園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (2)： 341 350. Acta Horticulturae Sinica doi： 10.16420/j.issn.0513-353x.2017-0620； http： /www. ahs. ac. cn 341 收稿日期 ： 2017 11 02； 修回日期 ： 2018 01 10 基金項(xiàng)目 ： 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（ 31272175） ；教育部新世紀(jì)優(yōu)秀人才支持計(jì)劃項(xiàng)目（ NCET-11-0670） ；江蘇省自然科學(xué)基金杰出青年基金項(xiàng)目（ BK20130027） ；江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（ PAPD） * 通信作者 Author for correspondence（ E-mail： xiongaishengnjau.edu.cn） 芹菜中類(lèi)胡蘿卜素合成相關(guān)番茄紅素 環(huán)化酶基因 AgLCYE 的克隆與表達(dá)分析 李靜文，馬 靜，卻 楓，王 楓，徐志勝，熊愛(ài)生*（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部華東地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210095） 摘 要： 番茄紅素 環(huán)化酶（ lycopene epsilon cyclase， LCYE）是類(lèi)胡蘿卜素合成途徑中的關(guān)鍵酶。從 津南實(shí)芹 中克隆獲得番茄紅素 環(huán)化酶基因 AgLCYE。 序列分析結(jié)果顯示， AgLCYE 包含 1 個(gè) 1 590 bp 的開(kāi)放閱讀框，編碼 529 個(gè)氨基酸。氨基酸序列多重比對(duì)表明，芹菜和其他物種的 LCYE 同源性為77.68%， AgLCYE 和同屬傘形科的胡蘿卜 LCYE 氨基酸序列同源性高達(dá) 98.07%。 AgLCYE 蛋白與胡蘿卜LCYE 蛋白進(jìn)化關(guān)系最近。 AgLCYE 蛋白屬于親水性蛋白，預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)中有 9 個(gè) 螺旋和 18個(gè) 折疊。無(wú)序化分析結(jié)果表明， AgLCYE 編碼的氨基酸序列有 4 個(gè)無(wú)序化區(qū)域。用 UPLC 方法對(duì) 30、45 和 60 d 齡芹菜葉中葉黃素和 胡蘿卜素的含量進(jìn)行測(cè)定， 30 d 時(shí)葉黃素含量最高， 45 d 時(shí)最低， 45和 60 d 時(shí)無(wú)顯著性差異，葉片中的葉黃素含量均高于葉柄。芹菜葉片和葉柄中均沒(méi)有檢測(cè)到 胡蘿卜素的存在。熒光定量表達(dá)分析結(jié)果顯示，隨著生長(zhǎng)期的增加，葉片中 AgLCYE 的相對(duì)表達(dá)量逐漸升高；葉柄中逐漸降低。 關(guān)鍵詞： 芹菜；類(lèi)胡蘿卜素；番茄紅素 環(huán)化酶基因；葉黃素； 胡蘿卜素 中圖分類(lèi)號(hào)： S 636.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)： 0513-353X（ 2018） 02-0341-10 Cloning and Expression Profiles Analysis of Carotenoid Biosynthesis Related Gene AgLCYE from Celery LI Jingwen， MA Jing， QUE Feng， WANG Feng， XU Zhisheng， and XIONG Aisheng*（ State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement， Ministry of Agriculture Key Laboratory of Biology and Germplasm Enhancement of Horticultural Crops in East China， College of Horticulture， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China） Abstract： Celery（ Apium graveolens L.） is an important vegetable in Apiaceae family， with excellent source of carotenoid. Lycopene epsilon cyclase is a key enzyme in the pathway of carotenoid biosynthesis. Here， the AgLCYE gene encoding lycopene epsilon cyclase was cloned from A. graveolens Jinnan Shiqin . The sequences of AgLCYE gene contained an open reading frame with the length of 1 590 bp， which encoded 529 amino acids. Multiple alignments of the AgLCYE amino acid sequences from celery and other different plants showed a homology of 77.68%. The homology of LCYE was up to 98.07% Li Jingwen， Ma Jing， Que Feng， Wang Feng， Xu Zhisheng， Xiong Aisheng. Cloning and expression profiles analysis of carotenoid biosynthesis related gene AgLCYE from celery. 