黃皮轉(zhuǎn)錄組SSR挖掘及其可用性分析.pdf
<p>園藝學(xué)報， 2018， 45 (1)： 149 158. Acta Horticulturae Sinica doi： 10.16420/j.issn.0513-353x.2017-0342； http： /www. ahs. ac. cn 149 收稿日期 ： 2017 09 04； 修回日期 ： 2017 12 27 基金項(xiàng)目 ： 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ 31501729） ；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（ 2015A030302041， 2016B020201004） ；廣東省優(yōu)稀水果產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目（ 2017LM1071） ；農(nóng)業(yè)部熱帶作物種質(zhì)資源保護(hù)項(xiàng)目（ 16RZZY-20） ；廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院院長基金項(xiàng)目（ 201605） * 通信作者 Author for correspondence（ E-mail： lzxf200126.com； panjianping_2003163.com） 黃皮轉(zhuǎn)錄組 SSR 挖掘及其可用性分析 陸育生，陳 喆，常曉曉，邱繼水，林志雄*，潘建平*（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所，農(nóng)業(yè)部南亞熱帶果樹生物學(xué)及遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省熱帶亞熱帶果樹研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640） 摘 要： 利用 MISA 軟件篩選黃皮（ Clausena lansium）轉(zhuǎn)錄組測序獲得的 68 998 條 Unigene，共檢測出單核苷酸至六核苷酸重復(fù)類型的 SSR位點(diǎn) 11 825 個， 分布于 11 000 條 Unigene中， 出現(xiàn)頻率為 17.14%，平均分布距離為 4.41 kb。 6 種 SSR 位點(diǎn)類型中主要為單、二、三個核苷酸重復(fù)，分別占總 SSR 位點(diǎn)的41.48%、 24.92%和 27.53%。 11 825 個 SSR 位點(diǎn)中共發(fā)現(xiàn) 207 種重復(fù)基序，重復(fù)次數(shù)在 4 24 次之間，其中出現(xiàn)頻率高的基序有 A/T、 AG/CT、 AT/AT、 AAG/CTT 和 AAT/ATT。位點(diǎn)序列長度分布在 12 25 bp之間，其中 12 15 bp 最多，占 50.95%（ 6 025 個 SSR 位點(diǎn)） 。通過 Primer 3 設(shè)計(jì)得到 6 102 對 SSR 引物，隨機(jī)選擇 30 對引物進(jìn)行多態(tài)性驗(yàn)證分析，結(jié)果顯示 24 對有效擴(kuò)增引物中， 13 對引物在 16 份不同黃皮種質(zhì)中表現(xiàn)出多態(tài)性。以上結(jié)果表明，黃皮轉(zhuǎn)錄組測序產(chǎn)生的 Unigene 信息可作為開發(fā) SSR 標(biāo)記的有效來源，開發(fā)的大批量 SSR 標(biāo)記可為黃皮種質(zhì)資源遺傳多樣性分析和遺傳圖譜構(gòu)建提供更加豐富可靠的標(biāo)記選擇。 關(guān)鍵詞： 黃皮；轉(zhuǎn)錄組； SSR；可用性分析 中圖分類號： S 667.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號： 0513-353X（ 2018） 01-0149-10 Excavation and Usablility Analysis of SSR from Transcriptome of Clausena lansium LU Yusheng， CHEN Zhe， CHANG Xiaoxiao， QIU Jishui， LIN Zhixiong*， and PAN Jianping*（ Institution of Fruit Tree Research， Guangdong Academy of Agricultural Sciences， Key Laboratory of South Subtropical Fruit Biology and Resource Utilization， Ministry of Agriculture， Guangdong Provincial Key Laboratory of Tropical and Subtropical Fruit Tree Research， Guangzhou 510640， China） Abstract： In this study， a total of 68 998 Unigenes from transcriptome of Clausena lansium were used for screening of SSR loci using MISA software. 