園藝學(xué)報， 2018， 45 (6)： 1081 1088. Acta Horticulturae Sinica doi： 10.16420/j.issn.0513-353x.2018-0046； http： /www. ahs. ac. cn 1081 收稿日期 ： 2018 03 05； 修回日期 ： 2018 06 04 基金項目 ： 國家重點研發(fā)計劃項目（ 2016YFD0101703， 2017YFD0101902） ；上海市種業(yè)發(fā)展項目滬農(nóng)科種字（ 2016）第 1-13 號，滬農(nóng)科種字（ 2017）第 3-1-2 號；上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院“卓越”團隊建設(shè)計劃項目農(nóng)科創(chuàng) 2017（ B-06） * 共同第一作者 * 通信作者 Author for correspondence（ E-mail： zhulongyingsaas.sh.cn） 番茄組蛋白變體 H2A.Z 基因雙突變體的獲得及其功能研究 楊學(xué)東*，田守波*，朱為民，盧盼玲，王 虹，王 穎，張 輝*，朱龍英*（上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，上海市設(shè)施園藝技術(shù)重點實驗室，上海 201403） 摘 要： 以番茄自交系 1479 為材料，利用基因編輯技術(shù)創(chuàng)制番茄組蛋白變體 H2A.Z 基因雙突變體hta11hta9。 測序結(jié)果表明番茄 H2A.Z 基因被敲除。 發(fā)芽試驗結(jié)果表明組蛋白基因 H2A.Z 雙突變體 hta11hta9種子萌發(fā)受到嚴(yán)重影響。在相對低溫（ 17 ）下， H2A.Z 基因雙突變體生長明顯比野生型遲緩。 關(guān)鍵詞： 番茄；基因編輯；組蛋白變體 中圖分類號： S 641.2 文獻標(biāo)志碼： A 文章編號： 0513-353X（ 2018） 06-1081-08 Tomato Double Mutant of Histone Variant Gene was Obtained and its Function Research YANG Xuedong*， TIAN Shoubo*， ZHU Weimin， LU Panling， WANG Hong， WANG Ying， ZHANG Hui*， and ZHU Longying*（ The Protected Horticulture Institute， Shanghai Academy of Agricultural Sciences， Shanghai Key Laboratory of Protected Horticulture Technology， Shanghai 201403， China） Abstract： Using tomato inbred line 1 479 as the material， a double mutant of H2A.Z gene of histone variant hta11hta9 was obtained by gene editing technique. Sequencing analysis showed that the tomato H2A.Z gene was knocked out. The results of germination experiment showed that H2A.Z double mutant hta11hta9 had a serious effect on seed germination. The growth of H2A.Z double mutant hta11hta9 was obviously slower than wild type under the relative low temperature of 17 . Keywords： tomato； gene editing； histone variant 全基因組測序和基因組學(xué)的發(fā)展亟需有效的基因編輯工具來闡明基因的功能。鋅指核酸酶（ zinc-finger nucleases， ZFNs）是由鋅指結(jié)構(gòu)域與核酸內(nèi)切酶 Fok的切割結(jié)構(gòu)域融合而形成的具有識別特性的核酸內(nèi)切酶。 ZFNs 是最早開發(fā)的基因編輯工具，但是由于其具有載體設(shè)計困難、脫靶率高以及有限的靶位點等缺點限制了廣泛應(yīng)用（ Qi et al.， 2013） 。類轉(zhuǎn)錄活化因子核酸酶（ transcription activator-like effector nucleases， TALENs）是由識別 DNA 堿基序列的 TALEs 蛋白和核酸內(nèi)切酶 Fok的切割結(jié)構(gòu)域融合形成（ Zhang et al.， 2010） 。