342 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (2)： 341 350. between celery and carrot. Phylogenetic tree analysis showed that the LCYE proteins were conserved. The physicochemical property analysis showed that AgLCYE belonged to hydrophilic protein. There were 9 alpha helices and 18 beta folds in the predicted tertiary structure of the protein. The results of disordered analysis showed that the amino acid sequence of AgLCYE protein had four disorder regions. The contents of lutein and -carotene of celery leaves in different growth stages（ 30， 45， and 60 d） were determined by UPLC. The peak of lutein content was detected at 30 d. The lowest content of lutein was observed in 45 d. There was no significant difference between 45 d and 60 d. The lutein content in leaf blade was higher than that in petiole of celery. The presences of -carotene were not detected in leaf blade and petiole of celery，respectively. The expression levels of AgLCYE gene in celery were detected by quantitative real-time PCR. In leaf blade， the relative expression levels of AgLCYE gene increased gradually over the process of celery growth and development. On the contrary， the relative expression levels of AgLCYE gene decreased in petiole. Keywords： celery； carotenoid； AgLCYE gene； lutein； -carotene 高等植物中， 類(lèi)胡蘿卜素是合成維生素 A 和植物激素 ABA 的前體 （ Polívka et al.， 2004； Polívka & Frank， 2010） 。類(lèi)胡蘿卜素可以作為葉綠體光合作用的輔助色素，還能夠保護(hù)植物組織免受強(qiáng)光破壞，同時(shí)參與光形態(tài)的建成（ Nambara & Marion-Poll， 2005； Bowman & Simon， 2013） 。類(lèi)胡蘿卜素分子中存在共軛雙鍵結(jié)構(gòu)，所以在可見(jiàn)光下會(huì)呈現(xiàn)出不同的顏色，使得植物顏色呈現(xiàn)多樣化，如：胡蘿卜中的 胡蘿卜素，番茄和西瓜中的番茄紅素，萬(wàn)壽菊中的葉黃素等（ Hirschberg， 2001） 。類(lèi)胡蘿卜素是國(guó)際公認(rèn)的具有生理活性的功能性抗氧化劑，在抗癌、抗衰老等方面具有重要的作用（ Prabhala et al.， 2010） 。此外，類(lèi)胡蘿卜素還是一種食用油溶性色素，具有很好的著色性能（ Blumberg， 1995） 。 番茄紅素 環(huán)化酶（ lycopene epsilon cyclase， LCYE）是類(lèi)胡蘿卜素合成途徑中的關(guān)鍵酶，催化番茄紅素的一端形成 環(huán)，生成 胡蘿卜素，進(jìn)而合成 胡蘿卜素和葉黃素。 LCYE 基因的表達(dá)水平在一定程度上與植物中 /胡蘿卜素的比值有關(guān)（ Harjes et al.， 2008） 。已有研究表明，黃色胡蘿卜中 LCYE 基因表達(dá)水平較高，根中主要積累葉黃素（ Clotault et al.， 2008） 。在番茄 Delta突變體中， LCYE 基因轉(zhuǎn)錄水平的提高，導(dǎo)致果實(shí)積累大量的 胡蘿卜素（ Ronen et al.， 1999） 。在萵苣中， LCYE 上的單氨基酸突變?cè)黾恿似浯呋鸭t素生成 環(huán)的活性（ Cunningham & Gantt，2001） 。