11 825 SSRs， including the types of 1 6 nucleotide repeats distributed in 11 000 Unigenes were identified， with occurring frequency of 17.14% and mean distance of 4.41 kb. The major types of SSR loci were 1 3 nucleotide repeats， accounting for 93.93% of the SSR loci， of which mono-， di- and tri- nucleotide repeats were 41.48%， 24.92% and 27.53%，respectively. Two hundred and seven repeat motifs with iteration numbers from 4 to 24 were discovered from the 11 825 SSR loci， and the most abundant motif were A/T， AG/CT， AT/AT， AAG/CTT and Lu Yusheng， Chen Zhe， Chang Xiaoxiao， Qiu Jishui， Lin Zhixiong， Pan Jianping Excavation and usablility analysis of ssr from transcriptome of Clausena lansium. 150 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (1)： 149 158. AAT/ATT. The lengths of repeat nucleotide sequences for all SSR loci ranged from 12 to 25 bp， with most from 12 to 15 bp， accounting for 50.95% of all SSR loci. A total of 6 102 SSR primers were designed and 30 primers were selected randomly for PCR amplification tests， of which 24 primers amplified effective and 13 primers showed polymorphism in sixteen different wampee germplasm. The results indicated that the Unigenes generated from trasncriptome sequencing in C. lansium could be used as an effective source to develop SSR markers. The large quantities of SSR markers will provide reliable markers for map structure， genetic polymorphism analysis for wampee germplasm resource. Keywords： Clausena lansium； transcriptome； SSR； usability analysis 中國是黃皮（ Clausena lansium）的原產(chǎn)地，黃皮種質(zhì)資源豐富。開展黃皮遺傳多樣性研究，全面梳理和揭示其種質(zhì)資源的親緣進(jìn)化關(guān)系，可為其進(jìn)一步收集保存提供借鑒，并為新種質(zhì)的創(chuàng)制提供基本數(shù)據(jù)，提高育種效率，具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。 DNA 分子標(biāo)記是鑒定種質(zhì)資源遺傳多樣性的重要手段，但目前在黃皮上的運(yùn)用局限于 RAPD（劉小梅 等， 2007；蔣素梅 等， 2008）和 ISSR（李開拓 等， 2009）等通用的分子標(biāo)記技術(shù)。 