植物黃酮醇生物合成及其調(diào)控研究進(jìn)展.pdf
<p>園藝學(xué)報， 2018， 45 (1)： 177 192. Acta Horticulturae Sinica doi： 10.16420/j.issn.0513-353x.2017-0306； http： /www. ahs. ac. cn 177 收稿日期 ： 2017 09 20； 修回日期 ： 2017 11 17 基金項目 ： 國家 863課題（ 2013AA102606） ；國家重點研發(fā)計劃項目（ 2016YFD0400106） * 通信作者 Author for correspondence（ E-mail： xianlizju.edu.cn） 植物黃酮醇生物合成及其調(diào)控研究進(jìn)展 曹運琳，邢夢云，徐昌杰，李 鮮*（浙江大學(xué)園藝系，浙江省園藝植物整合生物學(xué)研究與應(yīng)用重點實驗室，杭州 310058） 摘 要： 植物黃酮醇具有廣泛生物活性，其生物合成及其調(diào)控研究日益增多，逐漸成為熱點。對黃酮醇生物合成關(guān)鍵酶（ FLS、 F3H、 F3H、 F35H、 UGT）和調(diào)控因子（如 MYB 等轉(zhuǎn)錄因子）相關(guān)的生化與分子生物學(xué)研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)，重點對相關(guān)結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)錄因子對黃酮醇積累發(fā)揮關(guān)鍵作用的試驗證據(jù)進(jìn)行歸納，探索調(diào)控黃酮醇物質(zhì)積累的有效途徑及靶標(biāo)分子，以期為利用基因工程定向積累具有重要生物學(xué)功能的黃酮醇物質(zhì)提供參考。 關(guān)鍵詞： 黃酮醇；生物合成；代謝調(diào)控；分子機(jī)制；基因工程 中圖分類號： S 601； Q 946 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號： 0513-353X（ 2018） 01-0177-16 Biosynthesis of Flavonol and Its Regulation in Plants CAO Yunlin， XING Mengyun， XU Changjie， and LI Xian*（ Department of Horticulture， Zhejiang Provincial Key Laboratory of Horticultural Plant Integrative Biology， Zhejiang University， Hangzhou 310058， China） Abstract： Flavonol has a wide range of biological activities and studies on biosynthesis and regulation of flavonol in plant attract more attention. Here， research progress in key enzymes（ FLS， F3H，F(xiàn)3H， F35H， UGT） and regulatory factors（ e.g. MYB transcription factors） in flavonol biosynthetic pathway were summarized from biochemical and molecular biological points of view. Important evidence illustrating key structure genes or regulatory factors playing critical roles in flavonol biosynthesis are emphasized， which may result in efficient regulation of target molecules and accumulation of flavonol compounds with important biological functions via genetic engineering. Keywords： flavonol； biosynthesis； regulation； molecular mechanism； genetic engineering 黃酮醇是類黃酮化合物中的一類，通常以糖苷衍生物形式存在于植物液泡中。