玉米 lcyb 突變體中由于 LCYE 活性的增強(qiáng)，胚乳中產(chǎn)生了大量稀有的類(lèi)胡蘿卜素，如 胡蘿卜素和萵苣黃素等（ Bai et al.， 2009） 。 芹菜（ Apium graveolens L.）富含類(lèi)胡蘿卜素、 B 族維生素、芹菜素等（吳蓓 等， 2016；譚國(guó)飛 等， 2017； Li et al.， 2018） 。目前芹菜中關(guān)于類(lèi)胡蘿卜素合成關(guān)鍵基因的報(bào)道相對(duì)較少。以津南實(shí)芹為試驗(yàn)材料，從其 cDNA 中克隆獲得芹菜編碼番茄紅素 環(huán)化酶的基因 AgLCYE，并對(duì)其進(jìn)行序列分析。通過(guò)超高效液相色譜法（ Ultra Performance Liquid Chromatography， UPLC）對(duì)不同生長(zhǎng)時(shí)期芹菜葉中的 胡蘿卜素和葉黃素含量進(jìn)行了測(cè)定， 并用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（ quantitative real-time PCR， RT-qPCR）分析了 AgLCYE 在不同生長(zhǎng)時(shí)期及葉不同部位的表達(dá)水平，為進(jìn)一步深入研究芹菜中番茄紅素 環(huán)化酶在類(lèi)胡蘿卜素生物合成中的功能提供基礎(chǔ)。 李靜文，馬 靜，卻 楓，王 楓，徐志勝，熊愛(ài)生 . 芹菜中類(lèi)胡蘿卜素合成相關(guān)番茄紅素 環(huán)化酶基因 AgLCYE 的克隆與表達(dá)分析 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (2)： 341 350. 343 1 材料與方法 1.1 材料及處理 芹菜津南實(shí)芹種子由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)傘形科蔬菜作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。2017 年 2 月將種子播種于該實(shí)驗(yàn)室植物生長(zhǎng)室，于旺盛生長(zhǎng)階段中的 30、 45 和 60 d 時(shí)，選取生長(zhǎng)勢(shì)一致的植株，剪取葉片和葉柄部分，用錫紙包裹后液氮速凍，保存于 80 冰箱，用于提取總RNA 和反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA。 大腸桿菌菌株 DH5 由本實(shí)驗(yàn)室保存。質(zhì)粒載體 pMD19-T Vector、 DNA 分子量 marker、 Ex Taq DNA 聚合酶、 Prime Script RT reagent Kit 和 SYBR Premix Ex Taq 試劑盒等均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。 RNA simple Total RNA Kit 由天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)， DNA 凝膠回收試劑盒購(gòu)于杭州維特潔公司。葉黃素（純度 90%）標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司（中國(guó)上海） ， 胡蘿卜素（純度 95%）標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于和光純藥工業(yè)株式會(huì)社（日本大阪） 。 1.2 芹菜 AgLCYE 的克隆 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室測(cè)定的芹菜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)（ Jia et al.， 2015） ，檢索拼接獲得 AgLCYE 的序列。根據(jù)芹菜 AgLCYE 序列，用 Primer Premier 6.0 設(shè)計(jì)一對(duì)引物（ AgLCYE-F： 5-ATGGAGACGTACTG CATCGGAGGC-3； AgLCYE-R： 5-CTAGACCGTTAGATATGTTCTTACC-3， ） ，由通用（滁州）生物科技有限公司合成。以津南實(shí)芹 cDNA 為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。 PCR 反應(yīng)體系為 20 L： cDNA（ 2.5 ng · L-1） 1 L， Ex Taq DNA 聚合酶 10 L，引物各加 1 L， ddH2O 7 L。反應(yīng)條件為： 94 預(yù)變性 5 min； 94 變性 30 s， 54 退火 30 s， 72 延伸 120 s，共 30 個(gè)循環(huán)； 72 延伸 10 min。反應(yīng)產(chǎn)物由 1.5%瓊脂凝膠電泳分離后，切膠。采用 DNA 凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收。將回收產(chǎn)物連接到 pMD19-T 載體上并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株 DH5 中，提取質(zhì)粒經(jīng) PCR 鑒定后，由南京金斯瑞生物科技有限公司完成測(cè)序。 