作為基因編輯的工具 TALENs 比 Yang Xuedong， Tian Shoubo， Zhu Weimin， Lu Panling， Wang Hong， Wang Ying， Zhang Hui， Zhu Longying. Tomato double mutant of histone variant gene was obtained and its function research. 1082 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (6)： 1081 1088. 圖 1 中間載體 pGEM-SlU6-sgRNA（ A）和表達載體pC131-35S-Cas9（ B） Fig. 1 Intermediate vector pGEM-SlU6-sgRNA（ A） and expression vector pC131-35S-Cas9（ B） ZFNs 高效， 同時構(gòu)建載體簡單， 成本低廉， 但是構(gòu)建具有相似 TALE 模塊序列的載體比較復(fù)雜。 2013年， 有兩個研究團隊分別獨立發(fā)現(xiàn)并證明了常間回文重復(fù)序列叢集 /常間回文重復(fù)序列叢集關(guān)聯(lián)蛋白（ clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated proteins， CRISPR/Cas）在人類和老鼠細胞中的靶向基因組切割功能（ Cong et al.， 2013； Mali et al.， 2013） 。 CRISPR/Cas系統(tǒng)的識別位點末端有 PAM 序列 NGG，只需要根據(jù)需求改變 gRNA 來特異靶向基因組 DNA，而起切割作用的 Cas9 蛋白不需要改變，因此比 ZFNs 和 TALENs 更加簡潔。 CRISPR/Cas 系統(tǒng)被開發(fā)以來，以其高效、簡單、低成本等特點被廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域（ Li et al.， 2013）。目前， CRISPR/Cas在許多物種中能夠成功進行基因敲除、插入、激活和抑制（ Pennisi， 2013），該系統(tǒng)已經(jīng)被應(yīng)用到擬南芥、短柄草（ Shan et al.， 2013）、煙草（ Nekrasov et al.， 2013）、水稻、小麥以及高粱（ Chen & Gao， 2014）中。自 2014 年開始利用 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)編輯番茄基因組（ Brooks et al.， 2014），改良番茄重要性狀的報道不斷，例如利用 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)敲除 SlIAA9 創(chuàng)制單性結(jié)實番茄（ Ueta et al.， 2017） ，通過敲除 SP5G 促進番茄提早開花和果實成熟（ Soyk et al.， 2017a），通過基因編輯 J2和 EJ2 創(chuàng)制多分枝高產(chǎn)量番茄材料（ Soyk et al.， 2017b）等。 組蛋白變體 H2A.Z 參與很多生物學(xué)過程，包括基因激活（ Xiao et al.， 2013）、 DNA 損傷修復(fù)（ Lee et al.， 2010）、染色體分離（ Segarra et al.， 2010）和異染色質(zhì)沉默等（ Yoo et al.， 2011）。擬南芥中組蛋白變體 H2A.Z 調(diào)節(jié)開花時間， 參與免疫反應(yīng)和感知環(huán)境溫度變化 （ Nah & Jeffrey， 2010；Crevillen & Dean， 2011）。本研究中根據(jù)植物組蛋白同源性獲得了番茄組蛋白變體 H2A.Z 基因，利用基因編輯技術(shù)獲得了番茄組蛋白變體基因 H2A.Z 純合單突變體， 高通量測序表明番茄 H2A.Z 基因均被敲除；通過雜交進一步獲得了番茄 H2A.Z 基因雙突變體，發(fā)芽試驗表明雙突變體種子萌發(fā)受到嚴(yán)重抑制，低溫試驗表明雙突變體生長明顯遲緩于野生型。 1 材料與方法 1.1 試驗材料 番茄（ Solanum lycopersicum L.）自交系 1479和根癌農(nóng)桿菌 GV3101 均由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所提供。試驗于 2015 年 7月到 2017 年 12 月在該所進行。 1.2 基因敲除載體構(gòu)建 將番茄 SlU6 啟動子和 sgRNA 通過融合PCR 連接并克隆到 pGEM-T 載體上， SlU6 啟動子和 sgRNA 含有 2 個 Bsa酶切位點，形成中間載體 pGEM-SlU6-sgRNA（圖 1， A）。將Cas9 序列通過酶切位點 BamH和 Sac克隆到 pC131-N1-YFP 載體上，形成表達載體pC131-35S-Cas9（圖 1， B）。 根據(jù)番茄目標(biāo)基因設(shè)計靶向序列，根據(jù)靶向序列合成帶有與 Bsa酶切粘性末端互補序楊學(xué)東，田守波，朱為民，盧盼玲，王 虹，王 穎，張 輝，朱龍英 . 番茄組蛋白變體 H2A.Z 基因雙突變體的獲得及其功能研究 . 