桃ABA8''-羥化酶基因PpeCYP707As在擬南芥中過表達的功能分析.pdf

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桃ABA8''-羥化酶基因PpeCYP707As在擬南芥中過表達的功能分析.pdf

<p>園藝學報， 2018， 45 (2)： 239 249. Acta Horticulturae Sinica   doi： 10.16420/j.issn.0513-353x.2017-0350； http： /www. ahs. ac. cn                                                   239 收稿日期： 2017 08 02；修回日期： 2018 01 22 基金項目：國家自然科學基金項目（ 31372050）；山東農業(yè)大學科技創(chuàng)新團隊設施園藝優(yōu)勢團隊項目（ SYL2017YSTD07）  * 通信作者  Author for correspondence（ E-mail： luckypipi163.com； gaodongsheng01163.com； Tel： 0538-8249659）  桃 ABA 8羥化酶基因 PpeCYP707As在擬南芥中過表達的功能分析  高真真，徐功勛，王東嶺，劉  利，陳修德，李  玲，付喜玲*，高東升*（山東農業(yè)大學園藝科學與工程學院，作物生物學國家重點實驗室，山東泰安  271018）  摘  要：以 8 年生中油 4 號油桃為試材，對休眠期的枝條進行 ABA 和 GA 處理發(fā)現(xiàn)， ABA 延遲芽體萌動， GA 促進萌芽和提前開花，在桃芽萌發(fā)中 ABA 和 GA 起拮抗作用。利用轉基因技術在擬南芥中過表達桃 ABA 分解代謝關鍵酶 ABA 8羥化酶基因 PpeCYP707A1、 PpeCYP707A2 和 PpeCYP707A3，獲得純合株系， RT-PCR 結果表明，目的基因在過表達株系中的表達量分別達到對照的 23.86 倍、 7.37 倍、3.23 倍；過表達株系生長緩慢，抽薹、開花延遲，其中過表達 PPECYP707A1 株系生長最慢，開花最晚；過表達株系種子萌發(fā)和幼苗生長對 ABA 不敏感，受傷害程度?。?10 低溫處理試驗證明，過表達株系相對生長速率高于野生型，推測低溫條件下，過表達 CYP707As 正調控擬南芥的生長發(fā)育。  關鍵詞：桃；擬南芥； CYP707A； ABA；過表達；功能分析  中圖分類號： S 662.1       文獻標志碼： A        文章編號： 0513-353X（ 2018） 02-0239-11 Functional Analysis of Peach PpeCYP707As Gene in Arabidopsis thaliana Overexpressing Plants GAO Zhenzhen， XU Gongxun， WANG Dongling， LIU Li， CHEN Xiude， LI Ling， FU Xiling*， and GAO Dongsheng*（ College of Horticulture Science and Engineering， Shandong Agricultural University， State Key Laboratory of Crop Biology， Taian， Shandong 271018， China）  Abstract： We used eight-year-old Zhongyoutao 4 nectarine as the material and then treated dormant peach branches with hormone. The results showed that ABA delayed bud germination， GA promoted germination and precocious flowering， ABA and GA had the adverse effect on the germination of peach buds. We obtained at least 3 homozygous lines with overexpression of ABA 8-hydroxylase gene which were key enzyme in ABA catabolism in peach such as PpeCYP707A1， PpeCYP707A2， PpeCYP707A3 in Arabidopsis thaliana by transgenic technique. The results of RT-PCR showed that the expression of target gene in overexpression lines reached 23.86 times， 7.37 times and 3.23 times， respectively. The Arabidopsis of