SSR（ simple sequence repeat）即簡單重復(fù)序列，又稱微衛(wèi)星 DNA（ microsatellites） ，是由 1 6 個核苷酸為重復(fù)單位組成的串聯(lián)重復(fù)序列。作為第二代分子標(biāo)記的代表， SSR 分子標(biāo)記具有技術(shù)簡便、穩(wěn)定性高、共顯性、多等位性等特點(diǎn)，且數(shù)量豐富，幾乎覆蓋整個基因組，已被廣泛用于遺傳多樣性研究、品種鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建及 QTL 定位。傳統(tǒng)的 SSR（ genomic-SSR）引物的開發(fā)通常需要經(jīng)過基因組文庫構(gòu)建、探針雜交、克隆、測序等繁瑣步驟，不僅耗時耗力，成本高，效率低，而且還存在同位素污染等問題。近年來，隨著新一代測序技術(shù)的飛速發(fā)展，大量增長的轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)為 SSR分子標(biāo)記（ EST-SSR）的開發(fā)提供了新的途徑。 EST-SSR 標(biāo)記不僅具有傳統(tǒng) SSR 標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)，且開發(fā)廉價、高效；更為重要的是其來源于基因組的轉(zhuǎn)錄區(qū)域，是一種有功能的分子標(biāo)記，可為基因提供“絕對”的標(biāo)記（ Keyser et al.， 2009） 。目前，基于轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā) EST-SSR 標(biāo)記已在砂梨（ Yue et al.， 2014） 、刺梨（鄢秀芹 等， 2015） 、中國櫻桃（宗宇 等， 2016） 、枇杷（鄭婷婷 等， 2015） 、杧果（羅純 等， 2015） 、藍(lán)靛果忍冬（張慶田 等， 2016） 、李（方智振 等， 2016）等多種果樹中均有報道。 利用前期黃皮轉(zhuǎn)錄組測序（ RNA-Seq）所獲得的數(shù)據(jù)，運(yùn)用生物信息學(xué)方法進(jìn)行大規(guī)模 SSR 標(biāo)記挖掘，分析其分布規(guī)律、組成特征，并對其可用性進(jìn)行初步評價，以期為利用 SSR 標(biāo)記進(jìn)行黃皮種質(zhì)資源多樣性、品種鑒定及親緣關(guān)系研究等奠定基礎(chǔ)。 1 材料與方法 1.1 植物材料及 DNA 提取 用于引物篩選和可用性評價的材料為農(nóng)業(yè)部廣州黃皮種質(zhì)資源圃（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所）中保存的中國各產(chǎn)區(qū)的 16 份黃皮種質(zhì)，其中 9 份來源于廣東， 4 份來源于廣西， 2 份來源于海南， 1 份來源于福建（表 1） 。 于 2016 年 4 月每份種質(zhì)取健康幼嫩葉片，采用天根生化科技有限公司植物基因組 DNA 提取試劑盒提取基因組 DNA， 20 保存?zhèn)溆谩? 陸育生，陳 喆，常曉曉，邱繼水，林志雄，潘建平 . 黃皮轉(zhuǎn)錄組 SSR 挖掘及其可用性分析 . 園藝學(xué)報， 2018， 45 (1)： 149 158. 151 表 1 黃皮材料 Table 1 List of wampee 序號 No. 名稱或編號 Name or code 來源 Source 序號No. 名稱或編號 Name or code 來源 Source 1 早豐 Zaofeng 廣州 Guangzhou 9 金豐 Jinfeng 廣州 Guangzhou 2 遲熟甜皮 Chishu Tianpi 廣州 Guangzhou 10 瓊 2 號 Qiong 2 海口 Haikou 3 金球 Jinqiu 廣州 Guangzhou 11 瓊變 1 號 Qiongbian 1 ?？? Haikou 4 郁南無核 Yunan Wuhe 廣東云浮 Yunfu， Guangdong 12 陽山獨(dú)核 Yangshan Duhe 廣東清遠(yuǎn) Qingyuan， Gaugndong 5 廣西圓皮 Guangxi Yuanpi 南寧 Nanning 13 湛江 1 號 Zhanjiang 1 廣東湛江 Zhanjiang， Guangdong 6 廣西冰糖 Guangxi Bingtang 南寧 Nanning 14 興寧 4 號 Xingning 4 廣東梅州 Meizhou， Guangdong 7 金雞心 Jinjixin 廣州 Guangzhou 15 閩 2 號 Min 2 福建廈門 Xiamen， Fujian 8 大豐 1 號 Dafeng 1 廣州 Guangzhou 16 東興 1 號 Dongxing 1 廣西防城港 Fangchenggang， Guangxi1.