葡萄病毒A實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)技術(shù)的建立及應(yīng)用.pdf

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葡萄病毒A實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)技術(shù)的建立及應(yīng)用.pdf

<p>園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (11)： 2243 2253. Acta Horticulturae Sinica   doi： 10.16420/j.issn.0513-353x.2018-0124； http： /www. ahs. ac. cn                                                 2243 收稿日期： 2018 05 02；修回日期： 2018 11 09 基金項(xiàng)目：國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目（ CARS-29-bc-1）  * 通信作者  Author for correspondence（ E-mail： yfdong163.com）  葡萄病毒 A 實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR 檢測(cè)技術(shù)的建立及應(yīng)用  任  芳，董雅鳳*，張尊平，范旭東，胡國(guó)君（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所，國(guó)家落葉果樹(shù)脫毒中心，遼寧興城  125100）  摘  要：根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道和 GenBank 已登錄序列設(shè)計(jì)引物建立了葡萄病毒 A（ Grapevine virus A， GVA）SYBR Green染料法實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR 檢測(cè)技術(shù)體系。該技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)循環(huán)閾值與模板濃度呈現(xiàn)良好線(xiàn)性關(guān)系，擴(kuò)增效率為 99.2%，決定系數(shù)為 0.999，可特異性檢測(cè) GVA，靈敏度高（達(dá)常規(guī) RT-PCR 的100 倍），重復(fù)性好。對(duì)不同季節(jié)、不同品種以及不同部位葡萄樣品（嫩葉、嫩葉柄、老葉、老葉柄、卷須和休眠枝條）中 GVA 的檢出率普遍高于常規(guī) RT-PCR。不同季節(jié)間比較，對(duì)秋、冬季樣品檢測(cè)效果最好，除嫩葉外其余部位檢出率均達(dá) 100%，春夏季檢出率為 10% 100%。不同部位間比較，老葉柄和休眠枝條檢測(cè)效果最好，檢出率均達(dá) 100%，其次為老葉（ 80% 100%），其余部位樣品檢出率為 10% 100%。在大量田間樣品檢測(cè)中，休眠枝條樣品檢測(cè)結(jié)果與常規(guī) RT-PCR 一致，而秋季老葉柄樣品檢出率明顯高于常規(guī) RT-PCR。  關(guān)鍵詞：葡萄；葡萄病毒 A；檢測(cè)；實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR；常規(guī) RT-PCR 中圖分類(lèi)號(hào)： S 663.1        文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A         文章編號(hào)： 0513-353X（ 2018） 11-2243-11 Development and Application of a Quantitative RT-PCR Approach for Detection of Grapevine virus A REN Fang， DONG Yafeng*， ZHANG Zunping， FAN Xudong， and HU Guojun*（ National Center for Eliminating Viruses from Deciduous Fruit Trees， Research Institute of Pomology， Chinese Academy of Agriculture Sciences， Xingcheng， Liaoning 125100， China）  Abstract： To develop a rapid and highly sensitive method for Grapevine virus A（ GVA） detection，a SYBR Green real time fluorescence quantitative RT-PCR method（ RT-qPCR） was established， and an excellent linear correlation（ R2= 0.999） and a high amplification efficiency（ E = 99.2%） were obtained from