黃酮醇苷元多達(dá)十余種，其中園藝產(chǎn)品中常見的苷元主要是槲皮素、山柰酚和楊梅素等，它們的配糖體主要是以葡萄糖、半乳糖、鼠李糖等組成的單糖、二糖或多糖。由于糖基種類、數(shù)量和連接位置的不同，黃酮醇糖苷衍生物種類很多，目前已鑒定有 200 余種山柰酚糖苷（ Crozier et al.， 2009） 。近些年，大量研究報道了黃酮醇抗氧化，抗腫瘤，預(yù)防心血管疾病和糖尿病，保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)，消炎等醫(yī)藥學(xué)活性（ Wang et al.， 2008； Perez-Vizcaino & Duarte， 2010； Dajas， 2012； Valentová et al.， 2014； Devi et al.， 2015） 。黃酮醇廣泛存在于植物根、莖、葉、花、果實和種子中，對植物生長發(fā)育和抵抗逆境等 Cao Yunlin， Xing Mengyun， Xu Changjie， Li Xian. Biosynthesis of flavonol and its regulation in plants. 178 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (1)： 177 192. 發(fā)揮著重要作用，包括調(diào)控生長素轉(zhuǎn)運、促進(jìn)側(cè)根形成、影響花粉發(fā)育、抗紫外線、調(diào)節(jié)葉片氣孔開度等（ Stracke et al.， 2010； Falcone Ferreyra et al.， 2012b；劉龍博 等， 2016； Silva-Navas et al.，2016） 。因此，植物黃酮醇生物合成與代謝調(diào)控研究日益增多，逐漸成為熱點。 研究表明，黃酮醇物質(zhì)組成及含量與植物種類、品種、組織部位、發(fā)育階段以及生長環(huán)境等因素有關(guān)（張瓊 等， 2008； Koyama et al.， 2012； Neugart et al.， 2012；方芳和王鳳忠， 2016） 。近年來，不同植物積累特異黃酮醇的關(guān)鍵酶及調(diào)控因子已在擬南芥、矮牽牛、蘋果、柑橘等重要模式植物或園藝植物中取得較多進(jìn)展（ Falcone Ferreyra et al.， 2012b； Liu et al.， 2016； Wang et al.， 2017） 。然而，有關(guān)黃酮醇生物合成的分子機(jī)理及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的分子機(jī)制等研究進(jìn)展缺乏系統(tǒng)總結(jié)與比較。 對黃酮醇生物合成關(guān)鍵酶和調(diào)控因子相關(guān)的生化與分子生物學(xué)研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)，重點對相關(guān)結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)錄因子對黃酮醇積累發(fā)揮關(guān)鍵作用的試驗證據(jù)進(jìn)行歸納，探索調(diào)控黃酮醇物質(zhì)積累的有效途徑及靶標(biāo)分子，以期為利用基因工程定向積累具有重要生物學(xué)功能的黃酮醇物質(zhì)提供參考。 1 黃酮醇生物合成關(guān)鍵酶 黃酮醇生物合成是類黃酮化合物代謝途徑的一個分支， 4香豆酰 CoA 和丙二酰 CoA 在查耳酮合成酶（ CHS）催化下產(chǎn)生柚皮素查耳酮，之后在查耳酮異構(gòu)酶（ CHI）催化下被特異地環(huán)化形成柚皮素，柚皮素在一種或多種黃烷酮羥化酶（ F3H）或類黃酮羥化酶（類黃酮 3羥化酶， F3H和類黃酮 3,5羥化酶， F35H）催化下產(chǎn)生不同的二氫黃酮醇，例如二氫山柰酚、二氫槲皮素、二氫楊梅素等。一方面，二氫黃酮醇可以在黃酮醇合成酶（ FLS）催化下氧化形成黃酮醇苷元，之后在尿苷二磷酸糖基轉(zhuǎn)移酶（ UGTs）催化下發(fā)生糖基化等修飾，形成穩(wěn)定多樣的黃酮醇衍生物；另一方面，二氫黃酮醇也可以在二氫黃酮醇還原酶（ DFR）催化下產(chǎn)生無色花青素，最終形成花青苷和原花青素（圖 1， Winkel-Shirley， 2001） 。因此， FLS、 F3H、 F3H 和 F35H、 UGT 等是催化黃酮醇生物合成的關(guān)鍵酶。 1.1 FLS FLS（ EC 1.14.11.23）屬于 Fe /2酮戊二酸鹽依賴性雙加氧酶家族，在 2酮戊二酸鹽（ 2-oxoglutarate）和氧氣存在的條件下，它催化二氫黃酮醇發(fā)生去飽和反應(yīng)，生成黃酮醇、琥珀酸鹽、二氧化碳和水。 