overexpression lines showed slow growth， delayed bolting even flowering， which PPECYP707A1 slowest growth and flowering the latest. Relative conductivity and active oxygen analysis showed that seed germination and seedling growth of transgenic Arabidopsis were not sensitive to ABA and the damage Gao Zhenzhen， Xu Gongxun， Wang Dongling， Liu Li， Chen Xiude， Li Ling， Fu Xiling， Gao Dongsheng. Functional analysis of peach PpeCYP707As gene in Arabidopsis thaliana overexpressing plants. 240                                                                        Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (2)： 239 249. degree was lower compared to wild type. Low temperature（ 10 ） treatment results showed that the relative growth rate of transgenic Arabidopsis with overexpressing PpeCYP707As was higher than that of wild type. It is speculated that the overexpression of CYP707As gene may positively regulate the growth and development of Arabidopsis under low temperature condition. Keywords： peach； Arabidopsis thaliana； CYP707A； ABA； overexpression； functional analysis 休眠是果樹在應對外界不良環(huán)境時產生的一種自我保護機制，表現(xiàn)為分生組織可見的暫時停長（ Rohde & Bhalerao， 2007）。自然休眠由休眠結構（比如芽、種子）內部的生理因素控制，只有經歷低溫滿足其需冷量之后芽才能萌發(fā)，進而開花結果，所以自然休眠是設施果樹熟期調控的限制因子，研究調控休眠維持及休眠解除的因素及其分子機制意義重大。  影響自然休眠的環(huán)境因素主要有光周期、低溫和激素等。脫落酸（ ABA）是植物重要的逆境激素，一方面參與植物對低溫、干旱、高鹽等脅迫的應答（ Leng et al.， 2014），同時參與調控葉片脫落、胚胎發(fā)育、種子的休眠與萌發(fā)等過程（ Lechat et al.， 2012）。近年來的研究證明， ABA 在休眠（芽休眠和種子休眠）及休眠解除中發(fā)揮重要作用， ABA 能夠誘導芽休眠并抑制萌發(fā)。在油桃（ Wang et al.， 2016）花芽休眠誘導期 ABA 含量逐漸升高，隨著休眠解除 ABA 含量逐漸降低。楊樹（ Rohde et al.， 2002）頂芽休眠解除過程中 ABA 含量也逐漸降低。也有證據(jù)表明赤霉素（ GA）可以解除種子休眠促進萌發(fā)（ Huang et al.， 2016），并在櫻桃（ Duan et al.， 2004）芽休眠解除上得到證實。研究發(fā)現(xiàn)在唐菖蒲球莖（ Wu et al.， 2015）休眠解除過程中 ABA 含量逐漸降低， GA 含量逐漸升高，ABA/GA 逐漸降低。  ABA 合成、分解的動態(tài)變化共同調控植物內源 ABA 水平，在芽休眠進程中 ABA 含量的變化反映了 ABA 合成與分解的關系，在芽解除休眠的過程中 ABA 的分解代謝起主導作用（ Zheng et al.，2015）。在不同物種中， ABA 分解的主要途徑是轉變?yōu)闊o活性的紅花菜豆酸（ Phaseic acid， PA）和二氫紅花菜豆酸（ Dihydro-phaseic acid， DPA），這一過程是解除休眠的關鍵（ Saito et al.， 2004）。研究證實 ABA 8羥化酶催化 ABA 轉變?yōu)?PA（ Nambara & Marion-Poll， 2005），而 AtCYP707A 是擬南芥 ABA 8羥化酶的編碼基因。生化分析表明，在體外 CYP707A 蛋白能將 ABA 轉化成 PA（ Nambara & Marion-Poll， 2005）。擬南芥 AtCYP707A 家族基因有 4 個成員，其中 AtCYP707A2 被認為是在種子吸脹時分解 ABA 的關鍵基因，在吸脹 6 h 后該基因轉錄水平開始增加， ABA 含量降低，相應地 PA 含量升高（ Tetsuo et al.