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源 采集黃皮主栽品種金雞心幼嫩葉片、枝條、花蕾和果實(shí)，提取 RNA 并等量混勻后委托華大基因公司進(jìn)行 RNA-Seq 轉(zhuǎn)錄組測序，采用 Trinity 進(jìn)行 De novo 組裝（ Grabherr et al.， 2011）得到68 998 條 Unigene，作為分析背景數(shù)據(jù)。 1.3 轉(zhuǎn)錄組 SSR 位點(diǎn)鑒別及 SSR 引物設(shè)計(jì) 使用 MISA 軟件（ http： /pgrc.ikp-gatersleben.de/misa.html）對 Unigene 序列進(jìn)行 SSR 位點(diǎn)搜索。搜索標(biāo)準(zhǔn)為：重復(fù)單元長度 1 6 bp，單核苷酸重復(fù)次數(shù)至少 12 次；二核苷酸重復(fù)次數(shù)至少 6 次；三、四核苷酸重復(fù)次數(shù)至少 5 次；五、六核苷酸重復(fù)次數(shù)至少 4 次。 只保留 SSR 重復(fù)單元在 Unigene 上前后序列均不小于 150 bp 的 SSR，采用 Primer 3.0 引物批量設(shè)計(jì)程序進(jìn)行引物設(shè)計(jì)及評價，每條 SSR 產(chǎn)生 5 條引物。引物序列長度 12 25 bp，預(yù)計(jì) PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物在 80 250 bp， GC 含量 40% 65%，退火溫度 55 65 ，上下游引物的退火溫度相差不大于3 ，盡量避免出現(xiàn)發(fā)卡結(jié)構(gòu)、錯配和引物二聚體等。 設(shè)計(jì)好的引物按以下方式進(jìn)行篩選： （ 1）去除所有單核苷酸重復(fù)位點(diǎn)引物； （ 2）引物不能存在SSR； （ 3）引物的 5端允許有 3 個堿基的錯配， 3端允許有 1 個堿基的錯配； （ 4）去掉比對到不同Unigene 上的引物，只保留唯一匹配的引物。 從最終獲得的引物中隨機(jī)挑選 30 對二核苷酸至六核苷酸引物交由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。 1.4 PCR 擴(kuò)增 PCR 反應(yīng)體系為 20 L， 其中包括 2× Dream Taq green PCR master mix（ Thermo scientific） 10 L，10 mol · L-1正、反向引物各 0.5 L， 30 mg · L-1 DNA 模板 1 L， ddH2O 8 L。 PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 預(yù)變性 4 min， 94 變性 30 s，適宜退火溫度（退火溫度因不同引物而異，在 55 60 之間）30 s， 72 延伸 30 s， 35 個循環(huán)；最后 72 延伸 10 min。 擴(kuò)增產(chǎn)物利用 8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠檢測， 160 V 電壓， 90 min，銀染顯色。 Lu Yusheng， Chen Zhe， Chang Xiaoxiao， Qiu Jishui， Lin Zhixiong， Pan Jianping Excavation and usablility analysis of ssr from transcriptome of Clausena lansium. 152 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (1)： 149 158. 2 結(jié)果與分析 2.1 黃皮轉(zhuǎn)錄組中 SSR 位點(diǎn)的數(shù)量及分布特點(diǎn) 利用 MISA 軟件對通過轉(zhuǎn)錄組測序獲得的 68 998 條黃皮 Unigene（序列總長度 52 226 735 bp）進(jìn)行分析查找，發(fā)現(xiàn)含有符合條件的 SSR 的 Unigene 有 11 100 條，發(fā)生頻率（含有 SSR 的 Unigene數(shù) /總 Unigene 數(shù)）為 16.09%。其中， 10 434 條 Unigene 含有單個 SSR 位點(diǎn)，占含有 SSR 序列總條數(shù)的 94%， 含有兩個及以上 SSR 位點(diǎn)的 Unigene 序列有 667 條， 占 6%。 