園藝學(xué)報， 2018， 45 (6)： 1081 1088. 1083 表 1 突變體鑒定引物 Table 1 Primers for mutant identification 引物名稱 Primer name 引物序列（ 5 3） Primer sequence HTA11F GGAGGGAAAGGGCTAGTAGCGG HTA11Fm GGAGGGAAAGGGCAGCGGGGAA HTA11R CTCTTTCTAATGGTAGAAAT HTA9F GGGAAAACAGCGGCTAATAAGG HTA9Fm GATTATGGGGAAAACAGTAAGG HTA9R ATGCGCAAACTTTTCAAATT HTA11CeF TTACAGATCTACGCACAAAT HTA11CeR CTCTTTCTAATGGTAGAAAT HTA9CeF CCTTCCAGCTCAGTCCCAAT HTA9CeR ATGCGCAAACTTTTCAAATT 列的引物。將合成的引物通過 Bsa酶切位點克隆到中間載體 pGEM-SlU6-sgRNA，并通過 Hind酶切位點將帶有靶向序列的 SlU6-sgRNA 克隆到表達載體 pC131-35S-Cas9，獲得 pC131-SlU6- sgRNA-35S-Cas9。 將 pC131-SlU6-sgRNA-35S-Cas9 轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，并侵染番茄子葉。利用潮霉素對侵染后番茄子葉進行抗性篩選，分離抗性芽后進行生根培養(yǎng)。提取抗性苗基因組 DNA，并通過對目標(biāo)基因進行 Sanger 測序驗證靶向位點突變情況。 靶向位點設(shè)計位置位于番茄 HTA11 和 HTA9 基因的第1 個外顯子。 Sanger 測序引物（表 1）設(shè)計在靶序列的上游和下游。 分別構(gòu)建 HTA11 和 HTA9 的基因敲除載體，獲得單基因純合突變體之后，通過雜交獲得雙突變體。 1.3 番茄遺傳轉(zhuǎn)化和突變體檢測 野生型番茄種子經(jīng) 70%乙醇消毒 1 min，無菌水沖洗 3 次， 10%次氯酸鈉（可加 0.1% Tween-20，不加 SDS）處 理 10 min，用無菌水沖洗 5 次。種子轉(zhuǎn)移到 1/2MS 培養(yǎng)基上發(fā)芽（ 26 ， 16 h 光照）。將 7 d 的子葉切下并在低光照條件下 25 預(yù)培養(yǎng) 24 h。將農(nóng)桿菌菌液倒入裝有子葉的培養(yǎng)皿中，室溫放置 30 min，并不時晃動以幫助農(nóng)桿菌與子葉的接觸。將多余的菌液用移液器移去，于 25 黑暗條件下共培養(yǎng) 48 h。 48 h 后將子葉轉(zhuǎn)移到含 15 mg · L-1潮霉素的篩選培養(yǎng)基上，子葉的上表面朝上。每 2 周換新鮮篩選培養(yǎng)基， 1 個月后切取抗性芽轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基。生根的無菌苗經(jīng)煉苗后移入營養(yǎng)土中，檢測基因轉(zhuǎn)化和靶基因突變情況。基因轉(zhuǎn)化檢測引物用 Cas9F/Cas9R。鑒定 hta11hta9雙突變體的引物為 HTA11F/HTA11R、 HTA11Fm/HTA11R、 HTA9F/HTA9R、 HTA9Fm/HTA9R（表 1）。 1.4 種子發(fā)芽率統(tǒng)計和低溫處理試驗 選取野生型和 hta11hta9 雙突變體種子各 300 粒，設(shè)置 3 次重復(fù)，每次重復(fù) 100 粒。番茄種子置于墊有直徑 9 cm 濾紙的培養(yǎng)皿中，倒入 8 mL 蒸餾水，加蓋后放置在 26 的恒溫培養(yǎng)箱中進行發(fā)芽。種子以胚根明顯露白認定為發(fā)芽。每隔 24 h 將發(fā)芽的種子取出計數(shù)，直至 11 d 為止。 為了研究番茄組蛋白 H2A.Z 基因在番茄耐受低溫中所起的作用，分別將野生型和雙突變體hta11hta9 在 17 和 22 條件下培養(yǎng) 5 周，光照 16 h，黑暗 8 h。在 17 和 22 條件下培養(yǎng) 5周，測量野生型和雙突變體的株高和單株鮮質(zhì)量，均為 12 次重復(fù)。在 22 條件下培養(yǎng) 5 周，通過對野生型和 hta11hta9 雙突變體進行 RNA 測序獲得 FPKM（ fragments per kilobase million）值， 3 次重復(fù)。 2 結(jié)果與分析 2.1 番茄組蛋白變體 H2A.Z 基因突變體的獲得 根據(jù)同源性比對， 從番茄基因組發(fā)現(xiàn) 3 個 H2A.Z 基因， 分別是 HTA11（ Solyc06g084090） 、 HTA9 （ Solyc12g006830）和 HTA8（ Solyc09g065755）。根據(jù)番茄 HTA11 和 HTA9 設(shè)計靶向位點，利用基Yang Xuedong， Tian Shoubo， Zhu Weimin， Lu Panling， Wang Hong， Wang Ying， Zhang Hui， Zhu Longying. Tomato double mutant of histone variant gene was obtained and its function research. 