果實(shí)。利用半薄切片觀察轉(zhuǎn)基因番茄果實(shí)早期發(fā)育細(xì)胞學(xué)特性發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化植株的果實(shí)果皮細(xì)胞顯著大于對(duì)照果實(shí)細(xì)胞，但是兩者果皮細(xì)胞層數(shù)沒(méi)有顯著差異?；虮磉_(dá)分析發(fā)現(xiàn)在 SlARF12 RNAi 的子房與幼果中細(xì)胞分化相關(guān)基因 CycB1.1 和 CDKB2.1 等的表達(dá)水平同對(duì)照相比下降，而 SlPEC 等細(xì)胞膨大基因表達(dá)量顯著高于對(duì)照。所以抑制 SlARF12 可增強(qiáng)果實(shí)中細(xì)胞膨大相關(guān)基因的表達(dá)，從而促進(jìn)果實(shí)膨大。以上結(jié)果表明， SlARF12 可負(fù)調(diào)控番茄果實(shí)膨大但不參與坐果啟動(dòng)調(diào)控過(guò)程，顯示了生長(zhǎng)素通過(guò) ARF 信號(hào)精細(xì)調(diào)控果實(shí)發(fā)育的各個(gè)階段。 關(guān)鍵詞： 番茄；番茄生長(zhǎng)素響應(yīng)因子 12； RNA 干擾；果實(shí)形態(tài)；細(xì)胞膨大；基因表達(dá) 中圖分類號(hào)： S 641.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)： 0513-353X（ 2018） 04-0678-13 Function Analysis of SlARF12 Gene During Fruit Development in Tomato LIU Songyu， YAN Yanqiu， FENG Qiushuo， and LU Gang*（ Institute of Vegetable Science， Zhejiang University， Hangzhou 310058， China） Abstract： In order to explore the molecular mechanism by which auxin signal transduction mediates fruit set and development， we used tomato variety Micro-Tom to evaluate the biological function of an auxin responsive factor， SlARF12（ HM565127.1）， in fruit development. Real-time PCR analysis showed that the SlARF12 mRNA levels gradually decreased before the flower was fully open， however， it became significantly higher in self-pollinated ovaries than that in emasculated and unpollinated ones. Inhibition of SlARF12 by RNA interference（ RNAi） method had no significant influence on tomato vegetative growth and flower development， but the RNAi fruits in transgenic plants were significantly larger and heavier than those in wild-type plants and empty vector transgenic lines. In addition， no parthenocarpic fruit was developed after artificial emasculation before anthesis. The semi-thin section was performed to compare cytological characteristics in early fruits between RNAi and wild-type plants. The fruit pericap cells of 劉松瑜，閆艷秋，馮秋碩，盧 鋼 . 番茄生長(zhǎng)素響應(yīng)因子基因 SlARF12 在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中的功能分析 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (4)： 678 690. 