1.3 生物信息學(xué)分析 在 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行 BLAST，獲得胡蘿卜等其他物種中番茄紅素 環(huán)化酶的氨基酸序列，利用 DNAMAN 5.0 進(jìn)行比對(duì)分析， AgLCYE 蛋白親 /疏水性分析。利用在線工具包（ SMS） （ http：/www. bio-soft.net/sms）和 ExPASy-ProtParam（ http： /web.expasy.org/protparam）分析氨基酸的理化性質(zhì)（ Gasteiger et al.， 2003； Harrison & Bagajewicz， 2015） 。用 MEGA 6.0 中的 Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)（ Tamura et al.， 2013） 。利用 FoldIndex 程序測(cè)定 AgLCYE 蛋白的無(wú)序特征（ Jaime et al.， 2005） 。利用 Swiss-Model（ http： /www.Swissmodel.expasy.org）構(gòu)建 AgLCYE 蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)模型（ Arnold et al.， 2006） 。 1.4 芹菜葉中類(lèi)胡蘿卜素的提取和含量的測(cè)定 依照陳敏氡等（ 2013）和 Ma 等（ 2017）的方法，分別取 30、 45 和 60 d津南實(shí)芹的葉片和葉柄，將鮮樣于研缽中用液氮研磨，然后在冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍抽干，稱取樣品，用丙酮提取類(lèi)胡蘿卜素。將提取液用 0.45 m 濾膜過(guò)濾后定容，通過(guò)超高效液相色譜（ Waters，美國(guó)）進(jìn)行類(lèi)胡蘿卜素含量的檢測(cè)。 UPLC 檢測(cè)柱型： UPLC BEH C18（ 2.1 mm × 100 mm， 1.7 m； Waters，美國(guó)） ，檢測(cè)波長(zhǎng)： 450 nm，流動(dòng)相為乙腈 甲醇 = 9 1，流速： 0.25 mL · min-1，色譜柱溫： 30 。設(shè)置 3 次重復(fù)。 Li Jingwen， Ma Jing， Que Feng， Wang Feng， Xu Zhisheng， Xiong Aisheng. Cloning and expression profiles analysis of carotenoid biosynthesis related gene AgLCYE from celery. 344 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (2)： 341 350. 1.5 AgLCYE 的表達(dá)分析 使用 RNA simple Total RNA Kit 總 RNA 提取試劑盒提取樣品總 RNA，然后用 Prime Script RT reagent Kit 試劑盒將提取的 RNA 反轉(zhuǎn)錄成 cDNA。 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 平臺(tái)為 CFX96TMreal-time PCR system（ Bio-Rad，美國(guó)） 。芹菜 TUB-B 基因作為內(nèi)參基因（ Li et al.， 2016） 。其引物為 F： 5-TGG TGGCACTGGATCTGGTATGG-3； R： 5-ACTTTCGGAGGAGGGAAGACTGAA-3。目標(biāo)基因的引物為 BDAgLCYE-F ： 5-TTTATCATAGCACCTCACCACTTG-3 ； BDAgLCYE-R ： 5-GACCGT TAGATATGTTCTTACCA-3。引物由通用（滁州）生物科技有限公司合成。每個(gè)處理設(shè)置 3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，采用 2-CT方法進(jìn)行結(jié)果分析（ Pfaffl， 2001） 。 2 結(jié)果與分析 2.1 芹菜合成番茄紅素 環(huán)化酶基因 AgLCYE 的 克隆 以芹菜津南實(shí)芹葉片 cDNA 為模板，用引物 AgLCYE-F 和 AgLCYE-R 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，獲得預(yù)期 1 500 bp 左右擴(kuò)增片段?？寺『鬁y(cè)序結(jié)果（圖 1）顯示， AgLCYE 含有 1 個(gè) 1 590 bp 的開(kāi)放閱讀框（ open reading frame， ORF） ，編碼 529 個(gè)氨基酸。 圖 1 芹菜 AgLCYE 的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列 Fig. 1 Nucleotide acids and deduced amino acids sequences of AgLCYE from celery 李靜文，馬 靜，卻 楓，王 楓，徐志勝，熊愛(ài)生 . 芹菜中類(lèi)胡蘿卜素合成相關(guān)番茄紅素 環(huán)化酶基因 AgLCYE 的克隆與表達(dá)分析 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (2)： 341 350. 