FLS 酶活性最初報道于輻射處理過的歐芹（ Petroselinum hortense）懸浮細(xì)胞（ Britsch et al.， 1981） ，隨后在紫羅蘭（ Matthiola incana）和矮牽牛（ Petunia hybrida）等植物提取物的酶活性研究中發(fā)現(xiàn)， FLS 酶活性依賴酮戊二酸、亞鐵離子和抗壞血酸等輔助因子，其活性最適pH 6.5 7.0，受 EDTA 抑制（ Spribille & Forkmann， 1984； Forkmann et al.， 1986） 。對醋栗（ Ribes uva-crispa） 、酸櫻桃（ Prunus cerasus） 、覆盆子（ Rubus idaeus）等果實研究表明：未成熟果實中 FLS酶活性均高于成熟果實，這與未成熟果實中較高的黃酮醇含量一致（ Halbwirth et al.， 2009） 。 首條 FLS 的 cDNA 序列從矮牽牛中克隆得到，反義表達(dá)該基因顯著減少花瓣中黃酮醇含量，花著色顯著增強(qiáng)（ Holton et al.， 1993a） 。此后，更多的 FLS 基因在不同植物組織中被克隆鑒定。溫州蜜柑（ Citrus unshiu） CitFLS 的表達(dá)受發(fā)育調(diào)控，在幼葉中的表達(dá)高于老葉，幼果中的表達(dá)高于成熟果實， 這與溫州蜜柑組織中黃酮醇的積累規(guī)律相吻合 （ Moriguchi et al.， 2002） 。 葡萄 （ Vitis vinifera）中 5 個 FLS 基因在花芽和花中均有表達(dá)，但只有 VvFLS4 和 VvFLS5 在幼果和成熟果實中表達(dá)，其中 VvFLS4 的表達(dá)受光照調(diào)控（ Fujita et al.， 2006） 。擬南芥（ Arabidopsis thaliana）有 6 個 AtFLS 成曹運琳，邢夢云，徐昌杰，李 鮮 . 植物黃酮醇生物合成及其調(diào)控研究進(jìn)展 . 園藝學(xué)報， 2018， 45 (1)： 177 192. 179 員，其中 AtFLSl 蛋白催化活性最強(qiáng)（ Owens et al.， 2008a） 。煙草（ Nicotiana tabacum）兩個 NtFLSs均在葉片中有較高水平表達(dá)，在莖和花中低量表達(dá)，在根中幾乎不表達(dá)，轉(zhuǎn)反義 NtFLSs 基因的煙草植株槲皮素含量下降 25% 93%（ Mahajan et al.， 2011， 2012） 。玉米（ Zea mays） ZmFLS1 和ZmFLS2 的表達(dá)均受 UV-B 誘導(dǎo)， 在擬南芥 fls1 突變體中過量表達(dá) ZmFLS1 能部分恢復(fù)其黃酮醇缺失造成的表型（ Falcone Ferreyra et al.， 2010， 2012a） 。苦蕎麥（ Fagopyrum tataricum） FtFLS1 表達(dá)受外源 ABA、水楊酸（ SA） 、 NaCl 等處理抑制，而 FtFLS2 表達(dá)受 SA 和 NaCl 處理誘導(dǎo)（ Li et al.，2013a） 。 圖 1 植物黃酮醇生物合成途徑簡圖 （ Winkel-Shirley， 2001） PAL：苯丙氨酸解氨酶； C4H：肉桂酸 4羥化酶； 4CL：對香豆酰 CoA 連接酶； CHS：查耳酮合成酶； CHI：查耳酮異構(gòu)酶； F3H：黃烷酮 3羥化酶； F3H：黃烷酮 3羥化酶； F35H：黃烷酮 35羥化酶； FLS：黃酮醇合成酶； DFR：二氫黃酮醇還原酶； ANS：花青素合成酶； ANR：花青素還原酶； UGT： UDP糖基轉(zhuǎn)移酶。 Fig. 1 Biosynthetic pathway of flavonol in plants （ Winkel-Shirley， 2001） PAL： Phenylalanine ammonia lyase； C4H： Cinnamate-4-hydroxylase； 4CL： 4-Coumaryl-CoA ligase； CHS： Chalcone synthase； CHI： Chalcone isomerase； F3H： Flavanone 3-hydroxylase； F3H： Flavonoid 3-hydroxylase； F35H： Flavonoid 3,5-hydroxylase； FLS： Flavonol synthase； DFR： Dihydroflavonol 4-reductase； ANS： Anthocyanidin synthase； ANR： Anthocyanidin reductase； UGT： Uridine diphosphate-dependent glycosyltransferase. Cao Yunlin， Xing Mengyun， Xu Changjie， Li Xian. Biosynthesis of flavonol and its regulation in plants. 