standard curve of cDNA. The RT-qPCR method could be used to detect GVA specifically， and the sensitivity was 100-fold higher than conventional RT-PCR. Reproducibility test revealed that the coefficients of variation in the intra- and extra- assay were 0.16% 0.31% and 2.91%， respectively，indicating a good reproducibility. The RT-qPCR method could be used to detect a wide range of sample types， and the detection rates of samples from different seasons， cultivars and positions（ young leaves，young petioles， old leaves， old petioles， tendrils and dormant branches） were generally higher than Ren Fang， Dong Yafeng， Zhang Zunping， Fan Xudong， Hu Guojun. Development and application of a quantitative RT-PCR approach for detection of Grapevine virus A. 2244                                                                   Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (11)： 2243 2253. conventional RT-PCR. Comparison of the detection rates of samples in different seasons showed that samples in autumn and winter were best for detection， and except for young leaves， the detection rates of all samples in these two seasons were all 100%. The detection rates of samples in spring and summer were 10% to 100%. Comparison of the detection rates of samples in different positions showed that samples of old petioles and dormant branches were best for detection， for which the detection rates were all 100%. The detection rate for old leaves was 80% to 100%， and for samples from other positions was from 10% to 100%. In detection of field samples， the results of dormant branches were most consistent with conventional RT-PCR， but the detection rate of old tendrils in autumn by RT-qPCR was obviously higher than that by conventional RT-PCR. Keywords： grapevine； Grapevine virus A； detection； real-time fluorescent quantitative RT-PCR；conventional RT-PCR 葡萄皺木復(fù)合病（ Rugose wood complex， RW）是葡萄上的一類(lèi)重要病害，發(fā)生普遍，可造成葡萄嫁接成活率下降、春季萌芽延遲、生長(zhǎng)減弱甚至衰退死亡等（ Martelli， 1993）。葡萄皺木復(fù)合病主要由線(xiàn)性病毒科（ Flexiviridae）葡萄病毒屬（ Vitivirus）病毒引起，其中葡萄病毒 A（ Grapevine virus A， GVA）是主要病原之一（ Martelli et al.， 1997），其還與南非葡萄西拉衰退病有關(guān) （ Goszczynski et al.， 2008）。目前 GVA 已在南非（ Goszczynski & Jooste， 2003）、意大利（ Murolo et al.， 2008）、法國(guó)（ Hommay et al.， 2008）、澳大利亞、美國(guó)（ Goszczynski & Habili， 2012）以及中國(guó)（任芳  等，2012；王建輝  等， 2013）等普遍發(fā)生，危害趨勢(shì)不斷加重。  