345 2.2 番茄紅素 環(huán)化酶蛋白氨基酸序列的比對(duì)分析 將芹菜番茄紅素 環(huán)化酶氨基酸序列與胡蘿卜（ Daucus carota） 、萬(wàn)壽菊（ Tagetes erecta）煙草 （ Nicotiana tabacum） 、 甘薯 （ Ipomoea batatas） 、 擬南芥 （ Arabidopsis thaliana） 、 大豆 （ Glycine max） 、黃瓜（ Cucumis sativus） 、橙（ Citrus sinensis） 、麻風(fēng)樹(shù)（ Jatropha curcas） 、黃秋葵（ Abelmoschus esculentus）中的番茄紅素 環(huán)化酶蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果（圖 2）表明這些番茄紅素 環(huán)化酶氨基酸序列的同源性為 77.68%，其中芹菜和胡蘿卜 LCYE 氨基酸序列的同源性高達(dá) 98.07%。 圖 2 芹菜與其他物種 LCYE 氨基酸序列的多重比對(duì) 1：芹菜； 2：胡蘿卜； 3：萬(wàn)壽菊； 4：煙草； 5：甘薯； 6：擬南芥； 7：大豆； 8：黃瓜； 9：橙； 10：麻風(fēng)樹(shù)； 11：黃秋葵。 Fig. 2 The alignment of amino acid sequences of LCYE from celery and other different plants 1： Apium graveolens； 2： Daucus carota； 3： Tagetes erecta； 4： Nicotiana tabacum； 5： Ipomoea batatas； 6： Arabidopsis thaliana； 7： Glycine max； 8： Cucumis sativus； 9： Citrus sinensis； 10： Jatropha curcas； 11： Abelmoschus esculentus. Li Jingwen， Ma Jing， Que Feng， Wang Feng， Xu Zhisheng， Xiong Aisheng. Cloning and expression profiles analysis of carotenoid biosynthesis related gene AgLCYE from celery. 346 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (2)： 341 350. 2.3 AgLCYE 蛋白進(jìn)化樹(shù)分析 選取番茄紅素 環(huán)化酶氨基酸序列相似度較高的物種進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析，進(jìn)一步探究AgLCYE 蛋白的進(jìn)化關(guān)系。結(jié)果（圖 3）表明， AgLCYE 蛋白與同屬傘形科的胡蘿卜 LCYE 蛋白進(jìn)化關(guān)系最近，其次與菊科和茄科中的較近，而與大戟科、蕓香科、錦葵科的較遠(yuǎn)。 圖 3 AgLCYE 蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù) Fig. 3 Phylogenetic tree of AgLCYE protein 2.4 LCYE 氨基酸的理化性質(zhì)和親 /疏水性分析 對(duì)不同植物來(lái)源的 LCYE 蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)和組成成分分析，結(jié)果見(jiàn)表 1。 LCYE 蛋白的氨基酸數(shù)在 516 546 之間，相對(duì)分子質(zhì)量為（ 57 61 kD） ，理論等電點(diǎn)（ pI） 5.71 7.87。酸性氨基酸（包括天冬氨酸和谷氨酸）與堿性氨基酸（包括賴氨酸、精氨酸和組氨酸）含量基本相同，為 12%左右。脂肪族氨基酸含量相對(duì)較高，為 23%左右。芳香族氨基酸含量相對(duì)較低，為 10%左右。除了黃瓜、牽?；ê透适碇?LCYE 蛋白總平均疏水性（ Grand average of hydrophobicity， GRAVY）為正值， 表 1 不同植物來(lái)源的 LCYE 蛋白氨基酸組成成分及理化性質(zhì)分析 Table 1 The comparison of composition and physical and chemical characterization of amino acid sequences of LCYE protein from different plant species 植物 Plant 氨基酸數(shù) Number of amino acid 理論相對(duì)分子量 /D Theoretical relative molecular mass pI 氨基酸比例 /% Ratio of amino acid 總平均疏水性 Grand average of hydrophobicity 酸性 Positive堿性 Negative脂肪族 Aliphatic 芳香族 Aromatic 芹菜 Apium graveolens 529 59 447.7 7.08 13 11 24 10 0.044 胡蘿卜 Daucus carota 530 59 552.9 7.09 13 11 23 10 0.050 萬(wàn)壽菊 Tagetes erecta 516 57 365.4 6.30 11 10 22 10 0.003 向日葵 Helianthus annuus 535 59 745.2 7.87 12 10 22 10 0.014 煙草 Nicotiana