共找到 SSR 位點(diǎn) 11 825 個，分布頻率（檢出的 SSR 位點(diǎn)數(shù) /總 Unigene 數(shù)）為 17.14%，其中平均 4.41 kb 就具有一個 SSR 位點(diǎn)（表 2） 。 黃皮轉(zhuǎn)錄組 SSR 類型豐富，單核苷酸至六核苷酸重復(fù)類型均存在，但不同類型 SSR 的比例差異較大，主要集中在單核、二核和三核苷酸重復(fù)上，占總 SSR 位點(diǎn)數(shù)的 93.93%。單核苷酸重復(fù)類型的數(shù)量最多，為 4 905 個，占總 SSR 位點(diǎn)數(shù)的 41.48%；其次是三核苷酸和二核苷酸重復(fù)類型，分別為 3 277 個和 2 974 個，占總 SSR 位點(diǎn)數(shù)的 27.53%和 24.75%；四、五、六核苷酸重復(fù)類型的數(shù)量很少，總共僅占總 SSR 位點(diǎn)數(shù)的 6.07%。 不同類型 SSR 位點(diǎn)在 Unigene 中的出現(xiàn)頻率與其比例一致，單核苷酸重復(fù)類型分布頻率最高，達(dá) 7.11%；其次為三核苷酸和二核苷酸重復(fù)類型，六核苷酸重復(fù)類型最低。不同 SSR 位點(diǎn)類型在Unigene 中的平均距離則與其分布頻率相反，最大的為六核苷酸重復(fù)類型，平均為 227.07 kb，最小的為單核苷酸重復(fù)類型，為 10.65 kb。 黃皮轉(zhuǎn)錄組中 SSR 位點(diǎn)的序列總長度為 193 180 bp， 位點(diǎn)平均長度 16.34 bp。 不同重復(fù)類型 SSR位點(diǎn)的平均長度各不相同，單核苷酸重復(fù)平均長度為 15.68 bp，二、三、四、五和六核苷酸類型 SSR位點(diǎn)的平均長度分別為 15.42、 16.95、 20.78、 20.49 以及 24.00 bp。 表 2 黃皮轉(zhuǎn)錄組中 SSR 的基本分布情況 Table 2 Distribution of SSR loci in the transcriptome of wampee SSR 類型 SSR type 數(shù)量 Number 比例 % Percentage 出現(xiàn)頻率 % Distribution frequency 平均距離 /kb Average distance 平均長度 /bp Average length 單核苷 Mono-nucleotide 4 905 41.48 7.11 10.65 15.68 二核苷酸 Di-nucleotide 2 974 24.92 4.27 17.72 15.42 三核苷酸 Tri-nucleotide 3 255 27.53 4.72 16.05 16.95 四核苷酸 Tetra-nucleotide 232 1.96 0.34 225.12 20.78 五核苷酸 Penta-nucleotide 256 2.16 0.37 204.01 20.49 六核苷酸 Hexa-nucleotide 230 1.95 0.33 227.07 24.00 總計(jì) Total 11 825 100.00 17.14 4.41 如圖 1 所示，在黃皮轉(zhuǎn)錄組 SSR 位點(diǎn)中，以 5 次重復(fù)次數(shù)最多，達(dá) 1 984 個位點(diǎn)，占總 SSR 位點(diǎn)的 16.78%；其次為 6， 7 和 12 次重復(fù)，位點(diǎn)個數(shù)分別為 1 906， 1 127 和 1 010。統(tǒng)計(jì) 4 12 次重復(fù)的 SSR 位點(diǎn)共有 7 915 個，占總 SSR 位點(diǎn)的 66.93%， 13 24 次重復(fù)的 SSR 位點(diǎn)共有 3 910 個，占 33.07%。 陸育生，陳 喆，常曉曉，邱繼水，林志雄，潘建平 . 黃皮轉(zhuǎn)錄組 SSR 挖掘及其可用性分析 . 園藝學(xué)報， 2018， 45 (1)： 149 158. 153 圖 1 黃皮轉(zhuǎn)錄組中 SSR 重復(fù)次數(shù)分布圖 Fig. 1 Distribution of SSR repeats frequency in wampee transcriptome 2.2 黃皮轉(zhuǎn)錄組中 SSR 基序重復(fù)類型和頻率特征 從黃皮轉(zhuǎn)錄組 SSR 核苷酸基序類型 （表 3） 來看， 11 825 個 SSR 位點(diǎn)共觀察到 207 種重復(fù)基序，其中單、二、三、四、五和六核苷酸重復(fù)各有 2、 4、 10、 26、 53 和 112 種。