180 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (1)： 177 192. 不同植物來源或不同 FLS 家族成員編碼的蛋白酶活性和底物偏好性差異顯著。通過大腸桿菌表達(dá)得到的 AtFLSl 重組蛋白對二氫山柰酚具有較高底物親和性（ Km = 59 mol · L-1） （ Wisman et al.，1998； Owens et al.， 2008a） 。類似的，溫州蜜柑 FLS 蛋白對二氫山柰酚有較高的底物親和力（ Km = 45 mol · L-1） ，而對二氫槲皮素親和性較低（ Km = 272 mol · L-1） （ Wellmann et al.， 2002） 。通過酵母得到的蘋果（ Malus domestica） MdFLS 蛋白則對二氫槲皮素（ Km = 1.2 mol · L-1）和二氫山柰酚（ Km = 1 mol · L-1）的親和性基本一致（ Halbwirth et al.， 2006） 。玉米 ZmFLSl 蛋白則對二氫槲皮素有更高的底物親和性 （ Km = 58.4 mol · L-1） ， 而對二氫山柰酚的親和性較低 （ Km = 151.1 mol · L-1）（ Falcone Ferreyra et al.， 2010） 。同樣的，苦蕎麥 FtFLSl（ Li et al.， 2013a） 、茶（ Camellia sinensis）CsFLS（ Lin et al.， 2007）和大豆（ Glycine max） GmFLS1（ Takahashi et al.， 2007）均對二氫槲皮素有更高的底物偏好性。此外，部分 FLSs，如溫州蜜柑 FLS、擬南芥 AtFLS1 和銀杏（ Ginkgo biloba）GbFLS 還可以直接以柚皮素作為底物， 催化系列反應(yīng)生成黃酮醇 （ Lukacin et al.， 2003； Owens et al.，2008a； Xu et al.， 2012） ?？梢?，不同 FLS 在底物偏好性和催化活性方面的差異是黃酮醇種類多樣和含量差異的重要原因。 同源或異源轉(zhuǎn)基因工作進(jìn)一步驗證了不同植物 FLS 的基因功能。 轉(zhuǎn)反義 FLS 基因的矮牽牛中黃酮醇含量顯著降低，花色比野生型更紅（ Holton et al.， 1993a） 。擬南芥 fls1 突變體中山柰酚含量顯著降低，但槲皮素含量基本不變，說明擬南芥中存在其他有功能的 FLS 成員（ Wisman et al.， 1998；Owens et al.， 2008a） 。在擬南芥 fls1 突變體中分別過量表達(dá)玉米 ZmFLS1（ Falcone Ferreyra et al.，2010）和油菜（ Brassica napobrassica） BnFLS（ Vu et al.， 2015） ，均可顯著增加 fls1 中黃酮醇含量。利用 RNAi 技術(shù)在煙草中沉默 NtFLS，其轉(zhuǎn)基因植株中黃酮醇含量下降 25% 93%，而兒茶素、表兒茶素和表沒食子兒茶素等含量增加（ Mahajan et al.， 2011） 。利用瞬時表達(dá)體系，在 Royalty海棠 （ Malus crabapple） 中過量表達(dá) McFLS， 注射部位黃酮醇含量顯著上升， 花青苷含量顯著下降 （ Tian et al.， 2015） 。在煙草中過量表達(dá)玫瑰（ Rosa rugosa） RrFLS1、桃（ Prunus persica） PpFLS 或矮牽牛 PhFLS，均會促進(jìn)花中黃酮醇積累并抑制花青苷合成（ Luo et al.， 2016） 。因此， FLS 的基因表達(dá)、酶活性和底物偏好性等關(guān)系到黃酮醇合成支路對代謝流的競爭能力，影響著該支路代謝流的強(qiáng)弱，調(diào)控著不同黃酮醇的組成與含量。 1.2 F3H F3H（ EC 1.14.11.9）也屬于 Fe /2酮戊二酸鹽依賴性雙加氧酶家族，催化黃烷酮在 C-3 位置羥基化，合成二氫黃酮醇，它們是合成黃酮醇、花青苷和原花色素的共同前體（ Britsch & Grisebach，1986； Lukacin et al.