tabacum 523 58 665.9 7.12 13 11 23 10 0.017 枸杞 Lycium ruthenicum 523 58 538.7 7.03 12 11 23 10 0.048 牽牛花 Ipomoea nil 546 61 042.4 5.71 12 12 24 9 0.026 甘薯 Ipomoea batatas 542 60 600.0 6.01 12 11 24 9 0.007 擬南芥 Arabidopsis thaliana 524 58 515.1 5.79 12 12 23 10 0.103 大豆 Glycine max 532 59 450.6 7.51 13 11 23 10 0.087 黃瓜 Cucumis sativus 533 58 876.0 6.07 11 11 23 10 0.003 李靜文，馬 靜，卻 楓，王 楓，徐志勝，熊愛(ài)生 . 芹菜中類(lèi)胡蘿卜素合成相關(guān)番茄紅素 環(huán)化酶基因 AgLCYE 的克隆與表達(dá)分析 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (2)： 341 350. 347 屬疏水性蛋白之外，其他均 為負(fù)值，屬親水性蛋白。結(jié)果表明不同物種的 LCYE 蛋白氨基酸理化性質(zhì)相似。 通過(guò) DNAMAN 5.0 對(duì)芹菜中的 AgLCYE 蛋白進(jìn)行親 /疏水性分析，結(jié)果表明，芹菜 AgLCYE蛋白為親水性蛋白。 其中疏水性最強(qiáng)的位置是第 492 位亮氨酸 （ Leu） ， 其次為第 112 位頡氨酸 （ Val） ，親水性最強(qiáng)的位置是第 441 位賴氨酸（ Lys） 。 2.5 芹菜 AgLCYE 蛋白無(wú)序化分析和三級(jí)蛋白結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè) 利用 FoldIndex 程序?qū)η鄄酥?AgLCYE 蛋白的無(wú)序特征進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示， AgLCYE 蛋白編碼的氨基酸序列在芹菜中有 4 個(gè)無(wú)序化區(qū)域，其中包含一個(gè)有 52 個(gè)氨基酸組成的長(zhǎng)無(wú)序化區(qū)域， 氨基酸序列為 METYCIGGRNFITMAAFSTCPTWRRPRRKRLRRNVKMSSGRKSELRCVKESV。 為進(jìn)一步分析蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)，通過(guò) Swiss-Model 對(duì)芹菜 AgLCYE 蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行同源建模，預(yù)測(cè)的芹菜 AgLCYE 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)中有 9 個(gè) 螺旋和 18 個(gè) 折疊。 2.6 芹菜中葉黃素和 胡蘿卜素的含量測(cè)定 通過(guò)超高效液相色譜對(duì)不同生長(zhǎng)時(shí)期（ 30、 45 和 60 d） 津南實(shí)芹葉中的葉黃素和 胡蘿卜素含量進(jìn)行測(cè)定。從圖 4 可以看出，芹菜葉片和葉柄不同生長(zhǎng)時(shí)期均沒(méi)有檢測(cè)到 胡蘿卜素的存在。葉黃素含量如圖 5 所示，芹菜葉片中葉黃素的含量均高于葉柄。芹菜葉片和葉柄中，葉黃素含量均在 45 d 時(shí)最低， 30 d 時(shí)最高，其中葉柄中 30 d 時(shí)葉黃素含量約是 45 d 和 60 d 的 2 倍。 圖 4 UPLC 測(cè)定不同生長(zhǎng)階段芹菜葉中葉黃素和 胡蘿卜素含量 Fig. 4 Determination of lutein and -carotene of celery leaves in different growth stages by UPLC Li Jingwen， Ma Jing， Que Feng， Wang Feng， Xu Zhisheng， Xiong Aisheng. Cloning and expression profiles analysis of carotenoid biosynthesis related gene AgLCYE from celery. 348 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (2)： 341 350. 圖 6 不同生長(zhǎng)階段芹菜葉中 AgLCYE 的表達(dá)量分析 不同小寫(xiě)字母表示差異顯著（ P < 0.05） 。 Fig. 6 Analysis of expression levels of AgLCYE in celery leaves in different growth stages Different letters indicate significant difference（ P < 0.05） . 圖 5 不同生長(zhǎng)階段芹菜葉中葉黃素含量 不同小寫(xiě)字母表示差異顯著（ P < 0.05） 。 Fig. 5 Lutein content of celery leaves in different growth stages Different letters indicate significant difference（ P < 0.05） . 