目前葡萄病毒檢測(cè)常用的 ELISA 血清學(xué)檢測(cè)方法簡(jiǎn)單快速，但靈敏度略低于分子檢測(cè)方法，且GVA 抗血清需從國(guó)外進(jìn)口，本實(shí)驗(yàn)室制備了 GVA 多克隆抗體，但尚只能對(duì)少數(shù)樣品檢測(cè)成功（任芳  等， 2014）； RT-PCR 是另一廣泛應(yīng)用的方法，但其在靈敏度和檢測(cè)范圍上還存在一定不足。實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR（ Real-time fluorescent quantitative RT-PCR， RT-qPCR）具有特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，在多種果樹(shù)病毒檢測(cè)中靈敏度普遍達(dá)常規(guī) RT-PCR 的 100 倍以上（ Beuve et al.， 2007；Loconsole et al.， 2010；秦子禹  等， 2015； Chen et al.， 2016；周俊  等， 2016）。目前國(guó)際上已建立葡萄卷葉伴隨病毒、皺木復(fù)合相關(guān)病毒、扇葉病毒、斑點(diǎn)病毒等主要葡萄病毒的 RT-qPCR 方法（ Beuve et al.， 2007； Osman & Rowhani， 2008； Poojari et al.， 2016； Bruisson et al.， 2017）。國(guó)內(nèi)目前僅報(bào)道了葡萄扇葉病毒（周俊  等， 2016）、葡萄卷葉伴隨病毒 3（乾義柯  等， 2017）和葡萄斑點(diǎn)病毒（卓娜  等， 2011）等少數(shù)幾種葡萄病毒的 RT-qPCR 檢測(cè)方法，多種葡萄病毒的 RT-qPCR檢測(cè)還未見(jiàn)報(bào)道。  本研究中建立了一種 GVA SYBR Green染料法 RT-qPCR 檢測(cè)技術(shù)，并對(duì)不同季節(jié)和不同部位田間葡萄樣品進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證和比較，以期為 GVA 的高效、準(zhǔn)確檢測(cè)提供一種可靠的技術(shù)手段，為檢測(cè)樣品的取樣時(shí)間及部位提供選擇依據(jù)，并為進(jìn)一步分析病毒濃度變化規(guī)律提供基礎(chǔ)。  1  材料與方法  1.1  材料及試劑  2016 2017 年從遼寧省興城市中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所國(guó)家落葉果樹(shù)脫毒中心毒源保存圃采集葡萄嫩葉（枝條頂端嫩梢從上往下第 2、 3 片葉）、嫩葉柄、老葉（枝條基部自下往上第 2、 3任   芳，董雅鳳，張尊平，范旭東，胡國(guó)君 . 葡萄病毒 A 實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR 檢測(cè)技術(shù)的建立及應(yīng)用 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (11)： 2243 2253.                                                                                  2245 片葉）、老葉柄、卷須和一年生休眠枝條等樣品備用。  10× PCR Buffer、 dNTPs、 Taq 酶、 DNA Marker DL2000、反轉(zhuǎn)錄試劑盒 PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser 和 Escherichia coli DH5 感受態(tài)購(gòu)自大連寶生物公司（ TaKaRa）； M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自 Promega 公司； 2× SYBR Green qPCR Mix、 pTOPO-TA Vector、膠回收試劑盒購(gòu)自北京艾德萊生物有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR 管購(gòu)自美國(guó) Bio-Rad 公司；實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀為美國(guó) BIO-RAD CFX ConnectTMReal-Time System。  1.2  引物設(shè)計(jì)及克隆鑒定  根據(jù) GenBank 已登錄序列和本實(shí)驗(yàn)室獲得的 GVA 遼寧分離物序列（任芳  等， 2012），利用軟件 Primer premier 5.0 及 Oligo 7.0 設(shè)計(jì)引物，并參考文獻(xiàn)報(bào)道（ Osman & Rowhani， 2008）部分 GVA引物略作修改，設(shè)計(jì)和合成 4 對(duì) GVA 特異性引物 QA1F/1R、 QA2F/2R、 QA3F/3R 和 QA4F/2R（表1），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。  