， 2004）。這一結論在大麥（ Millar et al.， 2006）中得到驗證。在擬南芥 AtCYP707A2 突變體中，其發(fā)芽率（ 10%）明顯低于野生型（ 70%）， ABA 含量高達野生型的6 倍，種子若不經低溫處理，需要更長的時間來打破休眠（ Millar et al.， 2006）。  目前已在水稻（ Seung & Dongsu， 2006）、蠶豆（ Yang & Zeevaart， 2006）、馬鈴薯（ Destefanobeltrán et al.， 2006）、大麥（ Millar et al.， 2006）中克隆到 CYP707A 的同源基因。對于 CYP707A 的研究主要在逆境脅迫、植物脫水、再水合作用、種子休眠上（ Benech-Arnold et al.， 2013）。但 CYP707A 參與花芽休眠調控的設想還未得到證實。在桃中，利用 SSH 技術篩選的調控芽休眠的基因也參與種子休眠，揭示芽休眠與種子休眠可能存在共同的調控機制（ Leida et al.， 2012）。 CYP707A 在休眠中的作用機制尚不明確。  本實驗室前期對桃 CYP707As 基因進行了生物信息學分析、組織特異性表達、激素誘導、原核表達誘導蛋白等一系列研究，發(fā)現(xiàn)桃 CYP707A2 與擬南芥 CYP707A2 親緣關系最近， CYP707As 基因在成熟組織中表達量比幼嫩組織高，且 CYP707A2 能被 ABA、 GA 誘導上調（ Wang et al.， 2016）。高真真，徐功勛，王東嶺，劉   利，陳修德，李   玲，付喜玲，高東升 . 桃 ABA 8羥化酶基因 PpeCYP707As 在擬南芥中過表達的功能分析 . 園藝學報， 2018， 45 (2)： 239 249.                                                                                       241 本研究中以 ABA 介導芽休眠與種子休眠為切入點，從桃中克隆了 3 個 CYP707As 基因，轉化擬南芥進行表達分析及表型鑒定，并研究 ABA 對種子和幼苗、低溫對幼苗等的影響，旨在揭示桃 CYP707A家族基因在休眠中與 ABA 的關系，為進一步研究其在休眠解除中的作用奠定基礎。  1  材料與方法  1.1  桃樹材料及處理試驗材料為栽種于山東農業(yè)大學南校區(qū)試驗基地的 8 年生油桃（ Prunus persica var. nectariana）中油 4 號生長健壯、長勢一致的 9 株樹，選取生長良好的一年生枝條 90 個，分為 3 組，即 3個處理，每個處理 30 枝，分為 3 個重復， 1 個重復 10 枝。分別用 3 種處理溶液噴施枝條表面：（ 1）對照，清水  + 0.5% Trtion 100；（ 2） ABA 處理， 1 mmol · L-1 ABA + 0.5% Trtion 100；（ 3） GA 處理，1 mmol · L-1GA3 + 0.5% Trtion 100。于 2016 年 12 月 10 日起每 7 d 噴 1 次，共 3 次。選擇傍晚進行，噴施后套黑色塑料袋。 ABA、 GA 購自索萊寶公司。  擬南芥幼苗在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，晝 22 /夜 20 ，光照 12 h。  ABA 處理擬南芥種子和幼苗：將擬南芥種子消毒后種在分別含有 3 和 5 mol · L-1ABA 的 MS培養(yǎng)基上，觀察種子的萌發(fā)情況。選取生長 14 d 的擬南芥幼苗用 1 mmol · L-1 ABA + 0.5% Trtion 100溶液噴施灌溉，用黑色塑料袋罩住防止 ABA 見光分解，處理 3 d 后，選取野生型及轉基因擬南芥葉片，稱取 3 份，每份 1 g，用于相對電導率測定，選取野生型及轉基因擬南芥葉片各 10 片，用于活性氧分子測定。  低溫處理擬南芥幼苗：選取生長 28 d 的野生型和轉基因擬南芥后代幼苗，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度為 10 （模擬進入休眠誘導的秋季溫度）處理 10 d，用于相對生長速率測定。   1.2  PpeCYP707As 轉化擬南芥    轉基因所用材料為本實驗室保存的哥倫比亞野生型（ Columbia 型）擬南芥種子。利用 Thermo公司的 Phusion 高保真酶對 PpeCYP707A1、 PpeCYP707A2 和 PpeCYP707A3 這 3 個基因進行 PCR 擴增（引物見表 1）。利用 TaKaRa 公司的 PMD-19simple 載體進行連接反應，轉化大腸桿菌 DH5 感受態(tài)細胞。選擇測序正確的克隆，提取細菌中的質粒 DNA，根據(jù)預先設計的酶切位點（ PpeCYP707A1：BamH和 Sal； PpeCYP707A2： Xba和 Sac； PpeCYP707A3： BamH和 Sac）分別雙酶切pMD19-simple 及 PBI121 載體序列。