1084 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (6)： 1081 1088. 因編輯技術(shù)獲得了雜合突變和純合突變的后代（表 2）。 表 2 基因編輯結(jié)果統(tǒng)計 Table 2 Statistics of gene editing results 番茄目標(biāo)基因 Tomato target gene 靶向位點 Target site 檢測總數(shù)Total 雜合突變體數(shù)量 Number of heterozygous mutation 純合突變體數(shù)量 Number of homozygous mutation HTA11（ Solyc06g084090） GGAGGGAAAGGGCTAGTAGC 33 20 4 HTA9（ Solyc12g006830） GGGGAAAACAGCGGCTAATA 27 17 1 對 T0 代進行 Sanger 測序，發(fā)現(xiàn)了 HTA11 基因缺失 4 個堿基和 HTA9 基因缺失 7 個堿基的純合突變單株（圖 2）。 圖 2 番茄 HTA11 和 HTA9 基因 Sanger 測序結(jié)果 Fig. 2 The Sanger sequencing results of tomato HTA11 and HTA9 根據(jù)靶位點基因序列缺失差異設(shè)計能夠檢測突變體和野生型的引物，用來檢測 HTA11 和 HTA9基因的雜合和純合狀態(tài)。引物 HTA11F/HTA11R 和 HTA9F/HTA9R 根據(jù)野生型的 HTA11 和 HTA9 基因設(shè)計，如果 PCR 有條帶，基因沒有突變。引物 HTA11Fm/HTA11R 和 HTA9Fm/HTA9R 根據(jù)兩個基因發(fā)生突變的序列設(shè)計，如果 PCR 有條帶說明基因發(fā)生突變。 將兩個基因的單突變體 hta11和 hta9雜交獲得 F1， 經(jīng)過突變體引物驗證發(fā)現(xiàn) F1的 HTA11和 HTA9基因均為雜合狀態(tài)（圖 3）。 F1自交獲得 F2并經(jīng)過突變體引物鑒定獲得了 hta11hta9 純合雙突變體（圖 3）。對于經(jīng)過 PCR 鑒定的雙突變體經(jīng)過進一步 Sanger 測序，證實 HTA11 和 HTA9 基因均為純合突變，即獲得番茄的 HTA11 和 HTA9 基因的純合雙突變體 hta11hta9。 2.2 雙突變體基因敲除效果檢測 取雙突變體 hta11hta9 和野生型葉片，經(jīng)過表達譜測序驗證，發(fā)現(xiàn)番茄 HTA11 和 HTA9 基因表達在雙突變體中表達極低（圖 4）。檢測番茄 H2A.Z 基因 HTA8（ Solyc09g065755）表達情況發(fā)現(xiàn)，HTA8 基因表達在對照和 hta11hta9 之間沒有差別（圖 5）。以上結(jié)果表明通過基因編輯技術(shù)， HTA11和 HTA9 基因均被定點敲除，獲得了番茄 HTA11 和 HTA9 雙突變體 hta11hta9。 楊學(xué)東，田守波，朱為民，盧盼玲，王 虹，王 穎，張 輝，朱龍英 . 番茄組蛋白變體 H2A.Z 基因雙突變體的獲得及其功能研究 . 園藝學(xué)報， 2018， 45 (6)： 1081 1088. 1085 圖 3 突變體 hta11 和 HTA9 雜交 F1和 F2代的 PCR 檢測結(jié)果 F1： 1：野生型； 2： hta11 突變體； 3： hta9 突變體； 4 9： HTA11 基因和 HTA9 基因均為雜合突變。 F2： 1 4： HTA11 基因純合突變體 和 HTA9 純合突變體； 5： HTA11 基因雜合突變， HTA9 基因純合突變； 6： HTA11 基因純合突變， HTA9 基因雜合突變； 7： HTA9 基因純合突變； 8： HTA11 基因雜合突變； 9： HTA11 基因雜合突變， HTA9 基因雜合突變； 10： HTA11 和 HTA9 基因均未突變； 11： HTA9 基因雜合突變； 12： HTA11 基因雜合突變； 13：野生型。 M： DNA 標(biāo)記。 Fig. 3 Identification of tomato H2A.Z double mutant F1： 1： WT； 2： hta11 mutant； 3： hta9 mutant； 4 9： Heterozygous mutation at HTA11 and HTA9 genes. F2： 1 4： Homozygous mutation at HTA11 and HTA9 genes； 5： Heterozygous mutation at HTA11 gene， homozygous mutation at HTA9 gene； 6： Homozygous mutation at HTA11 gene， heterozygous mutation at HTA9 gene； 7： Homozygous mutation at HTA9 gene； 8： Heterozygous mutation at HTA11 gene； 9： Heterozygous mutation at HTA9 gene； 10： No mutation at HTA11 and HTA9 genes； 11： Heterozygous mutation at HTA9 gene； 12： Heterozygous mutation at HTA11 gene； 13： Wild type. M： DNA marker. 