從 SSR 重復(fù)頻率來看，單核苷酸重復(fù)主要分布在 12 24 次，二核苷酸重復(fù)主要分布在 6 12 次，三核苷酸重復(fù)主要分布 表 3 黃皮轉(zhuǎn)錄組 SSR 基序類型分布 Table 3 The distribution of types of SSR in wampee transcriptome SSR 類型 SSR type 基序類型數(shù) Number of motif type 基序類型 Motif type 出現(xiàn)次數(shù) Number 占總 SSR 重復(fù)基序比例 /% The ratio of total SSR repeat motif 單核苷酸 Mononucleotide 2 A/T 4 826 40.81 C/G 79 0.67 二核苷酸 Dinucleotide 4 AG/CT 1 727 14.60 AT/AT 747 6.32 AC/GT 464 3.92 CG/CG 9 0.08 三核苷酸 Trinucleotide 10 AAG/CTT 810 6.85 AAT/ATT 558 4.72 ATC/ATG 479 4.05 AGC/CTG 416 3.52 ACC/GGT 265 2.24 AAC/GTT 256 2.16 AGG/CCT 227 1.92 CCG/CGG 111 0.94 ACG/CGT 95 0.80 ACT/AGT 38 0.32 四核苷酸 Tetranucleotide 26 AAAG/CTTT 59 0.50 ACTG/AGTC 27 0.23 AAAC/GTTT 24 0.20 AAAT/ATTT 24 0.20 其他 Other 98 0.83 五核苷酸 Pentanucleotide 53 AAAAT/ATTTT 38 0.32 AAAAG/CTTTT 27 0.23 AAAAC/GTTTT 24 0.20 AACTC/AGTTG 12 0.10 其他 Other 155 1.31 六核苷酸 Hexanucleotide 112 ACCATC/ATGGTG 7 0.06 AAAATC/ATTTTG 6 0.05 AAGGAG/CCTTCT 6 0.05 AGCCTG/AGGCTC 6 0.05 其他 Other 205 1.73 Lu Yusheng， Chen Zhe， Chang Xiaoxiao， Qiu Jishui， Lin Zhixiong， Pan Jianping Excavation and usablility analysis of ssr from transcriptome of Clausena lansium. 154 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (1)： 149 158. 在 5 8 次，四核苷酸重復(fù)主要分布在 5 6 次，五核苷酸重復(fù)主要分布在 4 5 次，六核苷酸重復(fù)次數(shù)集中在 4 次。 從不同 SSR 基序出現(xiàn)頻率來看（表 3） ，出現(xiàn)最多的基序是 A/T（ 4 826 個，占總 SSR 位點(diǎn)的40.81%） ，其次是 AG/CT 和 AAG/CTT，分別為 1 727 個和 810 個，占 14.60%和 6.85%。單核苷酸重復(fù)基序主要為 A/T 和 C/G。二核苷酸重復(fù)基序中以 AG/CT 所占的比例最高，其次為 AT/AT 和AC/GT， CG/CG 所占的比例最小。三核苷酸重復(fù)基序中以 AAG/CTT、 AAT/ATT、 ATC/ATG 和AGC/CTG 最多，共計(jì)占 SSR 總數(shù)的 19.14%。四核苷酸重復(fù)基序中以 AAAG/CTTT、 ACTG/AGTC、AAAC/GTTT和 AAAT/ATTT為主， 共計(jì)占 SSR總數(shù)的 1.13%。 五核苷酸重復(fù)基序中以 AAAAT/ATTTT和 AAAAG/CTTTT 所占的比例最多，其次為 AAAAC/GTTTT 和 AACTC/AGTTG。六核苷酸重復(fù)基序類型最多，但數(shù)量最少，出現(xiàn)頻率最低。 2.3 黃皮轉(zhuǎn)錄組 SSR 可用性評價 SSR標(biāo)記多態(tài)性的高低是判斷其可用性的重要依據(jù)， 而 SSR的長度是影響其多態(tài)性的主要因素。已有的研究結(jié)果表明，當(dāng) SSR 的長度 20 bp 時出現(xiàn)多態(tài)性的比例較高，長度在 12 19 bp 的 SSR多態(tài)性中等，而當(dāng)長度在 12 bp 以下時多態(tài)性極低（ Temnykh et al.， 2001） 。因此，本研究中在查找SSR 時將長度小于 12 bp 的去除。 