分離酶切片段，回收目的基因和載體，利用 T4連接酶連接目的基因與 PBI121 載體，成功構建 PBI121-PpeCYP707A1、 PBI121-PpeCYP707A2、 PBI121-PpeCYP707A3 表達載體。  將分別含有 3 個基因正義表達載體的農桿菌菌液用花序侵染法侵染野生型擬南芥，將收獲的種子用  50 mg · L-1的卡那霉素（ Kan）進行篩選。選擇那些能夠正常生長且沒有黃化的幼苗，利用 PCR及 RT-PCR 檢測篩選陽性植株。并選擇在擬南芥中目的基因表達量高的植株作為候選植株 T1 代， T2代種子開始出現(xiàn)分離。選擇 T3 代不出現(xiàn)分離的種子即為純合株系，依次命名為 35S： PPECYP707A1、35S： PPECYP707A2、 35S： PPECYP707A3。最終獲得至少  3 株純合株系，并觀察表型，記錄結果。  1.3  總 RNA 的提取和 RT-PCR 將擬南芥種子消毒后播種在 MS 培養(yǎng)基上，選取生長 14 d 的擬南芥幼苗，整株取樣后立即放入Gao Zhenzhen， Xu Gongxun， Wang Dongling， Liu Li， Chen Xiude， Li Ling， Fu Xiling， Gao Dongsheng. Functional analysis of peach PpeCYP707As gene in Arabidopsis thaliana overexpressing plants. 242                                                                        Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (2)： 239 249. 液氮冷凍，用于 RT-PCR 檢測。擬南芥幼苗整株取樣，稱取 3 g，分為 3 份，每份 1 g 作為 1 次生物學重復。液氮研磨后采用 TIANGEN（天根）試劑盒提取總 RNA，用反轉錄試劑盒 PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（ Perfect Real Time， TaKaRa）進行反轉錄獲得 cDNA，采用軟件DNAMAN 設計熒光定量特異性引物（表 1），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。采用 SYBR®Premix Ex TaqTM（ Tli RNaseH Pls）試劑盒（寶生物）進行熒光定量 PCR 反應。反應體系為： SYBR®Premix Ex Taq（ 2×） 12.5 L，正、反向引物各 1 L， cDNA 1 L，加去離子水至 25 L。試驗設計 3 次技術性重復。熒光定量 PCR 反應條件為： 95 預變性 30 s， 95 變性 5 s， 60 退火30 s， 35 40 次循環(huán)，反應結束后得到熒光值變化曲線和熔解曲線，最終采用 2-Ct法進行數(shù)據(jù)分析。   表 1  克隆基因和 RT-PCR 所用引物  Table 1  Primers used for quantitative RT-PCR analysis and cloning genes 桃基因名稱  Nectarine gene name 引物序列（ 5 3）  Primer sequence 用途   Use CYP707A1 F： CACGGATCCATGGAAATCAGCAGTATTTTATACTCCATGC 克隆基因 Clone R： GCCGTCGACTTATGTTTTAGGAGATAATCTGATGGGC  CYP707A2 F： CGCGGATCCATGCAACTTTTCTGCTCATCATTACTAACAC  GTCGAGCTCTCAACTCACAATCTTGCTCCTTGGG  CYP707A3 F： CGCGCTCTAGAATGGAGATTGTTTCTAGTTTGATACACATATTGC  R： CACGAGCTCTTATTCTTCCCAAAATCTGACTGGTAATCC  CYP707A1 F： ACAGACCAACAGATTGCTGACAAC 熒光定量 qRT-PCR ： CCTTCATCATCACCCTCCTCTTCTT CYP707A2 F： TCGGCAACAATAGGGACTTTGAAATG R： CCATCACTCTTCCTTCTCTTCGCTAT CYP707A3 F： TCACCAAGGAGACTACCACAATAGC ： CAAGGAAGCCAACATCAAAGGAGAAC actin F： GTTATTCTTCATCGGCGTCTTCG R： CTTCACCATTCCAGTTCCATTGTC 1.4  相對電導率的測定  將擬南芥葉片用自來水沖洗后再用蒸餾水沖洗干凈，用濾紙吸凈表面水分，放入裝有 10 mL 去離子水的試管中，真空抽氣 20 min 直至葉片完全沉入水底，室溫放置 1 h 并搖勻，用電導儀測定浸提液電導率（ R1），然后沸水浴加熱 10 min，冷卻至室溫后搖勻，再次測定浸提液電導率（ R2），相對電導率（ %） = R1/R2，試驗設置 3 個重復，取平均值。  