， 2000a） ；由于黃烷酮同時也是合成 3脫氧類黃酮和黃酮的前體物質(zhì)， F3H 會與合成 3脫氧類黃酮和黃酮的酶競爭底物（ Martens & Mithöfer， 2005） 。百日菊（ Zinnia elagans）等 f3h 突變體花色為白色，植株中幾乎檢測不到黃酮醇和花青苷，而積累更多芹菜素和木犀草素等黃酮（ Forkmann & Stotz， 1984） 。因此， F3H 的底物偏好性及酶活性對于類黃酮化合物代謝途徑不同分支的流量分配也發(fā)揮著重要作用。 F3H 酶活性及純化鑒定最初報道于矮牽牛，其催化的反應(yīng)同樣需要氧氣、 2酮戊二酸鹽、 Fe2+和抗壞血酸鹽作為輔助因子，它能催化（ 2S） 柚皮素和（ 2S） 圣草酚分別生成（ +） （ 2R, 3R） 二氫山柰酚和（ 2R, 3R） 二氫槲皮素（ Britsch & Grisebach， 1986） 。首個 F3H 基因從金魚草（ Antirrhinurn majus）中克隆得到，之后相繼從矮牽牛、蘋果、西洋梨（ Pyrus communis）和擬南芥等植物中分離鑒定更多 F3H 基因 （ Martin et al.， 1991； Pelletier & Shirley， 1996； Owens et al.， 2008b） 。 曹運琳，邢夢云，徐昌杰，李 鮮 . 植物黃酮醇生物合成及其調(diào)控研究進(jìn)展 . 園藝學(xué)報， 2018， 45 (1)： 177 192. 181 重組蛋白研究表明：不同 F3H 具有不同的底物偏好性。矮牽牛 PhF3H 蛋白大約 41.5 kD，能催化（） 柚皮素生成（ +） 二氫山柰酚（ Britsch et al.， 1992） ，其中 His220、 Ar222 和 Ser290 等位點對酶活性起關(guān)鍵作用（ Lukacin & Britsch， 1997； Lukacin et al.， 2000b） 。蘋果和西洋梨 F3H 均能以（ 2S） 柚皮素和（ 2S） 圣草酚為底物催化生成相應(yīng)二氫黃酮醇（ Halbwirth et al.， 2006） 。而 茶 F3H具有更廣泛的催化活性， （ 2S） 柚皮素、 （ 2S） 圣草酚和（ 2S） 五羥基黃烷酮均可作為它的底物，催化生成相應(yīng)的二氫黃酮醇（ Punyasiri et al.， 2004） 。 1.3 F3H 與 F35H F3H（ EC 1.14.13.21）與 F35H（ EC 1.14.13.88）分別催化類黃酮化合物 B 環(huán) 3位置或者 3和 5位置羥基化，從而合成不同羥基化程度的黃烷酮、二氫黃酮醇和黃酮醇等（ Winkel-Shirley， 2001） 。F3H 和 F35H 均屬于細(xì)胞色素 P450 亞家族，它們催化依賴 NADPH 和 O2的單加氧反應(yīng)，決定了類黃酮化合物 B 環(huán)的羥基化模式（ Holton et al.， 1993b； Brugliera et al.， 1999） 。 F3H 基因首次從矮牽牛中被分離鑒定（ Brugliera et al.， 1999） ，此后相繼在擬南芥（ Schoenbohm et al.， 2000） 、大豆（ Toda et al.， 2005） 、葡萄（ Bogs et al.， 2006） 、蘋果（ Han et al.， 2010） 、箭葉淫羊藿 （ Epimedium sagittatum）（ Huang et al.， 2012） 、 草莓 （ Fragaria × ananassa）（ Thill et al.， 2013） 、札里耳翠雀（ Delphinium zalil） （ Miyahara et al.， 2016）等植物中分離鑒定了 F3H 基因，其中在蘋果中分離得到 3 個 F3H 拷貝，而其他物種中均只分離得到 1 個拷貝。目前 F35H 基因在矮牽牛（ Holton et al.， 1993b） 、三花龍膽（ Gentiana triflora） （ Tanaka et al.， 1996） ，洋桔梗（ Eustoma grandiflorum） （ Nielsen & Podivinsky， 1997） ， 長春花 （ Catharanthus roseus） （ Kaltenbach et al.， 1999） ，葡萄（ Bogs et al.， 2006） 、番茄（ Solanum lycopersicum） （ Olsen et al.， 2010） 、箭葉淫羊藿（ Huang et al.， 2012） 、豌豆（ Pisum sativum） （ Moreau et al.， 2012） 、瓜葉菊（ Pericallis × hybrida） （ Sun et al.，2013） 、茶（ Wang et al.