表 1  GVA 實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR 引物序列  Table 1  Sequences of GVA primers used in RT-qPCR detection 引物名稱(chēng)  Primer name 目標(biāo)基因  Target gene 引物 /探針序列（ 5 3）  Primer/Probe sequence 產(chǎn)物大小 /bp Product size 參考文獻(xiàn)  Reference QA1F/1R CP F： CGACCGAAATATGTACCTGAATACTC 111 Osman & Rowhani， 2008 R： TTGCTAGCTTTAGGACCTACTATATCTACCT  本研究  This study QA2F/2R CP F： CGACCGAACTATGTACCTGAATACTC 100 Osman & Rowhani， 2008 R： AGGACCTACTATATCTACCTC  本研究  This study QA3F/3R CP F： CGACCGAAATATGTACCTGAACACTC 111 本研究  This study R： TTGCTAGCTTTAGGTCCTACTATATCTACCT  本研究  This study QA4F/2R CP F： CGACCGGAATATGTACCTGAATACTC 100 本研究  This study R： AGGACCTACTATATCTACCTC  本研究  This study 取葡萄相應(yīng)部位樣品 50 mg，采用吸附柱法（ MacKenzie et al.， 1997）進(jìn)行總 RNA 提取， 80 保存?zhèn)溆谩?采用兩種方法反轉(zhuǎn)錄：（ 1）普通反轉(zhuǎn)錄體系 25.0 L：將 5.0 L 總 RNA 與 1.0 L 0.1 g · L-1隨機(jī)引物和 9.0 L 水混合， 95 變性 5 min 后立即置于冰中冷卻 2 min；加入 5.0 L 5× MLV-RT buffer、 1.25 L 10 mmol · L-1dNTPs、 0.5 L 200 U · L-1M-MLV 和 3.25 L DEPC 水，經(jīng) 37  10 min、42  50 min、 70  5 min 合成 cDNA；（ 2）去除基因組 DNA 反轉(zhuǎn)錄（ PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser， Takara）：取 5× gDNA Eraser buffer 2.0 L， gDNA Eraser 1.0 L，總 RNA 1.0 L混勻， 42.0  2 min；加入以下混合液： PrimeScript RT Enzyme Mix  1.0 L， RT Primer Mix 1.0 L，5× PrimeScript buffer 2 4.0 L， RNase Free dH2O 4.0 L； 37  15 min， 85  5 s， 20 保存?zhèn)溆谩? 分別采用常規(guī) RT-PCR 和 RT-qPCR 對(duì) 4 對(duì)引物進(jìn)行擴(kuò)增和篩選。以普通反轉(zhuǎn)錄合成的 cDNA為模板進(jìn)行常規(guī) RT-PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系 25 µL，反應(yīng)條件： 94  5 min， 94  30 s， 55  20 s，72  20 s， 35 個(gè)循環(huán)后， 72 延伸 7 min。 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用 1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。相同模板同時(shí)用于 RT-qPCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系 25 L，含 2× SYBR Green qPCR Mix 12.5 L， 10 mol · L-1正、反向引物各 0.5 L， DNase/RNase Free dH2O 10.5 L 和 cDNA 1 L。反應(yīng)條件： 95 預(yù)變性 3 min，Ren Fang， Dong Yafeng， Zhang Zunping， Fan Xudong， Hu Guojun. Development and application of a quantitative RT-PCR approach for detection of Grapevine virus A. 2246                                                                   Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (11)： 2243 2253. 95  15 s， 60 15 s， 72  20 s， 40 個(gè)循環(huán)，在延伸步驟記錄熒光信號(hào)。 RT-qPCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線(xiàn)分析溫度范圍為 60 95 ，其中每 5 s 增加溫度 0.5 ，以鑒別引物二聚體和非特異性擴(kuò)增。以擴(kuò)增曲線(xiàn) Cq 值（擴(kuò)增產(chǎn)物熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)） < 30 且熔解曲線(xiàn)為單一峰判定為陽(yáng)性。