1.5  活性氧分子的測定  將擬南芥葉片用蒸餾水沖洗干凈，置于試管中，加 10 mL 氮藍四唑（ NBT）染色溶液，用鋁箔紙包裹試管，在室溫下保持過夜。從試管中排出染色溶液，去除葉綠素以正確觀察染色。將葉片浸沒在無水乙醇中并在沸水浴中加熱 10 min，用 60%甘油飽和的紙巾轉移葉片， NBT 與內源性活性氧分子反應顯現(xiàn)藍色，觀察染色葉片并拍照。  高真真，徐功勛，王東嶺，劉   利，陳修德，李   玲，付喜玲，高東升 . 桃 ABA 8羥化酶基因 PpeCYP707As 在擬南芥中過表達的功能分析 . 園藝學報， 2018， 45 (2)： 239 249.                                                                                       243 1.6  相對生長速率的測定  選取擬南芥幼苗進行低溫（ 10 ）處理，處理前測量從地表到植株生長點的高度作為株高（ W1）。處理 10 d 后再次測量株高（ W2），計算相對生長速率（ RGR）。設置 3 個重復，取平均值。 RGR = （ lnW1 lnW2） /（ t1 t2），式中， t1、 t2分別為兩次株高測定的時間， W1、 W2分別為 t1和 t2時的株高， ln 為自然對數(shù)。  2  結果與分析  2.1  ABA 和 GA 處理的桃芽萌發(fā)情況  用 ABA 和 GA 處理休眠期桃枝條。從圖 1 中可以看出，處理 10 d 后對照（清水）芽體開始微微萌動， ABA 處理的芽體最小，無萌動跡象，而 GA 處理的芽體最飽滿，已形成小花苞；處理 15 d后對照形成花苞且花蕊（雌蕊和雄蕊）伸出花瓣，而此時 ABA 處理的芽體才剛剛萌動形成小花苞，GA 處理的已全部開花。由此可知， GA 處理能夠明顯促進桃芽萌發(fā)，而 ABA 則明顯抑制桃芽萌發(fā)，在桃芽萌發(fā)上 GA 與 ABA 起到拮抗作用。  圖 1  ABA 和 GA 處理對桃芽萌發(fā)的影響  Fig. 1  Effects of ABA and GA treatments on peach for bud germination 2.2  轉基因擬南芥的 RT-PCR 鑒定  本試驗中共獲得 4 個 35S： PPECYP707A1、 7 個 35S： PPECYP707A2、 6 個 35S： PPECYP707A3擬南芥過量表達株系。從每個轉基因后代群體均挑選 3 個株系，作為 3 個重復，并進行后續(xù)的功能分析。以轉基因 T3 代純合植株為材料，提取 RNA 進行 RT-PCR，在 3 個目的基因的過表達株系中PpeCYP707A1、 PpeCYP707A2、 PpeCYP707A3 的表達量分別達到了對照的 23.86 倍、 7.37 倍、 3.23倍（圖 2），表明 3 個目的基因都得到了有效的過表達。  Gao Zhenzhen， Xu Gongxun， Wang Dongling， Liu Li， Chen Xiude， Li Ling， Fu Xiling， Gao Dongsheng. Functional analysis of peach PpeCYP707As gene in Arabidopsis thaliana overexpressing plants. 244                                                                        Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (2)： 239 249. 圖 2  PpeCYP707As 在野生型（ WT）和 35S： PPECYP707A1、 35S： PPECYP707A2、 35S： PPECYP707A3 株系中的表達分析  Fig. 2  Expression analysis of PpeCYP707As in wild type（ WT） and 35S： PPECYP707A1，  35S： PPECYP707A2， 35S： PPECYP707A3 lines 2.3  轉基因擬南芥的表型    選擇 T3 代不出現(xiàn)分離比的種子播種，觀察幼苗表型。從圖 3 可以明顯看出，與野生型相比，轉基因擬南芥 35S： PPECYP707A1、 35S： PPECYP707A2、 35S： PPECYP707A3 生長緩慢，長勢較弱，其中 35S： PPECYP707A1 生長最弱，且葉片橢圓，葉片數(shù) 9 12，而 28 d 的野生型生長旺盛，葉片數(shù) 18 21，葉面積明顯較大，葉片狹長。野生型 32 d 時主莖上已長出白色花苞，而轉基因株系均未抽薹。  