， 2014）等植物中被分離鑒定。 F3H 和 F35H 表達(dá)強(qiáng)弱決定了不同羥基化程度的黃酮醇物質(zhì)組成與含量。在矮牽牛 ht1 突變體中異源表達(dá)葡萄 VvF3H，轉(zhuǎn)基因植株花中主要黃酮醇由山柰酚變?yōu)殚纹に?（ Bogs et al.， 2006） 。 在煙草或者擬南芥中分別過量表達(dá)蘋果 MdF3HI和 MdF3HIIb，轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗和煙草花中槲皮素含量均顯著增加，山柰酚含量顯著降低（ Han et al.， 2010） 。因此，通過基因工程調(diào)控 F3'H 和 F3'5'H 表達(dá)是改變不同黃酮醇組成和含量的有效途徑。 1.4 UGTs UGTs（ EC 2.4.1.17）位于植物細(xì)胞質(zhì)中，是一類催化植物化學(xué)物質(zhì)糖基化反應(yīng)的酶。部分 UGTs可以特異地催化黃酮醇糖基化，對于黃酮醇轉(zhuǎn)運、在液泡中儲存及發(fā)揮生物學(xué)功能至關(guān)重要（ Li et al.， 2001； Bowles et al.， 2006） 。 矮牽牛 F3GalTase蛋白能催化黃酮醇苷元和 UDP半乳糖合成黃酮醇 3 O半乳糖苷 （ Miller et al.， 1999） 。在擬南芥中， UGT78D1 蛋白催化槲皮素或山柰酚在 3 OH 位置發(fā)生 UDP鼠李糖的轉(zhuǎn)移； UGT78D3 蛋白則負(fù)責(zé) UDP阿拉伯糖基的轉(zhuǎn)移，因此， UGT78D1 和 UGT78D3 被分別鑒定為黃酮醇 3 O鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶和黃酮醇 3 O阿拉伯糖基轉(zhuǎn)移酶（ Jones et al.， 2003；Yonekura-Sakakibara et al.， 2008） 。 葡萄 VvGT5（ Ono et al.， 2010） 、 茶 CsUGT78A14 和 CsUGT78A15（ Cui et al.， 2016）以及百脈根（ Lotus japonicus） UGT72AD1（ Yin et al.， 2017）被分別鑒定為黃酮醇 3 O葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶、黃酮醇 3 O葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶、黃酮醇 3 O半乳糖基轉(zhuǎn) Cao Yunlin， Xing Mengyun， Xu Changjie， Li Xian. Biosynthesis of flavonol and its regulation in plants. 182 Acta Horticulturae Sinica， 2018， 45 (1)： 177 192. 移酶、黃酮醇 3 O鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶，它們能特異識別不同黃酮醇苷元和不同 UDP糖基，催化合成相應(yīng)黃酮醇糖苷。草莓 FaGT6 可以在更多羥基位置上發(fā)揮糖基化催化活性，如它能催化合成槲皮素 3 O葡萄糖苷， 7 O葡萄糖苷， 4 O葡萄糖苷和 3 O葡萄糖苷； FaGT7 則能催化合成槲皮素 3 O葡萄糖苷和槲皮素 4 O葡萄糖苷（ Griesser et al.， 2008） 。 部分 UGTs 能特異識別黃酮醇單糖苷并催化其在 7 OH 等位置發(fā)生進(jìn)一步糖基化， 合成黃酮醇二糖苷等衍生物。 擬南芥 UGT73C6 蛋白能催化槲皮素 3 O鼠李糖苷或山柰酚 3 O鼠李糖苷進(jìn)一步發(fā)生 UDP葡萄糖的轉(zhuǎn)移（ Jones et al.， 2003） ； UGT89C1 和 UGT79B6 蛋白能將山柰酚 3O葡萄糖苷分別轉(zhuǎn)換為山柰酚 3 O葡萄糖苷 7 O鼠李糖苷和山柰酚 3 O葡萄糖基（ 1 2）葡萄糖苷（ Yonekura-Sakakibara et al.， 2007， 2014） 。在擬南芥中過量表達(dá)番紅花（ Crocus sativus） UGT707B1 基因，與對照組植株相比，轉(zhuǎn)基因植株中檢測到一種新的化合物：山柰酚 3O槐糖苷 7 O鼠李糖苷（ Trapero et al.， 2012） 。 2 植物黃酮醇生物合成的基因調(diào)控 多項研究表明，黃酮醇生物合成受 MYB、 bHLH、 WD40 等單一或多個轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體的調(diào)控（ Tohge et al.