679 transgenic lines were significantly larger than those of wild-type fruits， but the number of pericap cell layers of transgenic fruit was similar to that of the control fruit. Gene expression analysis showed that the mRNA levels of cell differentiation genes including CycB1.1 and CDKB2.1 in the ovary and young fruit of SlARF12 RNAi transgenic plants decreased when compared with the wild-type fruits， but the expression level of cell expansion gene such as SlPEC was significantly higher than that of the control fruit. Therefore， the inhibition of the SlARF12 expression level would up-regulate the expression levels of cell expansion genes， which might enhance the ability of fruit expansion and result in larger fruits of transgenic plants. The data suggest that SlARF12 can negatively regulate the fruit expansion process in tomato but is not required for fruit initiation， revealing the auxin can finely regulate fruit development at various stages through ARF signal conduction pathway. Keywords： tomato； SlARF12； RNA interference； fruit morphology； cell expansion； gene expression 番茄生產(chǎn)中，尤其是設(shè)施栽培中的低溫、高溫和弱光等環(huán)境條件很容易造成授粉受精不良，導(dǎo)致落花落果，嚴(yán)重影響到產(chǎn)量和品質(zhì)（ Adams et al.， 2001； Ploeg & Heuvelink， 2005） 。外源施用生長(zhǎng)素與生長(zhǎng)素類似物 （ Abad & Monteiro， 1989） ， 過(guò)量表達(dá)生長(zhǎng)素合成過(guò)程中的基因 （ Pandolfini et al.，2002） ，都能誘導(dǎo)番茄單性結(jié)實(shí)。盡管人們對(duì)植物生長(zhǎng)素信號(hào)途徑研究取得了長(zhǎng)足進(jìn)步，同時(shí)也鑒定了生長(zhǎng)素信號(hào)受體、生長(zhǎng)素合成運(yùn)輸以及生長(zhǎng)素信號(hào)傳導(dǎo)的一系列基因（ Gray et al.， 2001； Hagen & Guilfoyle， 2002） ，但生長(zhǎng)素調(diào)控果實(shí)發(fā)育的分子機(jī)理尚未闡明，尤其是對(duì)于果實(shí)發(fā)育啟動(dòng)和早期生長(zhǎng)過(guò)程的調(diào)控機(jī)制還知之甚少。 生長(zhǎng)素響應(yīng)因子（ ARF）是在生長(zhǎng)素信號(hào)途徑中與生長(zhǎng)素早期反應(yīng)基因啟動(dòng)子中的應(yīng)答元件（ AuxRE） TGTCTC 基序結(jié)合來(lái)調(diào)控生長(zhǎng)素響應(yīng)的一類轉(zhuǎn)錄因子。 ARF 對(duì)下游的響應(yīng)基因起關(guān)鍵調(diào)控作用，在植物體內(nèi)生長(zhǎng)素濃度低的時(shí)候， ARF 通過(guò)異源二聚化與 AUX/IAA 蛋白結(jié)合從而抑制下游生長(zhǎng)素反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄；當(dāng)植物體內(nèi)生長(zhǎng)素濃度升高時(shí)（或植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理后） ， Aux/IAA 蛋白能被 SCFTIR1共同體所降解，釋放出 ARF 從而激活下游生長(zhǎng)素反應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄（ Guilfoyle & Hagen， 2001） 。目前已在擬南芥、番茄、水稻、玉米等物種中鑒定了 ARF 家族基因并對(duì)部分基因的功能進(jìn)行了深入研究（ Li et al.， 2016） 。