圖 3  野生型和轉基因擬南芥后代的表型  Fig. 3  The phenotype of wild type and transgenic Arabidopsis  2.4  轉基因擬南芥種子對 ABA 的敏感性  將轉基因擬南芥 T3 代種子分別種在含有 3 mol · L-1ABA 和 5 mol · L-1ABA 的 MS + Kan 培養(yǎng)基上，野生型種在含有 3 mol · L-1ABA 和 5 mol · L-1ABA 的 MS 培養(yǎng)基上，檢測擬南芥種子對 ABA 的敏感性。在 3 mol · L-1ABA 處理（圖 4， a）中，野生型沒有萌發(fā)，而轉基因株系高真真，徐功勛，王東嶺，劉   利，陳修德，李   玲，付喜玲，高東升 . 桃 ABA 8羥化酶基因 PpeCYP707As 在擬南芥中過表達的功能分析 . 園藝學報， 2018， 45 (2)： 239 249.                                                                                       245 35S： PPECYP707A1、 35S： PPECYP707A2、 35S： PPECYP707A3 的萌發(fā)率均在 85%以上，說明其對 3 mol · L-1ABA 不敏感而野生型對 3 mol · L-1ABA 極其敏感；在 5 mol · L-1ABA 處理（圖 4，b）中，野生型依然沒有萌發(fā)，而轉基因株系分別萌發(fā)了 5 粒、 3 粒、 7 粒，萌發(fā)率降低至 10%以下，說明其對高濃度 ABA 敏感。  圖 4  野生型和轉基因擬南芥種子對 ABA 的敏感性  Fig. 4  Sensitivity to ABA of wild type and transgenic Arabidopsis seeds 2.5  ABA 處理下轉基因擬南芥的電導率、活性氧分子測定  擬南芥幼苗經 1 mmol · L-1 ABA 處理 3 d 后（圖 5），野生型植株莖基部的葉片已經變黃萎蔫，而 3 個轉基因株系植株葉片全部呈現(xiàn)綠色，沒有受到 1 mmol · L-1ABA 的傷害。  圖 5  1 mmol · L-1ABA 處理 3 d 的野生型和 35S： PPECYP707A1、 35S： PPECYP707A2、 35S： PPECYP707A3 植株和葉片生長情況  Fig. 5  The wild type and 35S： PPECYP707A1， 35S： PPECYP707A2， 35S： PPECYP707A3 plant and leaf growth  under 1 mmol · L-1 ABA treatment for 3 days Gao Zhenzhen， Xu Gongxun， Wang Dongling， Liu Li， Chen Xiude， Li Ling， Fu Xiling， Gao Dongsheng. Functional analysis of peach PpeCYP707As gene in Arabidopsis thaliana overexpressing plants. 246                                                                        Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (2)： 239 249. 表 2  在 1 mmol · L-1ABA 處理下野生型和轉基因  擬南芥的電導率  Table 2  Conductivity of wild type and transgenic Arabidopsis thaliana under 1 mmol · L-1 ABA treatment 材料 Material 相對電導率 Relative conductivity 野生型  Wild type 0.76 a 35S： PPECYP707A1 0.40 bc 35S： PPECYP707A2 0.32 c 35S： PPECYP707A3 0.49 b 選取 1 mmol · L-1 ABA 處理 3 d 的野生型及轉基因擬南芥葉片，測定其相對電導率如表2 所示，與野生型（ 0.76 ）相比， 35S: PPECYP707A1 （ 0.40 ）、 35S:PPECYP707A2（ 0.32）、 35S:PPECYP707A3（ 0.49）的相對電導率均明顯降低，且差異顯著，表明轉基因植株葉片受傷害程度明顯減輕，能抵抗 1 mmol · L-1 ABA 的傷害。  選取經 1 mmol · L-1 ABA 處理 3 d 的野生型及轉基因擬南芥葉片，用  NBT 溶液染色后檢測植株內活性氧分子積累情況如圖 6 所示，有活性氧積累的部位已被染成藍色，證明在 ABA 處理下葉片細胞受到傷害，而染色深淺和面積大小反映了受害程度的大小。野生型的葉柄、葉緣及葉面均有被染成藍色的部分，而轉基因植株 35S:PPECYP707A1、 35S:PPECYP707A2、 35S:PPECYP707A3 只有少量的葉片葉柄或葉緣有斑點狀藍色痕跡，與葉片的相對電導率的數(shù)據(jù)結果一致，均能反映轉基因植株的葉片受傷害程度比野生型小。  