， 2005） 。 擬南芥 AtMYB12 或 AtMYB111 均能獨立地激活黃酮醇合成相關(guān)基因如 CHS、 CHI、 F3H 和 FLS的表達(dá)。 AtMYB12 和 AtMYB111 的表達(dá)具有組織特異性， AtMYB12 主要調(diào)控根中黃酮醇合成，而AtMYB111 在子葉中轉(zhuǎn)錄活性最高（ Mehrtens et al.， 2005； Stracke et al.， 2007； Luo et al.， 2008） 。葡萄 VvMYB5a 和 VvMYBF1 均可作為激活子調(diào)控黃酮醇合成，在擬南芥 myb12 突變體中過量表達(dá)VvMYBF1 可以恢復(fù)其根中黃酮醇含量 （ Deluc et al.， 2006； Czemmel et al.， 2009） 。 三花龍膽 GtMYBP3和 GtMYBP4 均可激活黃酮醇合成相關(guān)基因表達(dá)，將它們在擬南芥中過量表達(dá)可顯著提高幼苗中黃酮醇含量（ Nakatsuka et al.， 2012） 。箭葉淫羊藿 EsMYBF1 可以激活 EsF3H 和 EsFLS 啟動子，在煙草中過量表達(dá) EsMYBF1，其花中黃酮醇合成相關(guān)基因如 CHS、 CHI、 F3H、 F3H 和 FLS 等表達(dá)顯著增強(qiáng)，黃酮醇含量顯著增加，而花青苷含量下降（ Huang et al.， 2016） 。煙草雙熒光素酶和酵母單雜實驗表明，柑橘 CsMYBF1 能結(jié)合并激活 Cs4CL、 CsCHS 和 CsFLS 啟動子；利用 RNAi 技術(shù)，在柑橘愈傷組織中抑制 CsMYBF1 可顯著降低黃酮醇含量（ Liu et al.， 2016） 。蘋果 MdMYB22 能直接結(jié)合 FLS 啟動子進(jìn)而激活黃酮醇合成通路， 在蘋果愈傷組織和擬南芥 AtMYB12/111/11 突變體中過量表達(dá) MdMYB22， 可以誘導(dǎo)黃酮醇積累 （ Wang et al.， 2017） 。 最近研究發(fā)現(xiàn)， 白梨 （ Pyrus bretschneideri）PbMYB9 可以結(jié)合 PbUFGT1 啟動子，誘導(dǎo)黃酮醇積累（ Zhai et al.， 2016） 。 值得指出的是，作為另一類類黃酮物質(zhì)，花青苷的生物合成也受 MYB、 bHLH、 WD40 調(diào)控，但所涉及的具體 MYB 成員有所不同。以擬南芥為例，上文已述， MYB12 以及 MYB111 調(diào)控黃酮醇合成，而調(diào)控花青苷合成的 MYBs 主要為 MYBA、 MYB1、 MYB10、 MYB110、 MYB75（ PAP1）和 MYB90（ PAP2）等（劉曉芬 等， 2013） 。 除了作為激活子， MYB 也可能作為抑制子參與黃酮醇生物合成的調(diào)控。在煙草中過量表達(dá)草莓 R2R3 型 MYB 抑制子 FaMYB1， 會抑制黃酮醇積累， 同時也抑制花青苷積累 （ Aharoni et al.， 2001） 。在擬南芥中過量表達(dá)大豆 GmMYB100 基因，其轉(zhuǎn)基因植株黃酮醇含量顯著降低（ Yan et al.， 2015） 。 除了 MYB 外，其他轉(zhuǎn)錄因子參與黃酮醇生物合成的調(diào)控也陸續(xù)見報道。玉米 R2R3 型 MYB 轉(zhuǎn)錄因子 C1 和 bHLH 轉(zhuǎn)錄因子 LC 需要通過形成 MYB-bHLH 轉(zhuǎn)錄復(fù)合體來調(diào)控黃酮醇合成，在番茄曹運琳，邢夢云，徐昌杰，李 鮮 . 植物黃酮醇生物合成及其調(diào)控研究進(jìn)展 . 園藝學(xué)報， 2018， 45 (1)： 177 192. 183 中同時過量表達(dá) C1 和 LC 能提高果實山柰酚含量，而 C1 或 LC 單個轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)基因植株卻不能顯著提高黃酮醇含量 （ Bovy et al.， 2002） 。 擬南芥中屬于 bHLH 轉(zhuǎn)錄因子家族的 TCP3 能與 AtMYB12和 AtMYB111 進(jìn)行蛋白互作，轉(zhuǎn)基因 mTCP3 植株黃酮醇含量改變顯著（ Li & Zachgo， 2013） 。在擬南芥中通過功能缺失和過量表達(dá) AtWRKY23 基因，發(fā)現(xiàn) AtWRKY23 能特異誘導(dǎo)根部黃酮醇合成，并調(diào)控根的生長發(fā)育（ Grunewald et al.