眾多研究表明 ARF 基因可以調(diào)控植物多種發(fā)育過(guò)程，如頂端組織的形成、微管束的形成、雌雄配子體的發(fā)育、開花和果實(shí)發(fā)育、側(cè)根形成和花器官的衰老以及植物體內(nèi)花青苷的代謝等（ Inukai et al.， 2005； Cheng et al.， 2007； Hao et al.， 2015； Zhang et al.，2015； Liu et al.， 2017； Ren et al.， 2017；王意程 等， 2017） 。近年來(lái)先后證實(shí)一批生長(zhǎng)素信號(hào)途徑基因，包括 AtARF8/fwf（ Goetz et al.， 2006） 、 SlARF8（ Goetz et al.， 2007） 、 SlARF7/fwf（ de Jong et al.，2009， 2011） 、 Aucsia（ Molesini et al.， 2009）等是果實(shí)坐果與發(fā)育的負(fù)調(diào)控因子，這些基因的下調(diào)均可以導(dǎo)致果實(shí)單性結(jié)實(shí)；在木本植物麻風(fēng)樹中過(guò)表達(dá) JcARF19 會(huì)引起果實(shí)與種子增大（ Sun et al.，2017） ；桃 ARF 可能參與調(diào)控硬核期果實(shí)與種子的發(fā)育（史夢(mèng)雅 等， 2014） 。這些結(jié)果表明 ARF 對(duì)番茄果實(shí)發(fā)育調(diào)控的復(fù)雜性。 目前對(duì)于番茄 ARF 基因的研究大多集中在 ARF6 與 ARF8 基因亞家族及相鄰的 ARF7 與 ARF19 亞家族基因，對(duì)其他 ARF 基因在果實(shí)發(fā)育過(guò)程的功能還較少涉及（ Goetz et al.， 2007； de Jong et al.， 2009， 2015） 。 SlARF2 在調(diào)控番茄成熟果實(shí)發(fā)育中有重要作用（馮媛媛 等， 2012； Hao et al.， 2015； Breitel et al.， 2016） 。 SlARF4 通過(guò)調(diào)控糖的代謝從而影響番茄果實(shí)早期發(fā)育（ Sagar et al.， 2013）；而 SlARF9 調(diào)控早期發(fā)育果實(shí)的細(xì)胞分裂（ de Jong et al.， 2015）。在前期研究中，通過(guò)生物信息學(xué)以及分子生物學(xué)的方法，鑒定了番茄 15 個(gè)新的 ARF 家族基因（ Wu et Liu Songyu， Yan Yanqiu， Feng Qiushuo， Lu Gang. Function analysis of SlARF12 gene during fruit development in tomato. 680 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (4)： 678 690. al.， 2011） 。初步表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)位于另一亞家族的一個(gè) ARF 基因 SlARF12（序列號(hào)： HM565127.1，先前命名為 SlARF9B） ，在果實(shí)早期發(fā)育過(guò)程表現(xiàn)出與上述 ARF 基因不同的表達(dá)模式（ Wu et al.，2011） ，其生物學(xué)功能值得深入探究。 本研究中以番茄品種 Micro-Tom為材料，利用 RNA 干擾技術(shù)（ RNAi）研究了 SlARF12 在番茄果實(shí)發(fā)育過(guò)程中的生物學(xué)功能，并通過(guò)顯微觀察及表達(dá)分析初步探索了其調(diào)控果實(shí)發(fā)育的作用模式。 1 材料與方法 1.1 試驗(yàn)材料以及取材 試驗(yàn)材料為番茄矮化品種 Micro-Tom，由美國(guó) UC-Davis 大學(xué)番茄種質(zhì)資源庫(kù)提供，經(jīng)本實(shí)驗(yàn)室留種保存。 番茄植株在人工氣候室內(nèi)在 16 h /8 h（光照 /黑暗）的光周期， （ 26 ± 1） /（ 20 ± 1）（晝 /夜）溫度條件下進(jìn)行培養(yǎng)，生長(zhǎng)至開花后，對(duì)根、莖、葉、花、子房、花芽、萼片、花瓣、花藥、花梗等不同組織與器官進(jìn)行取樣。 在番茄花與果實(shí)發(fā)育的不同時(shí)期對(duì)子房或幼果進(jìn)行取樣，包括授粉前花蕾長(zhǎng)度為 3.5 4.5、4.6 6.0 和 6.1 7.5 mm 的子房；同時(shí)在番茄花蕾開花前 2 d 人工去雄，去雄后分別對(duì)開花后 3、 6和 9 d 的幼果進(jìn)行取樣；另外對(duì)去雄后花進(jìn)行人工自交授粉，在開花后 3 d 取幼果。所有樣品液氮冷凍后保存，備用于提取 RNA 以及基因表達(dá)分析。 