圖 6  1 mmol · L-1ABA 處理下野生型和轉基因擬南芥經 NBT 溶液染色情況  Fig. 6  The staining result of wild type and transgenic Arabidopsis thaliana by NBT solution under 1 mmol · L-1 ABA treatment 2.6  低溫處理對轉基因擬南芥的影響  擬南芥幼苗經低溫處理 10 d 后的表型如圖 7 所示，轉基因株系 35S:PPECYP707A1、 35S: 圖 7  低溫（ 10 ）處理下野生型和轉基因擬南芥的表型  Fig. 7  The phenotype of wild type and transgenic Arabidopsis at low temperature（ 10 ）  高真真，徐功勛，王東嶺，劉   利，陳修德，李   玲，付喜玲，高東升 . 桃 ABA 8羥化酶基因 PpeCYP707As 在擬南芥中過表達的功能分析 . 園藝學報， 2018， 45 (2)： 239 249.                                                                                       247 表 3  低溫（ 10 ）處理下野生型和轉基因擬南芥的  相對生長速率  Table 3  Relative growth rate of wide type and transgenic Arabidopsis at low temperature（ 10 ）  材料   Material 相對生長速率  Relative growth rate 野生型  Wild type 0.009 35S:PPECYP707A1 0.020 35S:PPECYP707A2 0.030 35S:PPECYP707A3 0.021 PPECYP707A2 、 35S:PPECYP707A3 的長勢均不如野生型旺盛，株高均低于野生型。35S:PPECYP707A1 株高最低；就節(jié)間距而言，低溫處理后野生型、 35S:PPECYP707A2 、35S:PPECYP707A3 的節(jié)間距與未經低溫處理的野生型相比明顯縮短（由于 35S:PPECYP707A1 節(jié)間距縮短，株高僅為 1 cm 左右，所以未進行比較），同時這也是生長緩慢的直接表現(xiàn)。其中野生型低溫處理前后的節(jié)間距變化差異最明顯；與植株長勢、株高等結果完全不同的是， 35S: PPECYP707A1 （ 0.020）、 35S:PPECYP707A2（ 0.030）、 35S:PPECYP707A3（ 0.021）的相對生長速率均比野生型（ 0.009 ）高，其中35S:PPECYP707A2 為野生型的 3.3 倍之多（表3），表明在低溫條件下， 3 個轉基因植株株系均比野生型生長速度快。   3  討論  在番茄中過表達 SlCYP707A1 后植株長勢較弱、矮小，葉表面積小，葉片卷曲，且 ABA 含量降低（ Nitsch et al.， 2009）。本研究中擬南芥過表達株系 35S:PPECYP707A1、 35S:PPECYP707A2、35S:PPECYP707A3 均表現(xiàn)植株矮小，葉表面積小，并且抽薹、開花延遲，其中 35S:PPECYP707A2開花（ 56 d）時間比野生型（ 32 d）植株晚 24 d。  研究證實擬南芥中 CYP707A1 主要在種子成熟中期至成熟期表達，是種子發(fā)育期控制 ABA 分解的主效基因， CYP707A2 在種子晚熟期至發(fā)芽期間表達，干燥種子得以解除休眠，而 CYP707A1和 CYP707A3 均參與了種子萌發(fā)后芽的生長（ Masanori et al.， 2006）。另一研究結果顯示，在擬南芥中過表達大豆 GmCYP707A1 可降低對 ABA 的敏感性，起到 ABA 8羥化酶的功能（ Zheng et al.，2012）。而本研究中對種子萌發(fā)試驗的結果表明，在室溫下經過后熟（即休眠解除）的擬南芥種子，在 3 和 5 mol · L-1ABA 處理下，野生型種子萌發(fā)率均表現(xiàn)為 0，對 ABA 表現(xiàn)極其敏感，證明 ABA能有效維持種子休眠，而過表達株系 35S:PPECYP707A1、 35S:PPECYP707A2、 35S:PPECYP707A3的種子在 3 mol · L-1ABA 處理下萌芽率均超過 85%，而在 5 mol · L-1ABA 處理下萌發(fā)率顯著降低到 10 %以下，表明 3 mol · L-1ABA 對過表達株系種子幾乎無影響，而 5 mol · L-1ABA 才能降低萌發(fā)率，使種子對其高度敏感。總之，與野生型種子相比，過表達株系種子能有效抵抗低濃度 ABA處理，提高種子萌發(fā)率，說明在擬南芥種子中過表達桃 PPECYP707As</p>

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