如表 4 所示，去除后黃皮轉(zhuǎn)錄組 SSR 位點(diǎn)的長度在 12 25 bp，其中長度在 12 15 bp 的 SSR位點(diǎn)最多，達(dá) 6 025 個，占 SSR 總位點(diǎn)數(shù)的 50.95%；其次是 16 19 bp 的 SSR 位點(diǎn)，為 3 144 個（ 26.59%） ；長度 20 bp 的 SSR 位點(diǎn)達(dá)到 2 656 個，其中 20 23 bp 和 > 23 bp 的分別為 2 298 和358 個，可以預(yù)測這部分多態(tài)性潛能高的 SSR 在黃皮上應(yīng)具有較高的應(yīng)用價值。 表 4 黃皮轉(zhuǎn)錄組 SSR 位點(diǎn)重復(fù)序列的長度分布 Table 4 Distribution of the length of repeat sequences of SSR loci in the transcriptome of wampee 長度 /bp Length SSR 位點(diǎn)數(shù) Number of SSR loci 分布比例 /% Distribution percentage 12 15 6 025 50.95 16 19 3 144 26.59 20 23 2 298 19.43 > 23 358 3.03 2.4 黃皮轉(zhuǎn)錄組 SSR 引物設(shè)計(jì)與篩選 為進(jìn)一步在試驗(yàn)中利用篩選出的黃皮 SSR， 采用 Primer 3 對上下游序列均不小于 150 bp 的 SSR位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，每個位點(diǎn)產(chǎn)生 5 對引物，去除不符合條件的引物，最終篩選獲得 SSR 位點(diǎn)特異引物6 102 對，占總 SSR 位點(diǎn)的 10.77%。 隨機(jī)挑選合成了 30 對引物，包括二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復(fù)基序的 SSR 位點(diǎn)。以金雞心黃皮材料的基因組 DNA 為模板對這批引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增和篩選，結(jié)果表明， 30 對引物中的 24 對能夠擴(kuò)增出與預(yù)期產(chǎn)物大小相符的特異性條帶（表 5） ，有效擴(kuò)增率為 80%。 陸育生，陳 喆，常曉曉，邱繼水，林志雄，潘建平 . 黃皮轉(zhuǎn)錄組 SSR 挖掘及其可用性分析 . 園藝學(xué)報， 2018， 45 (1)： 149 158. 155 表 5 30 對黃皮 SSR 引物信息及擴(kuò)增結(jié)果 Table 5 Information and amplification results of 30 pairs of primers developed from wampee transcriptome 引物編號 Primer No. 引物序列（ 5 3)） Primer sequence 重復(fù)單元 Repeat motif 預(yù)期產(chǎn)物 /bp Expected size擴(kuò)增帶數(shù)Number of bands 多態(tài)性帶數(shù) Number of polymorphic bands 多態(tài)率 /% Percentage of polymorphism P1 F： GTCCAGCTCTTCTTTCAGCAG； R： TAAAGCTATGAGTCCCCATTTCA （ AAG）6158 0 0 0 P2 F： GCTGTTCAAATGTCATTCGTCTT； R： GCCTGGAATGCCTTATTTTGTAT （ TA）8133 5 2 40.00 P3 F： CCAAACCAAACCAAACAAATAAG；R： TTTGTCAAGCTACAGATACACGC （ TA）6109 0 0 0 P4 F： GAGCTAGGGTTTGTTTTTGTTCA； R： ATCTTCGTGTCGTTGTTGTTCTT （ CGA）7131 2 0 0 P5 F： CAGCTTCAACAACAGCTCTGTAA；R： GGTAGGTTTAAAGAAACGATCCC （ AC）9128 6 3 50.00 P6 F： CTTGTTGATTAATTGCCACTCGT； R： TGAAGATGATGAGCCTAAGAAGG （ TCT）5127 8 6 75.00 P7 F： TTAATTTGTGGGATCAATTTTGC； R： TCTCTCTTTCTCCCCTTTCTCTC （ GA）7127 5 1 20.00 P8 F： TCATCATCCTCTACTTGGCTCTC； R： GGTTGATGATCATGGATGGTG （ TCA）6107 5 2 40.00 P9 F： CATAACTTTCTGCATCATCGTCA； R： GAAGAAGAAGGAGGAGTTTGAGC（ TCA）5101 2 0 0 P10 