2.3 番茄組蛋白變體 H2A.Z 基因雙突變體發(fā)芽率檢測 種子萌發(fā)試驗表明 hta11hta9 雙突變體發(fā)芽能力顯著低于野生型 （圖 6） ， 發(fā)芽 11 d 時 hta11hta9發(fā)芽率為 53%，而野生型為 90%。這表明番茄 H2A.Z 基因參與了種子萌發(fā)過程，對于種子正常萌發(fā)具有重要作用。 2.4 番茄組蛋白變體 H2A.Z 基因?qū)τ诜衙缙诘蜏啬托缘挠绊?將番茄野生型和雙突變體 hta11hta9 在 17 和 22 條件下培養(yǎng) 5 周，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在 22 條件下野生型和雙突變體 hta11hta9 株高無顯著差異，但是在 17 條件下 hta11hta9 雙突變體株高要明顯小于野生型（圖 7）。 圖 4 HTA11和 HTA9 基因在番茄野生型和雙 突變體 hta11hta9 中的表達 Fig. 4 Expression of HTA11 and HTA9 genes in wild type and double mutant hta11hta9 * P < 0.01. 圖 5 組蛋白變體 H2A.Z 基因 HTA8（ Solyc09g065755）在番茄野生型 （ WT） 和雙突變體 hta11hta9 中的表達 Fig. 5 Expression of HTA8 gene in wild type（ WT） and double mutant hta11hta9 Yang Xuedong， Tian Shoubo， Zhu Weimin， Lu Panling， Wang Hong， Wang Ying， Zhang Hui， Zhu Longying. Tomato double mutant of histone variant gene was obtained and its function research. 1086 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (6)： 1081 1088. 在 17 條件下 hta11hta9 雙突變體的單株質(zhì)量極顯著低于野生型，而在 22 條件下，兩者沒有顯著差異（圖 8）。 圖 6 番茄野生型和雙突變體 hta11hta9 種子發(fā)芽率 Fig. 6 Seed germination rate of wild type and double mutant hta11hta9 *P < 0.01. 3 討論 基因編輯系統(tǒng) CRISPR/Cas9 自 2013 年報道以來，以其高效、操作簡單、特異性好等優(yōu)點迅速被應(yīng)用于醫(yī)療、基因功能研究、農(nóng)作遺傳改良等領(lǐng)域（崔霞和張率斌， 2017）。本研究中利用番茄U6-26 基因啟動子啟動 guide RNA，利用 35S 啟動子啟動 Cas9 基因表達，建立基于 CRISPR/Cas9載體系統(tǒng)獲得番茄基因組定點敲除突變體的方法，并且獲得了較好的基因敲除結(jié)果。目前，隨著研究的深入，對于基因編輯精度要求越來越高，因此利用 CRISPR 系統(tǒng)進行堿基替換受到人們的重視，包括 C： G 編輯為 T： A 以及 T： A 編輯為 C： G（ Gaudelli et al.， 2017； Komor et al.， 2017）。高彩霞研究組構(gòu)建了高效的植物單堿基編輯系統(tǒng) nCas9-PBE，成功地在小麥、水稻和玉米三大重要農(nóng)作物的基因組中實現(xiàn)高效、精確的單堿基定點突變（ Zong et al.， 2017） ，朱健康研究組利用APOBEC1-XTEN-Cas9(D10A)融合序列在水稻中對 NRT1.1B 和 SLR1 進行了堿基替換（ Lu & Zhu，圖 7 不同溫度下番茄野生型和雙突變體 hta11hta9 株高 Fig. 7 Plant height of wild type and double mutant hta11hta9 under different temperatures *P < 0.01. 圖 8 不同溫度下番茄野生型和雙突變體 hta11hta9 質(zhì)量 Fig. 8 Weight of wild type and double mutant hta11hta9 under different temperatures *P < 0.01. 楊學(xué)東，田守波，朱為民，盧盼玲，王 虹，王 穎，張 輝，朱龍英 . 