以去除基因組 DNA 反轉(zhuǎn)錄合成的 cDNA 10 倍梯度稀釋為模板進(jìn)行RT-qPCR 擴(kuò)增，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，每個(gè)梯度設(shè)置 3 個(gè)重復(fù)。  PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物膠回收純化后與 pTOPO-TA Vector 連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5 感受態(tài)細(xì)胞，挑取白色菌落進(jìn)行菌液培養(yǎng)， PCR 鑒定篩選陽(yáng)性克隆，將陽(yáng)性克隆送北京諾賽基因組研究中心進(jìn)行測(cè)序。采用 NCBI BLAST 方法比較所得序列與 GenBank 已登錄分離物的同源性。  1.3  實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR 反應(yīng)體系優(yōu)化及驗(yàn)證  1.3.1  反應(yīng)體系優(yōu)化以去除基因組 DNA 反轉(zhuǎn)錄合成的 cDNA 1 × 10-1稀釋作為模板，用不同退火溫度（ 50.0、 50.8、52.4、 54.7、 57.6、 60.0、 61.3 和 62.0 ）進(jìn)行 RT-qPCR 擴(kuò)增，根據(jù) Cq 值和擴(kuò)增效果選擇確定最佳退火溫度；在最佳退火溫度下，分別采用不同引物濃度（ 100、 200、 300、 400 和 500 nmol · L-1）進(jìn)行 RT-qPCR 擴(kuò)增，根據(jù) Cq 值和擴(kuò)增效果選擇確定最佳引物濃度。  1.3.2  特異性檢測(cè) 從本實(shí)驗(yàn)室毒源保存圃采集分別感染了 GVA、葡萄病毒 B（ Grapevine virus B， GVB）、葡萄病毒 E（ Grapevine virus E， GVE）、萄卷葉伴隨病毒 GLRaV-1、 GLRaV-2、 GLRaV-3、 GLRaV-4、 GLRaV-7、葡萄斑點(diǎn)病毒（ Grapevine fleck virus， GFKV）和沙地葡萄莖痘病毒（ Grapevine rupestris stem pitting associated virus， GRSPaV）的葡萄樣品，提取總 RNA，采用普通反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，用于 RT-qPCR特異性檢測(cè)，以健康無(wú)毒植株樣品作陰性對(duì)照。  1.3.3  靈敏度比較以普通反轉(zhuǎn)錄合成的 cDNA 10 倍梯度稀釋?zhuān)?1 10-9）為模板，進(jìn)行常規(guī) RT-PCR 和 RT-qPCR檢測(cè)，比較檢測(cè)靈敏度。  1.3.4  重復(fù)性試驗(yàn) 從同一 GVA 帶毒植株同一枝條上分別取 3 份樣品作為生物學(xué)重復(fù)，以相同方法同時(shí)提取總RNA，以去除基因組 DNA 反轉(zhuǎn)錄合成的 cDNA 1 × 10-2稀釋為模板進(jìn)行 RT-qPCR 擴(kuò)增，每份樣品 3次重復(fù)。分別計(jì)算每份樣品組內(nèi)重復(fù)以及 3 份樣品組間重復(fù)的平均 Cq 值和 Cq 值標(biāo)準(zhǔn)差（ SD）和變異系數(shù)（ CV， % = 標(biāo)準(zhǔn)差 /平均 Cq 值  × 100）。  1.4  田間樣品檢測(cè)  1.4.1  不同季節(jié)和不同部位葡萄樣品檢測(cè) 選擇前期經(jīng) ELISA 或常規(guī) RT-PCR 檢測(cè) GVA 為陽(yáng)性的 10 株田間葡萄植株，分別在 5 月（春）、7 月（夏）、 9 月（秋）采集植株上部嫩葉、上部嫩葉柄、下部老葉、下部老葉柄和卷須 5 個(gè)部位樣品， 11 月（冬）采集休眠枝條，同時(shí)采集健康無(wú)毒植株樣品作陰性對(duì)照。所有樣品采用普通反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，用于常規(guī) RT-PCR 和 RT-qPCR，比較檢測(cè)效果。  1.4.2  大量田間葡萄樣品檢測(cè) 根據(jù)不同季節(jié)和不同部位葡萄樣品的檢測(cè)效果， 2016 2017 年采集大量田間葡萄樣品相應(yīng)部位，分別采用常規(guī) RT-PCR 和 RT-qPCR 檢測(cè) GVA，比較檢測(cè)效果。  任   芳，董雅鳳，張尊平，范旭東，胡國(guó)君 . 葡萄病毒 A 實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR 檢測(cè)技術(shù)的建立及應(yīng)用 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (11)： 2243 2253.                                                                                  