F： AGCAAAGACAAAGAAAACAGGTG；R： TAGACACAACAAGCAAAGCAAAG （ GAACA）4136 0 0 0 P11 F： TGTAATGGTGAGAGATGGGTTTT；R： GTCTTCCTTTTTACTCGACCCAC （ ATTTTT）4159 6 3 50.00 P12 F： AACAAACTCAGAACCCACTCCTT；R： GCTTTGTCATCAGGGTTTTTAGA （ AAT）6150 5 3 60.00 P13 F： GGTTTGTTTGAGGATTCTGTTGT； R： GGTTGTTTTCTGGTATTGCTTCA （ GGT）5129 2 0 0 P14 F： CTGCTGCAATGAGTTGATCTTTA； R： CAACAATCAAGAAAAGGCTCAAG （ TGA）5114 2 0 0 P15 F： ATTTCAGAGTGGAGTTGTTTCCA；R： ACGAAGCATTAAAGCAGCATAAG （ TTTTA）4126 2 0 0 P16 F： AAGGATGGTAGTGACACTGAGGA；R： CCTTCTTCACCAGAACCATCTTC （ GAT）5107 5 2 40.00 P17 F： AAAGAAGATCGAGATCCTTCCAC；R： ACTCGTCTGAGCAATTTGATGAT （ TCA）6118 2 0 0 P18 F： TTTCTTGTTTCATACTCACCAACAC；R： GGAAGTTTGCAAGTTGTTATTGG （ AGC）5147 8 8 100.00 P19 F： TGGAGGTTTCTTTCTTTCTTGTC； R： CAACAGCTCTCCTCTCAAGTTGT （ GA）8151 4 0 0 P20 F： ACAGACTATTAACGGCAGATCCA；R： AAGAGCATGAAGAAACCTCACAG （ TGA）6132 6 6 100.00 P21 F： GCTTCTTTTCCACAACAAAAGTG；R： TAAAACAAAAGGCGACAAACAAT （ AGA）5122 3 0 0 P22 F： CAATCAAAGAATCATATGCACCA；R： TTGGACAATAGGAAAAGTCTCCA （ GCC）5129 4 0 0 P23 F： CGAAAATCCCTCACCGTTACTAT； R： CCATTGAGAAGAGAATGAGGAGA （ ATC）5118 4 3 75.00 P24 F： AGCGAAGAGGAAGAACAAAAAGT；R： CATTATCAGCCTCCACAATATCC （ AGA）5121 4 4 100.00 P25 F： GAATCACCAAACGAAATAGCAAC；R： TGGCTTTCAGGACTCAGAAATAC （ CAG）5125 6 5 83.33 P26 F： CGTTGCGTTGAGTATCCTAGTCT； R： ATGTCTCTGTGCGCTTCTGAT （ AAAG）5102 0 0 0 P27 F： GGTAAGACAGGAGGTGAGGACTT；R： TCTTGGCTCTTCATTTCATCAAC （ TAGT）5156 3 0 0 P28 F： GTCGGCAACACTTTCACTACTTT； R： AGACTTTGATTTTCTCCCCTCTG （ CTT）6125 0 0 0 P29 F： AAAGGCTGCGTACAAAGAAGATA；R： AGAATTTTTCACAGCATTTTTGC （ AG）6158 0 0 0 P30 F： CCTCCTCCTCTTCCTCTTGTTTA； R： CTTGGTTTCCATGAAATGAAAGA （ TA）6152 3 0 0 Lu Yusheng， Chen Zhe， Chang Xiaoxiao， Qiu Jishui， Lin Zhixiong， Pan Jianping Excavation and usablility analysis of ssr from transcriptome of Clausena lansium. 156 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (1)： 149 158. 2.5 SSR 多態(tài)性分析 利用上述 24 對驗(yàn)證的 SSR 引物對 16 份不同的黃皮種質(zhì)進(jìn)行多態(tài)性評價，結(jié)果（表 5）表明，13 對引物呈現(xiàn)多態(tài)性，占有效引物的 54.17%。 13 對引物共擴(kuò)增得到 73 條條帶，其中多態(tài)性片段48 條，平均每對引物產(chǎn)生 3.69 個多態(tài)性片段，每對引物產(chǎn)生的多態(tài)性片段數(shù)量 1</p>
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