2.7 芹菜 AgLCYE 的表達(dá)分析 如圖 6 所示， AgLCYE 在芹菜葉片中的相對(duì)表達(dá)量隨著生長(zhǎng)期的增加逐漸升高，在 45 和 60 d時(shí)的相對(duì)表達(dá)量分別是 30 d 時(shí)的 1.5 倍和 1.6 倍。 AgLCYE 在芹菜葉柄中的相對(duì)表達(dá)量隨著生長(zhǎng)期的增加逐漸降低。總體上看， AgLCYE 在芹菜葉片中的相對(duì)表達(dá)量高于葉柄。 3 討論 高等植物中編碼番茄紅素 環(huán)化酶的 LCYE 基因最先由 Cunningham 等（ 1996）在擬南芥中克隆出來(lái)，現(xiàn)已在多種植物中克隆得到，如萬(wàn)壽菊（ Del et al.， 2005） 、玉米（李群睿， 2010）等，并進(jìn)行了功能研究。 在 LCYE 基因被抑制的早實(shí)枳植株中， PDS 基因的表達(dá)量顯著增加， LCYB 和 ZEP基因的表達(dá)量下降， 胡蘿卜素的含量下降， 胡蘿卜素和紫黃質(zhì)含量增加，葉黃素含量沒(méi)有顯著變化（仝鑄， 2008） 。馬超等（ 2010）將 LCYE 基因構(gòu)建成 RNAi 載體并轉(zhuǎn)化煙草植株，獲得目的基因 mRNA 表達(dá)量減少和番茄紅素含量增加的轉(zhuǎn)基因植株。抑制 LCYE 基因的表達(dá)，馬鈴薯塊莖中 胡蘿卜素和總類(lèi)胡蘿卜素的含量都顯著增加（ Diretto et al.， 2006） 。抑制油菜種子中的 LCYE 基因的表達(dá)，增加了油菜種子中的 胡蘿卜素、玉米黃質(zhì)和堇菜黃質(zhì)的含量（ Yu et al.， 2008） 。這些都證明 LCYE 基因在植物類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑中起著重要的作用，并與不同類(lèi)胡蘿卜素含量的相對(duì)比例密切相關(guān)，但具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)中從芹菜中克隆獲得番茄紅素 環(huán)化酶基因，并對(duì)其進(jìn)行了分析，為進(jìn)一步研究該基因在芹菜類(lèi)胡蘿卜素生物合成中的功能和作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。 本試驗(yàn)中從芹菜中克隆得到的編碼番茄紅素 環(huán)化酶的 AgLCYE 序列含有一個(gè) 1 590 bp 的開(kāi)放閱讀框，編碼 529 個(gè)氨基酸。芹菜番茄紅素 環(huán)化酶在進(jìn)化上很保守，分別與菊科、茄科、十字花科依次接近，這與植物進(jìn)化趨勢(shì)是一致的（ Soltis & Soltis， 2004） 。與豆科、葫蘆科進(jìn)化關(guān)系較近，與錦葵科進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)，而在植物進(jìn)化趨勢(shì)中傘形科植物與錦葵科植物的進(jìn)化關(guān)系比豆科和葫蘆科植物更近（ Soltis & Soltis， 2004） 。此外，進(jìn)化樹(shù)中可以看出同科植物的 LCYE 分布于同一分支，說(shuō)明在進(jìn)化中同科植物的 LCYE 蛋白有較近的親源關(guān)系。芹菜和其他物種中的 LCYE 氨基酸序列的同源性較高，和胡蘿卜中 LCYE 氨基酸序列的同源性高達(dá) 98.07%，這也和進(jìn)化上的關(guān)系一致。 李靜文，馬 靜，卻 楓，王 楓，徐志勝，熊愛(ài)生 . 芹菜中類(lèi)胡蘿卜素合成相關(guān)番茄紅素 環(huán)化酶基因 AgLCYE 的克隆與表達(dá)分析 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (2)： 341 350. 349 Ma 等（ 2017）和 Liu 等（ 2017）分別對(duì)胡蘿卜和西瓜中類(lèi)胡蘿卜素含量和相關(guān)基因表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)胡蘿卜肉質(zhì)根和西瓜果實(shí)中，類(lèi)胡蘿卜素的含量與相關(guān)基因的表達(dá)密切相關(guān)。通過(guò)對(duì)不同時(shí)期芹菜葉中葉黃素含量和 AgLCYE 相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定，可知葉黃素含量和 AgLCYE 相對(duì)表達(dá)量都具有組織特異性，葉片中葉黃素的含量和 AgLCYE 相對(duì)表達(dá)量均高于葉柄。 AgLCYE 的相對(duì)表達(dá)量在芹菜葉片中隨著生長(zhǎng)時(shí)期的增加逐漸升高，在葉柄中，隨生長(zhǎng)期的增加逐漸降低。而葉黃素的含量在芹菜葉片和葉柄中 45 d 時(shí)含量最低。但葉黃素含量和 AgLCYE 相對(duì)表達(dá)量在 45 和 60 d 時(shí)無(wú)顯著性差異。此外，本試驗(yàn)在芹菜葉片中沒(méi)有檢測(cè)到 胡蘿卜素的存在，由此推測(cè)芹菜葉中不含有 胡蘿卜素或者含量非常低，其中的具體調(diào)控機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。 References Arnold K， Bordoli L， Kopp J， Schwede T. 2006. 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