1.2 植物表達(dá)載體構(gòu)建 根據(jù) pCAMBIA1301 載體多克隆位點(diǎn)和 SlARF12 的 cDNA 序列，使用 primer 5.0 設(shè)計(jì) RNAi載體的 152 bp 的干擾片段擴(kuò)增引物。上游引物序列： 5-ACGCGTCGACACCTTCATCCTCAAA-3，5端加 Sal酶切位點(diǎn)；下游引物序列： 5-CGCGGATCCGCATACCTGAAGTATTTA-3， 5端加 BamH酶切位點(diǎn)。 以番茄 Micro-Tom cDNA 為模板， 將 PCR 擴(kuò)增得到的 152 bp 目的片段與 PUCC 載體分別用 BamH和 Sal進(jìn)行雙酶切，并連接得到重組質(zhì)粒；對(duì)重組質(zhì)粒用 Xho和 Bgl雙酶切，再與雙酶切（ BamH和 Sal）后的目的片段利用同尾酶連接，得到插入了含有正向、反向目的片段的pUCCRNAi + SlARF12 載體。利用載體上正、反目的片段兩端含 Pst和 Sal酶切位點(diǎn)，將正、反目的片段從 pUCCRNAi + SlARF12 載體上通過(guò) Pst和 Sal雙酶切下來(lái)，與經(jīng)過(guò) Pst和 Sal雙酶切后的 pCAMBIA1301 載體進(jìn)行連接，得到 pCAMBIA1301-SlARF12 載體。利用凍融法將pCAMBIA1301-SlARF12 質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌 LBA4404 中。同時(shí)構(gòu)建 pCAMBIA1301 空載質(zhì)粒載體為對(duì)照。 1.3 番茄的遺傳轉(zhuǎn)化 利用“葉盤法”對(duì) Micro-Tom番茄子葉進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化（ Sun et al.， 2006；佟少明 等， 2016）。將在 MS 培養(yǎng)基上生長(zhǎng) 7 9 d 的無(wú)菌苗葉片接種在 1/2MS 預(yù)培養(yǎng)基上培養(yǎng) 1 d 后，通過(guò)農(nóng)桿菌菌液進(jìn)行侵染后，轉(zhuǎn)到誘導(dǎo)培養(yǎng)基（ MS + 2 mg · L-1ZT + 6 mg · L-1Hyg + 300 mg · L-1Timentin）上培養(yǎng)得到抗性芽。將抗性芽轉(zhuǎn)到 MS 生根培養(yǎng)基（ MS + 6 mg · L-1Hyg + 300 mg · L-1Timentin）上生根后劉松瑜，閆艷秋，馮秋碩，盧 鋼 . 番茄生長(zhǎng)素響應(yīng)因子基因 SlARF12 在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中的功能分析 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (4)： 678 690. 681 移栽到裝有混合基質(zhì)（草炭 蛭石 = 3 2）塑料盆中。 1.4 SlARF12 RNAi 植株的分子鑒定 采用 CTAB 法提取番茄 Hyg+抗性植株 DNA，根據(jù) SlARF12 RNAi 干擾片段的序列設(shè)計(jì)上游引物， 以表達(dá)載體 pCAMBIA1301 上序列設(shè)計(jì)下游引物 PCR 擴(kuò)增檢測(cè)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株系。 引物 ARF12-F：5-ATGAGACGGATTTCGTGTTT-3； ARF12-R： 5-CGACAGTGGTCCCAAAGAT-3。 GUS 檢測(cè)參考 Jefferson（ 1987）的文獻(xiàn)進(jìn)行。將轉(zhuǎn)基因和野生型番茄材料的根分別置于 X-Gluc 溶液中，于 37 放置過(guò)夜，經(jīng)過(guò) FAA 固定 15 min 后用 70%乙醇脫色，至陰性對(duì)照為白色，體式顯微鏡（ Leica MZ16 FA， Germany）下觀察并拍照。 1.5 SlARF12 RNAi 植株生長(zhǎng)與果實(shí)形態(tài)學(xué)觀察 在人工氣候室內(nèi)栽培轉(zhuǎn)基因和對(duì)照番茄植株，待到開花期時(shí)觀察營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)狀況、花和果實(shí)的形態(tài)，取第 2 批開放的花與果實(shí)，測(cè)量花器官各個(gè)組織，包括萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊等的長(zhǎng)度與直徑，分析成熟果實(shí)的縱徑、橫徑，單果質(zhì)量，果形指數(shù)，單果種子數(shù)，種子千粒質(zhì)量以及種子發(fā)芽率等。每個(gè)株系設(shè)置 3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)包含分別從 10 個(gè)不同植株中隨機(jī)選取同一批的 30朵開放花和 30 個(gè)果實(shí)進(jìn)行分析。