2247 2  結(jié)果與分析  2.1  引物設(shè)計(jì)與篩選  選擇前期經(jīng) ELISA 或常規(guī) RT-PCR 檢測(cè) GVA 為陽(yáng)性的 5 個(gè)葡萄樣品，以健康無(wú)毒的葡萄樣品作為陰性對(duì)照，分別進(jìn)行常規(guī) RT-PCR 和 RT-qPCR 擴(kuò)增。 4 對(duì)引物均在 5 個(gè)陽(yáng)性樣品中擴(kuò)增到目的條帶，陰性對(duì)照和水對(duì)照沒(méi)有條帶，但引物 QA3F/3R 有 1 個(gè)樣品，引物 QA4F/2R 所有樣品的目的條帶較弱，引物 QA1F/1R 和 QA2F/2R 所有目的條帶明亮且均為單一目的條帶，擴(kuò)增效果較好（圖1）。  4 對(duì)引物 5 個(gè)陽(yáng)性樣品 RT-qPCR 擴(kuò)增曲線(xiàn) Cq 值均小于 30，熔解曲線(xiàn)均為單一峰，判定為陽(yáng)性。但引物 QA4F/2R 擴(kuò)增陰性對(duì)照和水對(duì)照也有明顯擴(kuò)增曲線(xiàn)且熔解曲線(xiàn)有峰，表明該引物有非特異性擴(kuò)增，因此只選擇引物 QA1F/1R、 QA2F/2R 和 QA3F/3R 進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)構(gòu)建。  3 對(duì)引物在 1 10-5稀釋梯度范圍內(nèi)擴(kuò)增曲線(xiàn)呈梯度分布， QA1F/1R 擴(kuò)增效率（ E）為 112.5%，決定系數(shù)（ R2） = 0.990，擴(kuò)增效率過(guò)高，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)相關(guān)性略差； QA2F/2R 的擴(kuò)增效率為 99.2%， R2 = 0.999，均達(dá)到統(tǒng)計(jì)分析要求； QA3F/3R 的擴(kuò)增效率為 103.7%， R2 = 0.981，決定系數(shù)過(guò)低，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)相關(guān)性較差。   綜合 RT-PCR、 RT-qPCR 擴(kuò)增以及標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)分析結(jié)果，選擇擴(kuò)增效果和相關(guān)性均最好的 QA2F/2R作為 GVA RT-qPCR 檢測(cè)引物。  圖 1  GVA 引物 QA1F/1R 和 QA2F/2R RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果比較  M： DL2000； W：清水對(duì)照； 1 5： GVA 陽(yáng)性的葡萄樣品； CK-：陰性對(duì)照。  Fig. 1  Comparison of RT-PCR amplification of GVA primers QA1F/1R and QA2F/2R  M： DL2000； W： Water control；  1 5： GVA positive grapevine samples； CK-： Negative control. 2.2  克隆鑒定  采用引物 QA2F/2R 對(duì)秋蜜葡萄進(jìn)行 RT-PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)克隆測(cè)序共獲得 6 個(gè)克隆序列，其中 5 個(gè)克隆序列完全一致，經(jīng) NCBI BLAST 比對(duì)，與 GenBank 已登錄 GVA 序列相似性較高，達(dá) 94% 99%，表明擴(kuò)增片段正確，為 GVA 目的片段（圖 2）。  Ren Fang， Dong Yafeng， Zhang Zunping， Fan Xudong， Hu Guojun. Development and application of a quantitative RT-PCR approach for detection of Grapevine virus A. 2248                                                                   Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (11)： 2243 2253. 圖 2  GVA 不同分離物核苷酸序列比較  QM1 QM6：本研究獲得 GVA 序列；其余為 GenBank 已登錄 GVA 序列。  Fig. 2  Sequence alignment of various GVA isolates QM1 QM6： GVA sequences obtained in this study； The others are GVA sequences logined in GenBank. 2.3  實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR 反應(yīng)體系優(yōu)化  退火溫度梯度 50.0 62.0 的 RT-qPCR 擴(kuò)增 Cq 值為 23.26 24.04，不同溫度間 Cq 值差異較小，僅 0.78，不到一個(gè)循環(huán)周期，其中退火溫度 60.0 時(shí) Cq 值最小，為 23.26。 