番茄組蛋白變體 H2A.Z 基因雙突變體的獲得及其功能研究 . 園藝學(xué)報， 2018， 45 (6)： 1081 1088. 1087 2017）。因此，開發(fā)適合番茄堿基替換載體系統(tǒng)將是研究番茄基因組編輯技術(shù)應(yīng)用的一個重要方向。 H2A.Z 是組蛋白 H2A 的變體之一，在不同物種之間有著高度的序列保守性，在調(diào)控植物開花、生長發(fā)育、免疫應(yīng)答、有絲分裂、 DNA 修復(fù)以及溫度感應(yīng)等方面均發(fā)揮了重要作用。本研究中通過基因編輯獲得了番茄的 H2A.Z 基因的雙突變體 hta11hta9，并發(fā)現(xiàn)雙突變體 hta11hta9 種子萌發(fā)受到嚴(yán)重影響，發(fā)芽率明顯低于野生型，這表明組蛋白 H2A.Z 基因?qū)τ诜N子正常萌發(fā)發(fā)揮了重要作用。通過對擬南芥的 ARP6 基因缺失突變體 suf3 表型研究發(fā)現(xiàn) suf3 在胚胎發(fā)育和種子萌發(fā)方面都存在明顯缺陷，而 ARP 通過染色質(zhì)重塑復(fù)合物 SWR1 將 H2A.Z 組裝到核小體中（ Crevillen & Dean， 2011；Berriri et al.， 2016） 。 番茄在 17 條件下處理 5 周，發(fā)現(xiàn) hta11hta9 生長明顯遲緩于野生型，植株質(zhì)量和株高均顯著小于野生型，但是在 22 培養(yǎng)條件下 hta11hta9 和野生型沒有明顯差別。這些結(jié)果表明 H2A.Z 基因在相對低溫情況下番茄生長發(fā)育具有重要作用。在擬南芥上的研究表明，組蛋白變體 H2A.Z 及其參與的核小體組裝在植物感知溫度變化的過程中扮演了重要角色， H2A.Z 賦予核小體更高的穩(wěn)定性，含有 H2A.Z 的核小體在相對高的溫度下可以保持穩(wěn)定（ Kumar & Wigge， 2010）。在染色質(zhì)重塑復(fù)合物 Swr1 成員 ARP6（ Actin related protein 6）缺失的突變體中， H2A.Z 不能夠正常加載到溫度應(yīng)答基因 Hsp70 上，并且 arp6 突變體植株熱相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平也與野生型在高溫處理下一致（ Kumar & Wigge， 2010）。在二穗短柄草中，受 ARP6 調(diào)節(jié)參與染色質(zhì)重塑的 H2A.Z 在熱脅迫應(yīng)答和谷粒發(fā)育過程中扮演了重要角色（ Boden et al.， 2013）。染色質(zhì)重塑以及核小體組裝過程在植物應(yīng)答外界環(huán)境溫度過程中起了重要作用。低溫處理擬南芥時， COR15A 和 ATGOLS3 通過啟動子區(qū)域染色質(zhì)的去組裝來激活表達； 而當(dāng)恢復(fù)正常溫度條件時， 組蛋白和核小體的動態(tài)變化得到逆轉(zhuǎn) （ Kwon et al.，2009）。核小體的組裝和去組裝機制可能是一種植物通過快速調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)來適應(yīng)環(huán)境溫度變化的機制（ Zhu et al.， 2013）。在高等植物中，從染色質(zhì)層面上認識 H2A.Z 調(diào)控基因表達的分子機理是新的研究熱點。 關(guān)于溫度調(diào)控植物生長發(fā)育， H2A.Z 感知溫度及參與調(diào)控免疫 （ Cheng et al.， 2013）的研究主要在模式作物擬南芥上取得一些進展，而在重要農(nóng)作物如番茄上的研究很少。 References Berriri S， Gangappa S N， Kumar S V. 2016. SWR1 chromatin-remodeling complex subunits and H2A.Z have non-overlapping functions in immunity and gene regulation in Arabidopsis. Molecular Plant， 9 (7)： 1051 1065. Boden S A， Kavanova M， Finnegan E J， Wigge P A. 2013. Thermal stress effects on grain yield in Brachypodium distachyon occur via H2A.Z-nucleosomes. Genome Biology， 14 (6)： R65. Brooks C， Nekrasov V， Lippman Z B， van Eck J. 2014. Efficient gene editing in tomato in the first generation using the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated9 system. Plant Physiology， 166 (3)： 1292 1297. Chen K， Gao C. 