利用 SPSS 15.0 Tukey 檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)的差異顯著性（ P < 0.05） 。 1.6 半薄切片觀察 將野生型與轉(zhuǎn)基因番茄材料種植至開花，對(duì)第 2 批及以后的花與果實(shí)分批取樣，包括開花前兩天去雄與開放當(dāng)天的子房，以及直徑為 3 4、 5 6、 7 8 和 9 10 mm 的不同發(fā)育時(shí)期的子房或果實(shí)。上述每個(gè)階段取 5 個(gè)以上子房或果實(shí)進(jìn)行觀察。 將樣品置于 2.5%戊二醛溶液里面 4 固定過(guò)夜。倒掉固定液，使用 0.1 mol · L-1的磷酸緩沖液（ pH 7.0）漂洗樣品 3 次，每次 15 min；再用 1%鋨酸溶液將樣品固定 1 2 h；重復(fù)漂洗 1 遍；依次用 50%、 70%、 80%、 90%、 95%乙醇脫水處理，每個(gè)濃度 15 min，再用 100%乙醇脫水 20 min，純丙酮 20 min；丙酮和 EPON812 環(huán)氧樹脂包埋劑 1 1 混合液處理 1 h， 1 3 混合液處理 3 h，在純包埋劑中過(guò)夜（ 70 ），獲得包埋好的樣品。樣品使用 LKB 11800 半薄切片機(jī)切片，厚度 1 m，在載玻片上滴 1 滴蒸餾水，將切片置入水滴中，再置于展片機(jī)（ REICHERT-JUNG HK120）上 85 下展片。最后用 0.1 mol · L-1磷酸緩沖液配制的 1%亞甲基藍(lán)染色后于 Leica 熒光顯微鏡（ DFC420C，德國(guó)）下觀察并拍照。 果皮的顯微結(jié)構(gòu)可從外到內(nèi)分為外果皮（外部的 4 5 層細(xì)胞）、中果皮（外果皮與內(nèi)果皮之間的細(xì)胞）、內(nèi)果皮（內(nèi)部的 1 2 層細(xì)胞），每個(gè)時(shí)期的外果皮與中果皮分別選 30 100 個(gè)細(xì)胞，重復(fù) 5 個(gè)果實(shí)，進(jìn)行生物學(xué)統(tǒng)計(jì)（ P < 0.05）。 1.7 番茄野生型與轉(zhuǎn)基因植株的 ARF12 及細(xì)胞分化相關(guān)基因表達(dá)特性分析 在不同發(fā)育時(shí)期對(duì)轉(zhuǎn)基因 SlARF12-5 RNAi T1 代株系以及野生型植株取樣，采用 TriZol 法（ Invitrogen， USA）提取 RNA，按照 Promega 公司提供的 ImProm-IITMReverse Transcription System說(shuō)明書步驟將 RNA 反轉(zhuǎn)錄成 cDNA。 SlARF12 及細(xì)胞分化相關(guān)基因 qRT-PCR 分析引物見表 1。 qRT-PCR 反應(yīng)在 BIO-RAD 公司實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀（ CFX96TM Real Time System）上進(jìn)行。反應(yīng)體系： 1 L cDNA 模板（ 10 ng · L-1） ，10 L SYBR Green premix Ex Taq，引物各 1 L（ 10 ng · L-1） ， ddH2O 補(bǔ)足至 20 L。 PCR 反應(yīng)程序Liu Songyu， Yan Yanqiu， Feng Qiushuo， Lu Gang. Function analysis of SlARF12 gene during fruit development in tomato. 682 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (4)： 678 690. 為： 95 3 min； 95 10 s， 50 60 30 s，循環(huán) 40 次。每個(gè)反應(yīng)熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所進(jìn)行的循環(huán)數(shù)即是 Ct 值，根據(jù)初始模板量對(duì)數(shù)值與 Ct 值間線性關(guān)系的原理，使用 2-Ct法以 Slubi3（ GenBank 登錄號(hào)： X58253.1）為內(nèi)參基因，計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量（ Schmittgen & Livak， 2008） 。所有試驗(yàn)樣品設(shè) 3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。 