54.7 時(shí)相對(duì)熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，其次為 60.0 ，熔解曲線(xiàn)為單一峰，因此選擇 60.0 作為最終退火溫度。隨著引物濃度升高， Cq 值逐漸減小，相對(duì)熒光強(qiáng)度逐漸增加，到達(dá)最高濃度（ 500 nmol · L-1）時(shí)， Cq 值最低，為 22.19，但相對(duì)熒光強(qiáng)度不再增強(qiáng)，與 300 nmol · L-1的相對(duì)熒光強(qiáng)度接近；在擴(kuò)增陰性對(duì)照和水對(duì)照時(shí)， 100 和 200 nmol · L-1引物濃度沒(méi)有明顯擴(kuò)增曲線(xiàn)，熔解曲線(xiàn)也沒(méi)有擴(kuò)增峰，但 300、 400和 500 nmol · L-1濃度時(shí)具有與陽(yáng)性樣品相近的雜峰。因此，為避免非特異擴(kuò)增，選擇擴(kuò)增效果較好、相對(duì)較低的引物濃度 200 nmol · L-1作為最終引物濃度。  2.4  實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR 反應(yīng)體系驗(yàn)證  2.4.1  特異性檢測(cè) 用本研究建立的 RT-qPCR 方法檢測(cè)分別感染了 GVA、 GVB、 GVE、 GFLV、 GLRaV-1、 GLRaV-2、任   芳，董雅鳳，張尊平，范旭東，胡國(guó)君 . 葡萄病毒 A 實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR 檢測(cè)技術(shù)的建立及應(yīng)用 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (11)： 2243 2253.                                                                                  2249 GLRaV-3、 GLRaV-4、 GLRaV-7、 GFKV 和 GRSPaV 等病毒的葡萄樣品以及陰性對(duì)照葡萄樣品，只有感染 GVA 樣品有擴(kuò)增曲線(xiàn)， Cq 值為 21.59，其余樣品均沒(méi)有明顯擴(kuò)增曲線(xiàn)，與陰性對(duì)照擴(kuò)增結(jié)果相近（圖 3），表明該 RT-qPCR 方法可特異性檢測(cè) GVA。  圖 3  RT-qPCR 特異性檢測(cè)  Fig. 3  The specificity test of RT-qPCR 2.4.2  靈敏度比較常規(guī) RT-PCR 能檢測(cè)到 1 × 10-2稀釋梯度的 GVA 陽(yáng)性葡萄樣品 cDNA（圖 4）。 RT-qPCR 檢測(cè)各稀釋梯度模板擴(kuò)增曲線(xiàn)呈梯度分布，檢測(cè) 1 × 10-4稀釋梯度時(shí) Cq 值仍小于 30（圖 5），為陽(yáng)性，表明本研究中 RT-qPCR 檢測(cè)靈敏度可達(dá)常規(guī) RT-PCR 的 100 倍。  圖 4  不同稀釋梯度葡萄樣品常規(guī) RT-PCR 檢測(cè)靈敏度  Fig. 4  Sensitivity of RT-PCR detection of grapevine samples at different diluted gradient 圖 5  不同稀釋梯度葡萄樣品 RT-qPCR 檢測(cè)靈敏度  Fig. 5  Sensitivity of RT-qPCR detection of grapevine samples at different diluted gradient 2.4.3  重復(fù)性試驗(yàn) 根據(jù) RT-qPCR 擴(kuò)增 Cq 值數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，同一枝條上 3 份樣品組內(nèi)重復(fù)的變異系數(shù)最大Ren Fang， Dong Yafeng， Zhang Zunping， Fan Xudong， Hu Guojun. Development and application of a quantitative RT-PCR approach for detection of Grapevine virus A. 2250                                                                   Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (11)： 2243 2253. 為 0.31%，組間重復(fù)變異系數(shù)為 2.91%（表 2），表明該方法具有較好的重復(fù)性，檢測(cè)穩(wěn)定性好。  