2014. Targeted genome modification technologies and their applications in crop improvements. Plant Cell Reports， 33 (4)：575 583. Cheng C， Gao X， Feng B， Sheen J， Shan L， He P. 2013. Plant immune response to pathogens differs with changing temperatures. Nature Communications， 4： 2530. Cong L， Ran F A， Cox D， Lin S， Barretto R， Habib N， Hsu P D， Wu X， Jiang W， Marraffini L A， Zhang F. 2013. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science， 339 (6121)： 819 823. Crevillen P， Dean C. 2011. Regulation of the floral repressor gene FLC： the complexity of transcription in a chromatin context. Current Opinion in Plant Biology， 14 (1)： 38 44. Cui Xia， Zhang Shuaibin. 2017. The utilization and prospect of genome editing in horticultural crops. Acta Horticulturae Sinica， 44 (9)： 1787 1795. (in Chinese) 崔 霞，張率斌 . 2017. 基因編輯技術(shù)及其在園藝作物中的應(yīng)用和展望 . 園藝學(xué)報， 44 (9)： 1787 1795. Yang Xuedong， Tian Shoubo， Zhu Weimin， Lu Panling， Wang Hong， Wang Ying， Zhang Hui， Zhu Longying. Tomato double mutant of histone variant gene was obtained and its function research. 1088 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (6)： 1081 1088. Gaudelli N M， Komor A C， Rees H A， Packer M S， Badran A H， Bryson D I， Liu D R. 2017. Programmable base editing of A*T to G*C in genomic DNA without DNA cleavage. Nature， 551 (7681)： 464 471. Komor A C， Zhao K T， Packer M S， Gaudelli N M， Waterbury A L， Koblan L W， Kim Y B， Badran A H， Liu D R. 2017. Improved base excision repair inhibition and bacteriophage Mu Gam protein yields C:G-to-T:A base editors with higher efficiency and product purity. Science Advances， 3 (8)： eaao4774. Kumar S V， Wigge P A. 2010. H2A.Z-containing nucleosomes mediate the thermosensory response in Arabidopsis. Cell， 140 (1)： 136 147. Kwon C S， Lee D， Choi G， Chung W I. 2009. Histone occupancy-dependent and -independent removal of H3K27 trimethylation at cold-responsive genes in Arabidopsis. The Plant Journal， 60 (1)： 112 121. Lee H， Yoo S J， Lee J H， Kim W， Yoo S K， Fitzgerald H， Carrington J C， Ahn J H. 2010. Genetic framework for flowering-time regulation by ambient temperature-responsive miRNAs in Arabidopsis. Nucleic Acids Research， 38 (9)： 3081 3093. Li J F， Norville J E， Aach J， McCormack M， Zhang D， Bush J， Church G M， Sheen J. 2013. Multiplex