表 1 qRT-PCR 分析所用引物 Table 1 The primers for qRT-PCR analysis 基因名稱 Gene name 正向序列（ 5 3） Forward 反向序列（ 5 3） Reverse Slubi3 AGAAGAAGACCTACACCAAGCC TCCCAAGGGTTGTCACATACATC SlARF12 GGAGGCATCAACAAATCAGG CTTCGGGCAACAAAGCAATSlCDKB2.1 ATGCTGGTAAGAGTGTATCGG CGGAGAGTAGTTGGAGGAAC SlCycb1.1 CGTTACTAGGAGGTCTGCTG CCTTTAGTTACAAGAGGCTTCG SlPec ATGGGAAGGATCATGGAGACAGTGG AAGGAAGAGGACTTCGCAGCTAAGC SlXTH1 CTGCCACGCCACAAGAAGTCC TTTGACGAACCCAACGAAGTCTCC SlEXPA5 AAGGGTTCAAGAACTCAATGGCAAC ACCATCGCCTGTAGTGACCTTAAAG 2 結(jié)果與分析 2.1 SlARF12 的表達(dá)特性 qRT-PCR 分析結(jié)果表明， SlARF12 在番茄不同器官與組織中均有表達(dá)（圖 1， a） ，在根中表達(dá)量最高，其次是芽和莖，花器官中相對(duì)較低。而在所有花器官組織中，子房中表達(dá)量最高，花藥和花梗中最低。 圖 1 qRT-PCR 檢測(cè)番茄 SlARF12 的時(shí)空表達(dá) Fig. 1 The expression profiles of SlARF12 in tomato using qRT-PCR analysis P < 0.01. 劉松瑜，閆艷秋，馮秋碩，盧 鋼 . 番茄生長(zhǎng)素響應(yīng)因子基因 SlARF12 在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中的功能分析 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (4)： 678 690. 683 對(duì)不同發(fā)育時(shí)期的子房或幼果的分析（圖 1， b）發(fā)現(xiàn)，在授粉受精之前，隨著花的發(fā)育，花蕾長(zhǎng)度的增加， SlARF12 表達(dá)量顯著下降，直至開花期（ anthesis）表達(dá)量也很低，在開花后 3 d 時(shí)表達(dá)量顯著升高， 9 d 后顯著降低； 與之相對(duì)應(yīng)的， 若去雄后進(jìn)行人工授粉后， 花后 3 d 幼果中 SlARF12表達(dá)量急劇增加，明顯高于在花期去雄后未授粉各個(gè)時(shí)期的表達(dá)水平。 2.2 轉(zhuǎn)基因植株的獲得 通過(guò) PCR 檢測(cè)獲得 7 個(gè)轉(zhuǎn)基因株系（圖 2） 。再經(jīng)過(guò) GUS 檢測(cè)（圖 3） ， 7 個(gè)株系全顯陽(yáng)性，同時(shí)獲得了 3 個(gè) pCAMBIA1301 空載陽(yáng)性對(duì)照株系。 圖 2 番茄 Micro-Tom SlARF12 RNAi 植株的 PCR 檢測(cè) M： Marker； 1 8： SlARF12 RNAi 轉(zhuǎn)基因芽系檢測(cè)； 9：陰性對(duì)照； 10：陽(yáng)性對(duì)照。 Fig. 2 PCR amplification detection of SlARF12 in SlARF12 RNAi plants of tomato Micro-Tom M indicates DNA marker； 1 8 indicate the transgenic plants； 9， 10 indicate negative and positive control， respectively. 圖 3 番茄 Micro-Tom SlARF12 RNAi 植株根的 X-Gluc 組織化學(xué)染色檢測(cè) A：野生型番茄根尖； B：轉(zhuǎn)基因番茄根尖。 Fig. 3 GUS expression in SlARF12 RNAi plants roots of tomato Micro-Tom by the staining method of histochemistry A： Wild type root tip； B： Transgenic root tip. 通過(guò)對(duì) SlARF12 表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，篩選出 3 個(gè)有效抑制 SlARF12 表達(dá)的芽系 SlARF12-1、SlARF12-2、 SlARF12-5。 SlARF12 在葉片中表達(dá)量分別為對(duì)照的 38.2%、 55.3%和 39.6%（圖 4） 。 對(duì) SlARF12-5 株系果實(shí)發(fā)育過(guò)程中 SlARF12 基因的表達(dá)檢測(cè)也表明在不同花期的子房與幼果中表達(dá)均受到抑制（圖 5） 。 Liu Songyu， Yan Yanqiu， Feng Qiushuo， Lu Gang. Function analysis of SlARF12 gene during fruit development in tomato. 