， 2012） 。葡萄 bZIP 家族轉(zhuǎn)錄因子 VvibZIPC22 也參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控黃酮醇合成相關(guān)基因，在煙草中過量表達(dá) VvibZIPC22 可誘導(dǎo) NtPAL、 NtCHS 和 NtFLS 表達(dá)，從而提高花中黃酮醇含量（ Malacarne et al.， 2016） 。 因此，不同轉(zhuǎn)錄因子對黃酮醇生物合成有不同的調(diào)控模式，可能是植物適應(yīng)不同生長發(fā)育及環(huán)境變化的需要。 3 植物黃酮醇代謝的外部調(diào)控因素 3.1 光照 3.1.1 光強(qiáng) 由于黃酮醇物質(zhì)是植物抵御強(qiáng)光的重要次生代謝物質(zhì)，不同光強(qiáng)或光質(zhì)的光照處理對黃酮醇生物合成有重要影響。 不同果樹遮光試驗結(jié)果表明，果實中黃酮醇含量隨著光照強(qiáng)度增加而增加。在 Merlot 、 Pinot Noir 、 Cabernet Sauvignon和 Pione等多個葡萄品種中的研究發(fā)現(xiàn)：太陽光直接照射下生長的果實，果皮總黃酮醇含量顯著高于遮光條件下生長的果實（ Cortell & Kennedy， 2006； Fujita et al.，2006； Matus et al.， 2009； Azuma et al.， 2012； Koyama et al.， 2012） 。光照處理顯著誘導(dǎo)了葡萄果皮中 VvCHS2、 VvCHS3、 VvCHI1、 VvF3H2、 VvF35H、 VvFLS4 和 VvMYBF1 等基因表達(dá) （ Czemmel et al.， 2009； Azuma et al.， 2012） ；而遮光處理顯著抑制調(diào)控黃酮醇合成的 VvMYB12 的表達(dá)（ Matus et al.， 2009） 。類似的，暴露在太陽光下生長的 Aroma 、 Jonamac 、 Fortune和 Mutsu等蘋果果皮中黃酮醇含量顯著高于遮光條件下果實中的含量（ Feng et al.， 2013； Li et al.， 2013b） 。 將普通女貞（ Ligustrum vulgare）植株分別放置在 6%（遮光） 、 35%（中等太陽光）和 100%（太陽光） 日光照射下處理 8 周， 隨著光照強(qiáng)度增強(qiáng)， 葉片中槲皮素 3 O蕓香糖苷含量逐漸升高 （ Tattini et al.， 2004） 。以青錢柳（ Cyclocarya paliurus）為材料，設(shè)置 15%、 50%、 100%日光照射處理 3 個月，隨著光照強(qiáng)度增強(qiáng)，葉片中異槲皮苷、山柰酚和槲皮素含量升高（ Deng et al.， 2012） 。高光強(qiáng)（日光 1 400 mol · m-2· s-1）下長春花（ Catharanthus roseus）葉片中槲皮素 3 O（ 2,6二 O鼠李糖基）半乳糖苷、山柰酚 3 O （ 2,6二 O鼠李糖基）半乳糖苷、山柰酚 3 O （ 2,6二 O鼠李糖基）半乳糖基 7 O己糖苷含量分別比低光強(qiáng)（熒光燈 100 mol · m-2· s-1）增加了 9.8 倍， 88 倍和 1.6 倍，且部分黃酮醇僅在高光強(qiáng)處理葉片中檢測到，如異鼠李素 3 O （ 2,6二 O鼠李糖基） 半乳糖苷 （ Ferreres et al.， 2011） 。 采用 400 mol · m-2· s-1強(qiáng)光和 100 mol · m-2· s-1弱光分別處理 Sabellica羽衣甘藍(lán)（ Brassica oleracea）植株 12 周后發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)光組葉片中總黃酮醇含量比弱光組高出 24.8%，槲皮素 3 O芥子酰基槐糖苷 7 O D葡萄糖苷、槲皮素 3 O槐糖苷 7 O D葡萄糖苷和槲皮素 3 O咖啡?；碧擒?7 O D葡萄糖苷等含量均顯著高于弱光組（ Neugart et al.， 2016） 。 Cao Yunlin， Xing Mengyun， Xu Changjie， Li Xian. Biosynthesis of flavonol and its regulation in plants. 184 </p>
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