表 2  重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果  Table 2  The result of reproducibility 重復(fù)類(lèi)型  Repeat type 重復(fù)組編號(hào)  Number of repeat group Cq 平均值  Mean Cq value 標(biāo)準(zhǔn)差  SD 變異系數(shù) /% CV 組內(nèi)重復(fù) Reproducibility test of intra-assay 1 26.99 0.05 0.19 2 25.71 0.08 0.31 3 25.63 0.04 0.16 組間重復(fù) Reproducibility test of extra-assay 26.11 0.76 2.91 2.5  田間樣品檢測(cè)  2.5.1  不同季節(jié)和不同部位葡萄樣品檢測(cè) 從 10 株感染 GVA 的葡萄上分別采集春、夏、秋 3 個(gè)季節(jié)的嫩葉、嫩葉柄、老葉、老葉柄和卷須 5 個(gè)部位樣品以及冬季休眠枝條，共 160 個(gè)樣品，分別采用常規(guī) RT-PCR 和 RT-qPCR 進(jìn)行 GVA檢測(cè)。結(jié)果（表 3）表明， RT-qPCR 對(duì)各季節(jié)和部位樣品的檢出率普遍高于常規(guī) RT-PCR。不同季節(jié)比較， RT-qPCR 冬季檢出率 100%，比常規(guī) RT-PCR 高 10%，秋季僅嫩葉檢出率略低（ 50%），其余 4 個(gè)部位檢出率均達(dá) 100%，比常規(guī) RT-PCR 高 10% 80%，春夏季檢出率 10% 100%，比常規(guī)RT-PCR 高 10% 40%。不同部位比較，枝條和老葉柄樣品檢測(cè)效果最好， RT-qPCR 檢測(cè)春、夏、  表 3  不同季節(jié)和不同部位葡萄樣品常規(guī) RT-PCR 和 qRT-PCR 檢測(cè)結(jié)果  Table 3  RT-PCR and qRT-PCR detection of samples collected from different seasons and different positions of grapevine 方法  Method 品種  Cultivar 春 Spring  夏 Summer  秋 Autumn 冬季枝條Dormant branch of winter A B C D E  A B C D E  A B C D E RT-PCR 巨玫瑰 Jumeigui - + + + +  - - + + -  - + + + -  + 紅雙味 -1 Hongshuangwei-1 - + + + -  - + + + +  + - + + -  + 庫(kù)特賽塔 Kutesata + + + + +  - - + + +  + + + + +  + 紅繭 Hongjian - - - - -  - - - - -  - - - - -  + 紅雙味 -2 Hongshuangwei-2 - - + + +  - - + + -  + + + + -  + 黑拉查基 Helachaj - - - - -  - - - - -  - - - - -  - 大寶 Taiho - + + + -  - + + + -  - + + + -  + 烏茲別克玫瑰  Muscat Uzbekistan  - + - + - - - - + +- + - + - + 寧夏蛇龍珠 Ningxia  Cabernet Gernischet - - + + - - - + + - - + - + - + 秋蜜 Qiumi - - + + +  - + - + -  + + + + +  + 檢出率 /% Detection rate 10 50 70 80 40  0 30 60 80 30  40 70 60 80 20  90 RT-qPCR 巨玫瑰 Jumeigui - + + + +  - - + + -  + + + + +  + 紅雙味 Hongshuangwei - + + + +  - + + + +  - + + + +  + 庫(kù)特賽塔 Kutesata - + + + +  - + + + +  + + + + +  + 紅繭 Hongjian - - + + -  - + + + -  + + + + +  + 紅雙味 Hongshuangwei - - + + +  - - + + -  - + + + +  + 黑拉查基 Helachaj - - + + -  - + + + -  + + + + +  + 大寶 Taiho + - - + -  - + - + -  - + + + +  + 烏茲別克玫瑰  Muscat Uzbekistan  - + - + + + + + + + + 寧夏蛇龍珠 Ningxia  Cabernet Gernischet + - + + - - +- + + + + + 秋蜜 Qiumi - - + + +  - - - + -  - + + + +  + 檢出率 /% Detection rate 20 40 80 100 60  10 70 80 100 40  50 100 100 100 100  100 注： A：嫩葉； B：嫩葉柄； C：老葉； D：老葉柄； E：卷須。  Note： A： Young leaf； B： Young petiole； C： Old leaf； D： Old petiole； E： Tendril. 任   芳，董雅鳳，張尊平，范旭東，胡國(guó)君 . 葡萄病毒 A 實(shí)時(shí)熒光定量 RT-PCR 檢測(cè)技術(shù)的建立及應(yīng)用 . 園藝學(xué)報(bào)， 2018， 45 (11)： 2243 2253.      </p>

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