684 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (4)： 678 690. 圖 4 SlARF12 在 SlARF12 RNAi 各轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)變化 對(duì)照為載體 pCAMBIA1301 轉(zhuǎn)化的對(duì)照植株； 1 5 為 RNAi 不同株系 SlARF12-1、 SlARF12-2、 SlARF12-3、SlARF12-4、 SlARF12-5。 P < 0.05。 Fig. 4 Relative SlARF12 mRNA levels collected from empty vector line and SlARF12 RNAi plant Control indicates pCAMBIA1301 empty control. 1 5： Line of SlARF12-1， SlARF12-2， SlARF12-3， SlARF12-4， and SlARF12-5. P < 0.05. 圖 5 野生型和轉(zhuǎn)基因 SlARF12-5 株系番茄植株不同發(fā)育時(shí)期SlARF12 基因的表達(dá)分析 Fig. 5 Expression of SlARF12 gene in ovaries and fruits of wild-type and SlARF12-5 RNAi plants P < 0.05. 2.3 轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)特性與果實(shí)性狀的觀察 對(duì)抑制程度達(dá)到 60%以上的 SlARF12-5 與 SlARF12-1 株系營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)與生殖生長(zhǎng)特性觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化植株?duì)I養(yǎng)生長(zhǎng)以及在花器官形態(tài)上與野生型植株相比，均沒(méi)有顯著差異（表 2） 。 表 2 SlARF12 RNAi 植株花器官形態(tài)觀察 Table 2 The observation of flower morphology of SlARF12 RNAi transgenic plant mm 株系 Line 萼片 Sepal 花瓣 Petal 雄蕊 Stamen 長(zhǎng) Length 寬 Width 長(zhǎng) Length 寬 Width 長(zhǎng) Length 寬 Width WT 6.50 ± 0.50 a 1.30 ± 0.42 a 8.03 ± 0.85 a 3.00 ± 0.10 a 5.83 ± 0.29 a 2.40 ± 0.36 a SlARF12-5 6.33 ± 0.58 a 1.20 ± 0.26 a 8.50 ± 0.50 a 3.03 ± 0.06 a 5.67 ± 0.29 a 2.53 ± 0.31 a SlARF12-1 6.67 ± 0.55 a 1.34 ± 0.06 a 8.37 ± 0.64 a 3.33 ± 0.58 a 5.50 ± 0.50 a 2.27 ± 0.46 a 株系 Line 花柱 Style 子房 Ovary 長(zhǎng) Length 直徑 Diameter 長(zhǎng) Length 寬 Width WT 4.73 ± 0.64 a 0.30 ± 0.10 a 1.23 ± 0.06 a 1.03 ± 0.06 a SlARF12-5 4.88 ± 0.78 a 0.33 ± 0.06 a 1.37 ± 0.38 a 1.20 ± 0.35 a SlARF12-1 4.90 ± 0.36 a 0.32 ± 0.08 a 1.23 ± 0.06 a 1.07 ± 0.12 a 注：所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)通過(guò) SPSS 15.0 軟件進(jìn)行顯著性差異分析（ P < 0.05） 。 Note： All statistical analyses were performed with SPSS 15.0（ P < 0.05） . 比較轉(zhuǎn)化植株和野生型番茄果實(shí)發(fā)育特性發(fā)現(xiàn)， SlARF12-5 與 SlARF12-1 轉(zhuǎn)化株系與野生型植株相比，坐果率沒(méi)有顯著差異，同時(shí)單個(gè)果實(shí)內(nèi)的種子數(shù)量沒(méi)有明顯改變，說(shuō)明 ARF12 被抑制后對(duì)番茄坐果和種子發(fā)育影響不大（表 3，圖 6） 。但是在自交授粉果實(shí)中， RNAi 轉(zhuǎn)化株系 SlARF12-5與 SlARF12-1 果實(shí)質(zhì)量顯著高于野生型與空載 pCAMBIA1301 轉(zhuǎn)化的對(duì)照植株的果實(shí)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，果實(shí)縱徑增加不顯著，但橫徑顯著高于野生型與空載轉(zhuǎn)基因植株（表 3） 。在去雄未授粉的番茄植株中，野生型與空載轉(zhuǎn)基因植株， SlARF12-5 與 SlARF12-1 RNAi 轉(zhuǎn)基因株系均無(wú)果實(shí)形成。 劉松瑜，閆艷秋，馮秋碩，盧 鋼 . 番茄生長(zhǎng)素響應(yīng)因子基因 SlARF12 在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中的功能分析 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (4)： 678 690. 685 圖 6 各組番茄植株的果實(shí)性狀觀察 A、 E：野生型； B、 F：空載轉(zhuǎn)化株系； C、 G：轉(zhuǎn)基因株系 SlARF12-5； D、 H：轉(zhuǎn)基因株系 SlARF12-1。 Fig. 6 Observation of fruit phenotypic characteristics A， E： Wild type fruits； B， F： Empty vector line； C， G： RNAi SlARF12-5 line； D， H： RNAi SlARF12-1 line. 表 3 番茄野生型和 SlARF12 RNAi 轉(zhuǎn)基因植株果實(shí)發(fā)育與種子數(shù)比較 Table 3 Fruit characteristic and seeds number of wild-type and SlARF12 RNAi transgenic plants 株系 Line 質(zhì)量 /g Weight 縱徑 / cm Polar diameter 橫徑 / cm Equatorial diameter 單果種子數(shù) Seeds per fruit 坐果率 /% Fruit set rate WT 3.45 ± 0.63 b 1.95 ± 0.07 a 1.96 ± 0.12 b 20.33 ± 3.51 a 73.30 a 1301-empty 3.39 ± 0.27 b 1.85 ± 0.07 a 1.92 ± 0.06 b 19.00 ± 1.70 a 69.10 a SlARF12-5 4.24 ± 0.17 a 2.03 ± 0.15 a 2.43 ± 0.06 a 22.33 ± 8.74 a 64.00 a SlARF12-1 4.11 ± 0.18 a 1.92 ± 0.19 a 2.30 ± 0.10 a 24.00 ± 6.93 a 71.00 a 注：所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)通過(guò) SPSS 15.0 軟件進(jìn)行顯著性差異分析（ P < 0.05） 。 Note： All statistical analyses were performed with SPSS 15.0（ P < 0.05） . 2.4 SlARF12 轉(zhuǎn)化植株果實(shí)發(fā)育細(xì)胞學(xué)統(tǒng)計(jì) 通過(guò)對(duì) SlARF12 RNAi 株系 SlARF12-5 從未受精的子房到授粉后直徑 10 mm 的果實(shí)顯微觀察發(fā)現(xiàn)，在開花時(shí)野生型和 SlARF12 RNAi 植株的果皮沒(méi)有明顯的差別（圖 7， A、 F） 。從果實(shí)直徑 3 4 mm 開始，野生型和 SlARF12 RNAi 植株果實(shí)的外果皮與中果皮細(xì)胞大小開始顯示出差異，表現(xiàn)為轉(zhuǎn)基因的株系果實(shí)細(xì)胞大于野生型果皮細(xì)胞。這種差異在果實(shí)直徑達(dá)到 5 6 mm 以上時(shí)更加明顯（圖 7， C E， H J） 。 對(duì)不同時(shí)期果實(shí)果皮細(xì)胞平均面積大小進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析， 同為 5 6 mm 果實(shí)， 轉(zhuǎn)化株系 SlARF12-5外果皮細(xì)胞平均面積比野生型增加 76.0%，中果皮細(xì)胞平均面積增加 137%（圖 8， A） ，說(shuō)明轉(zhuǎn)化植株的果皮平均細(xì)胞顯著大于野生型。 對(duì)不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)果皮（外、中、內(nèi)果皮）的統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化植株 3 4 mm 和 5 6 mm 果實(shí)的細(xì)胞層數(shù)與野生型果實(shí)無(wú)顯著差異（圖 8，